Summary
हम एक infiltrative बढ़ते मध्यम के रूप में perfluorodecalin का उपयोग का वर्णन करता है. इस इमेजिंग की गहराई में सुधार के लिए एक सरल तरीका है
Protocol
नीचे दिए गए प्रोटोकॉल Arabidopsis thaliana पत्तियों में एक infiltrative बढ़ते मध्यम के रूप में PFD का उपयोग करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन है, लेकिन हम आशा करते हैं कि इस विधि का आवेदन कहाँ इमेजिंग हवा - अमीर ऊतकों वांछित है की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है.
1. बढ़ते PFD में पत्ता नमूने
- Polydimethylsiloxane की एक गैस पारगम्य गैसकेट (PDMS, कैरोलिना अवलोकन जेल) के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड तैयार करें. PDMS viscoelastic बहुलक है और एक प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप चैम्बर प्रदान ढाला जा सकता है है.
- हवा के साथ PFD समभार बनाना. यह हवा के साथ बुदबुदाती या एक हवा से भरे बोतल में PFD की एक छोटी मात्रा मिलाते द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
- निथारना एक खुला पेट्री डिश में PFD और एक पूरी अंकुर या 5 मिनट के लिए PFD पर excised पत्ता नाव. ऊतक पारदर्शी, vitrified ऊतक की याद ताजा (चित्रा 2 (एक)) बन जाना चाहिए. पत्तियां गहरे या जोखिम से पहले की तुलना में हल्का PFD, depen प्रकट हो सकता हैडिंग प्रकाश व्यवस्था की स्थिति और ऊतकों की उम्र पर इस्तेमाल किया.
- हवा equilibrated PFD के साथ PDMS चैम्बर भरें और ध्यान से ऊष्मायन पेट्री डिश से ऊतकों के नमूनों PDMS कक्ष को हस्तांतरण. प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार एक coverslip और छवि के साथ स्लाइड सील.
- नोट: PFD भी एक खुला coverslip पर निर्माण चैम्बर में या एक छिड़काव कक्ष में अच्छी तरह से करता है और सिलिकॉन तेल के साथ संगत है. PFD Teflon घटकों के साथ संगत है के रूप में यह उन्हें घुल नहीं है.
2. प्रतिनिधि परिणाम:
PFD incubated पत्ता नमूनों की सूक्ष्म निरीक्षण से पता चलता है कि airspaces के बहुमत भर रहे हैं चित्रा 2 (ख) पुनः संयोजक PFD में निलंबित GFP के साथ बाढ़ आ गई airspaces से पता चलता है. यह स्पष्ट है कि पत्ता PFD के साथ ऊष्मायन पर बाढ़ आ गई है, लेकिन हवा की है कि कभी कभी जेब रह सकता है. इन शर्तों के तहत जल पत्ता बाढ़ नहीं करता है. नमूनों की LSCM incubated और एक मुहिम शुरू की IR, पानी या PFD से पता चलता है कि PFD इमेजिंग के संभव गहराई में पानी और हवा (चित्रा 3) एक से अधिक लाभ देता है . चित्रा 3 में दिए गए उदाहरण से पता चलता है हवा, पानी और PFD घुड़सवार Arabidopsis cytosolically स्थानीयकृत वीनस, 11 YFP का एक संस्करण है कि रचनात्मक रूप में 35S प्रमोटर के तहत व्यक्त की है व्यक्त पत्ते है. हम इमेजिंग की गहराई में एक अनुमानित 2 गुना वृद्धि देखने के लिए जब PFD और पानी की तुलना कर सकते हैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए तथापि, कि सटीक सुधार देखा जब PFD का उपयोग कर लेंस और ऊतक के प्रकार प्रयोग किया जाता के संख्यात्मक एपर्चर के साथ बदलता रहता है. हम cytoplasmic स्ट्रीमिंग और PFD इलाज seedlings में जड़ बाल बढ़ाव, स्वस्थ पौधों में से प्रत्येक के संकेत देखा है. इसके अलावा हम 2 से पता चला है कि Fv / एफएम, 12 पौधों की संश्लेषक कामकाज का एक उपाय इमेजिंग में इस्तेमाल timescales पर सहनीय सीमा के भीतर रहता है .
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चित्रा 1. संयंत्र पत्ती जटिलता और ऑप्टिकल निहितार्थ
Diagrammatical ए के संरचनात्मक सुविधाओं के दिखा प्रतिनिधित्व thaliana पत्ता ऑप्टिकल सेट अप के संबंध में. इस्तेमाल किया लघुरूप obj हैं. = उद्देश्य लेंस, imm. = विसर्जन द्रव, cov. = Coverslip, mnt. = Mountant, कटौती. = छल्ली, विज्ञापन. ep. = मध्यतल की ओर epidermis, सेंट. = Stomatal ताकना, सपा. = चिमड़ा पर्णमध्यक, के रूप में = वायु अंतरिक्ष, दोस्त. = कटघरा पर्णमध्यक, vb विज्ञापन = संवहनी बंडल. ep. = मध्यतल की ओर epidermis. सेल दीवारों काली रेखाओं द्वारा संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 2. PFD आसानी Arabidopsis पत्तियों को प्रवेश
(क) हवा, पानी में incubated पत्तियां या 5 मिनट के लिए PFD और Leica MZ16F खुर्दबीन (Leica माइक्रोसिस्टम्स लिमिटेड (ब्रिटेन), मिल्टन कीन्स, ब्रिटेन) के साथ एक Leica DCF3000FX डिजिटल कैमरे का उपयोग कर imaged. जौव लोगो एसीटेट फिल्म पर छपा था और fro प्रबुद्धनीचे एक प्रकाश बॉक्स के साथ हूँ. एक्सपोज़र समय एमएस 89 किया गया था और सभी छवियों को एकत्र और हूबहू संसाधित थे. स्केल सलाखों 2 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं.
(ख) ले जाने PFD शुद्ध पुनः संयोजक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) vivo में airspaces delimits. GFP झूठी रंग हरा है, और लाल ऑटो प्रतिदीप्ति, जो पर्णमध्यक कोशिकाओं delimits क्लोरोफिल को दिखाने के लिए प्रयोग किया जाता है. (चित्रा 2 (ख) की अनुमति और पूर्ण तकनीकी Littlejohn एट अल में उपलब्ध जानकारी के साथ reproduced 2 2010) . स्केल सलाखों 25 मीटर का प्रतिनिधित्व करते हैं
चित्रा 3. PFD पत्तियों में confocal इमेजिंग में सुधार
LSCM cytoplasmically स्थानीयकृत वीनस (हरा) प्रतिदीप्ति और क्लोरोफिल autofluorescence (लाल) बरकरार ए thaliana में दिखा छवियों हवा, पानी या PFD में imaged छोड़ देता है. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 514 एनएम और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 518 एनएम पर दर्ज की गई थी वीनस के लिए 604 एनएम और 657 एनएम परक्लोरोप्लास्ट के लिए 679 एनएम. प्रत्येक पैनल एक एकल confocal 11 confocal 5 सुक्ष्ममापी अंतराल पर अधिग्रहीत छवियों की जेड - ढेर से लिया अनुभाग है. 1 सुक्ष्ममापी अंतराल, जो पूरक फिल्मों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है पर 59 अधिग्रहीत छवियों का एक पूर्ण Z-ढेर से निकाले गए थे. गहराई माप epidermal सतह के सापेक्ष दिए गए हैं. प्रतिनिधि छवियों, जो हूबहू प्रोसेस किया गया दिखाए जाते हैं. खुर्दबीन सेटिंग्स के रूप में प्रायोगिक जानकारी Littlejohn एट अल 2010, 2 में पाए जाने वाले के समान हैं. Scalebars 20 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करते हैं.
Discussion
यह एक सरल और आसान उपयोग करने के लिए हवा भरा या ऑप्टिकली जटिल ऊतकों के माइक्रोस्कोपी में सुधार के लिए तकनीक है. हम पता चला है कि तकनीक कुछ मजबूत लाभ है और हमें आशा है कि यह जैविक ऊतकों को हवा अमीर संबंधित सवालों को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. उदाहरण के लिए यह संयंत्र पर्णमध्यक में या फेफड़ों में रोगज़नक़ हमले के अध्ययन के लिए एक प्राकृतिक पसंद होगा. हम भी तकनीक की सीमाओं के बारे में पता कर रहे हैं. हम बेहतर अपवर्तक सूचकांक मिलान पर काम कर रहे हैं, माइक्रोस्कोपी के अन्य साधनों, लंबी timescale के प्रयोगों के दौरान और perfluorocarbon mountant पुनःपूर्ति के साथ उपयोग करें. हम यह भी समझते हैं, हालांकि, कि एक PFCS का मुख्य लाभ के, अर्थात् जा रहा है जैविक निष्क्रिय एक दूसरा पहलू है. PFCS आसानी से जो भी संकेत मिलता है कि वे आसानी से हार्मोन, दवाओं, और अन्य छोटे अणुओं या आयनों के रूप में ब्याज की यौगिकों देने नहीं इस्तेमाल किया जा सकता है जैविक अणुओं भंग नहीं करते हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उनकी सलाह और एक्षेतेर Bioimaging सुविधा के विश्वविद्यालय के लिए एक्षेतेर विश्वविद्यालय के प्रो. निकोलस Smirnoff धन्यवाद देना चाहूंगा. अनुदान ब्रिटेन जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद (अनुदान BB/E002682/1 संदर्भ) के द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
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