Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Summary

L'isolement et la culture d'une population pure de cellules satellites quiescentes, une population de cellules souches musculaires, est essentielle à la compréhension de muscle tige de la biologie cellulaire et la régénération, ainsi que la transplantation de cellules souches pour des thérapies dans la dystrophie musculaire et d'autres maladies dégénératives.

Abstract

Cellules musculaires satellites sont une population de cellules souches requis pour le développement du muscle squelettique et de la régénération post-natal, ce qui représente 2 à 5% des noyaux sublaminal dans les fibres musculaires. Dans le muscle adulte, les cellules satellites sont normalement mitotique repos. Après une lésion, cependant, les cellules satellites initier la prolifération cellulaire pour produire des myoblastes, leurs descendants, de médiation de la régénération du muscle. La transplantation de myoblastes dérivés des cellules satellites a été largement étudiée comme traitement possible pour plusieurs maladies régénératrices y compris la dystrophie musculaire, l'insuffisance cardiaque et de dysfonction urologique. Transplantation de myoblastes dans le muscle dystrophique squelettique, cardiaque infarctus, et dysfonctionnement des canaux urinaires a montré que les myoblastes greffés peuvent se différencier en fibres musculaires dans les tissus de l'hôte et afficher une amélioration fonctionnelle partielle dans ces maladies. Par conséquent, le développement de procédés de purification efficace de cellules satellites quiescentes de MUSCL squelettiquee, ainsi que la mise en place de satellites cultures de myoblastes dérivés des cellules et des méthodes de transplantation de myoblastes pour, sont essentielles pour comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine satellite cellule auto-renouvellement, l'activation et la différenciation. En outre, le développement de thérapies à base de cellules pour la dystrophie musculaire et d'autres maladies de régénération sont également tributaires de ces facteurs.

Cependant, les procédés de purification éventuels courants de cellules satellites quiescentes nécessitent l'utilisation de coûteux tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de la machine. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour la purification rapide, économique et fiable des cellules satellites de repos de la souris adulte muscle squelettique par dissociation enzymatique suivie par cellule magnétique-trieur (MACS). Après isolement des cellules satellites quiescentes pures, ces cellules peuvent être cultivées afin d'obtenir un grand nombre de myoblastes après plusieurs passages. Ces fraîchement isolécellules satellites quiescentes ou ex vivo des myoblastes élargis peuvent être transplantées dans cardiotoxine (CTX) induite par la régénération du muscle squelettique de souris pour examiner la contribution des cellules dérivées du donneur à la régénération des fibres musculaires, ainsi que de compartiments cellulaires par satellite pour l'examen de l'auto-renouvellement activités.

Introduction

Cellules musculaires satellites sont une petite population de cellules souches myogéniques situés sous la lame basale des fibres musculaires squelettiques. Ils sont caractérisés par l'expression de Pax7, Pax3, c-Met, M-cadhérine, CD34, Syndecan-3, et la calcitonine ^{de 1 – 3.} Les cellules satellites sont révélés être responsable de la régénération du muscle en tant que cellules souches musculaires. Dans le muscle adulte, les cellules satellites sont normalement mitotique repos ^4-8. Après une lésion, les cellules satellites sont activées, lancer expression de MyoD, et entrer dans le cycle cellulaire pour élargir leur progéniture, appelé cellules précurseurs myogéniques ou myoblastes ^3. Après plusieurs cycles de division cellulaire, les myoblastes sortent du cycle cellulaire et fusible à l'autre, afin de subir une différenciation en myotubes multi-nucléées, suivis par les fibres musculaires matures. Myoblastes isolés à partir de tissus musculaires adultes peuvent facilement être étendues ex vivo. La capacité de myoblastes pour devenir les fibres musculaires dans la régénération musculaire et àforme extra-utérines fibres musculaires dans les tissus non musculaires est exploitée par la transplantation de myoblastes, une approche thérapeutique potentielle pour la myopathie de Duchenne (DMD) ^4, le dysfonctionnement urologique ^9, et l'insuffisance cardiaque ^10. En effet, les myoblastes ont été transplantés avec succès dans le muscle des deux mdx (modèle DMD) des souris et des patients atteints de DMD ^11-14. Les myoblastes normaux injectés fusionnent avec les fibres musculaires de l'hôte pour améliorer l'histologie et la fonction du muscle malade. Des travaux antérieurs ont démontré que des sous-populations de myoblastes sont plus cellule souche analogue et restent dans un état ​​indifférencié plus dans le muscle pendant la régénération du muscle ^5. Des travaux récents ont montré que les cellules satellites du muscle fraîchement isolés adulte contiennent une population de cellules souches ressemblant que présente la prise de greffe plus efficace et l'activité d'auto-renouvellement dans la régénération musculaire ^5-8. Par conséquent, la purification d'une population pure de cellules satellites quiescentes de mu squelettique adultesclérose est essentielle pour la compréhension de la biologie des cellules satellites, les myoblastes et la régénération musculaire, et pour le développement de thérapies à base de cellules.

Cependant, les procédés de purification éventuels courants de cellules satellites quiescentes nécessitent l'utilisation d'un tri cellulaire activé par fluorescence chère (FACS) Machine ^1,2,6-8. En outre, l'exposition au laser FACS a tendance à induire la mort cellulaire au cours de la séparation, ce qui entraîne un rendement plus faible des cellules satellites quiescentes ^15. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour la purification rapide, économique et fiable des cellules satellites de repos du muscle squelettique de souris adulte. Cette méthode utilise la dissociation enzymatique suivie par cellule magnétique-trieur (MACS). Après isolement des cellules satellites quiescentes pures, ces cellules peuvent être cultivées afin d'obtenir un grand nombre de myoblastes après plusieurs passages. Nous montrons également que l'injection intramusculaire de ces cellules satellites quiescentes fraîchement isolés ou ex vimyoblastes vo étendues peuvent être transplantées dans cardiotoxine (CTX) induit la régénération du muscle squelettique de souris pour examiner la contribution des cellules dérivées du donneur à la régénération des fibres musculaires, ainsi que des compartiments cellulaires par satellite pour l'examen des activités d'auto-renouvellement.

Protocol

Les animaux ont été logés dans un environnement SPF et ont été suivis par la recherche des ressources animales (RAR) de l'Université du Minnesota. . Les animaux ont été euthanasiés par des moyens appropriés (inhalation de CO 2 ou d'injection de KCl après avoir été anesthésiés avec une injection IP de Avertin (250 mg / kg) Tous les protocoles ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC, le numéro de code: 1304-30492 ) de l'Université du Minnesota. 1. Isolement des cellules mononucléaires du muscle squelettique de souris Sacrifier bien 1 ou 2 jeunes souris adultes (3-8 semaines). Pincez et fendre la peau de l'abdomen avec des ciseaux pointus. Décoller la peau pour montrer complètement les triceps et les muscles des membres postérieurs (tirer la peau dans des directions opposées). Retirez tous les muscles des jambes squelettiques (tibial antérieur, jumeau, et quadriceps) et les triceps le long des os avec des ciseaux. Puis transfert muscles à glacé, PBS stérile dans une plaque de 10 cm. Laver sang de muscles dans du PBS et les muscles de transfert à un nouveau stérile 6 cm plaque: 1 plaque de 1-2 souris. Retirer le tissu conjonctif, les vaisseaux sanguins, les faisceaux de nerfs, et le tissu adipogénique sous un microscope à dissection. Avec des ciseaux pour l'ophtalmologie, couper et émincer le tissu en une pâte lisse (Figures 1A et 1B). Essayez de ne pas laisser de gros morceaux, car ils ne seront pas décomposés facilement par la solution d'enzyme. Transfert muscles hachées dans un tube Falcon 50 ml, et ajouter 5 ml de solution de collagénase (0,2% de collagénase de type 2 dans 10% de FBS dans DMEM). Incuber à 37 ° C pendant 60 min. Triturer (de haut en bas avec une aiguille de calibre 18) pour homogénéiser le mélange (figure 1C). Puis incuber en outre le mélange à 37 ° C pendant 15 min. On triture à nouveau pour homogénéiser le mélange à se dissocier en suspension de cellules individuelles. Ajouter 2% de FBS dans du DMEM à 50 ml dans la suspension de cellules isolées et mélangerbien. Placez un tamis cellulaire (70 um) sur un tube de Falcon 50 ml (figure 1D). Transférer le surnageant contenant les cellules dissociées sur un tamis cellulaire, et la pipette la suspension de cellules de haut en bas sur le filtre jusqu'à ce qu'il passe à travers. Compter le nombre de cellules par hématimètre. Centrifuger les tubes à 2000 rpm à 4 ° C pendant 5 min; aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension avec 10 ml de 2% de FBS dans du DMEM. Centrifuger les tubes à 2000 rpm à 4 ° C pendant 5 min; aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension avec 200 ul de 2% de FBS dans du DMEM et du transfert cellulaire suspension dans 1,5 ml microtubes. Habituellement, environ 2 x 10 6 cellules doivent être récoltées à partir de muscles de souris 1. Les cellules sont diluées à une concentration de 1 x 10 6 cellules dans 100 ul de 2% de FBS dans du DMEM. 2. Anticorps coloration et la séparation avec MACS Au cours de la pr suivanteocedures, maintenir des conditions stériles à l'aide de tampons stériles. Chaque volume d'anticorps ajouté et le milieu de suspension cellulaire est calculée pour les cellules de muscles entiers d'une souris. Si les cellules sont récoltées à partir de deux ou plus des souris, la quantité de réactifs doit être optimisée. Ajouter 1 pi de chacun de CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, et de l'intégrine α7 anticorps dans 200 pi de la suspension cellulaire. Incuber sur de la glace pendant 30 min. Laver les cellules: Après incubation, ajouter 1 ml de FBS à 2% dans du DMEM dans la suspension de cellules dans le tube de 1,5 ml, et centrifuger à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 min. Répétez cette étape deux fois. Aspirer et jeter le surnageant. Resuspendre les cellules avec 200 ul de 2% de FBS dans du DMEM, et ajouter 10 ul d'anti-PE billes magnétiques. Incuber sur de la glace pendant 30 min. Laver les cellules: Après incubation, ajouter 1 ml de tampon MACS à la suspension de cellules dans le tube de 1,5 ml, et puis centrifuger à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 min. Répétez cette étape twglace. Notez que les cellules doivent être lavés par tampon MACS avant d'être séparés par colonne magnétique. Aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 1,0 ml de tampon MACS. Mettre en place la colonne de LD sur une carte magnétique, et rincer la colonne avec 2,0 ml de tampon MACS (figure 1E). Transférer la suspension cellulaire sur la colonne de LD, et recueillir la fraction écoulement continu dans un tube de 1,5 ml. Cette fraction contient des cellules de PE-négatif. Centrifugeuse à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 minutes, aspirer et jeter le surnageant. Resuspendre les cellules avec 200 ul de 2% de FBS dans du DMEM, et ajouter 10 ul d'IgG anti-souris de perles magnétiques. Incuber sur de la glace pendant 30 min. Laver les cellules: Après incubation, ajouter 1 ml de tampon MACS dans la suspension de cellules dans 1,5 ml tube, puis centrifuger à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 min. Aspirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape deux fois. Remettre les cellules avec 500 pi de tampon MACS. Mettre en place la colonne MS sur une carte magnétique, et rincer la colonne avec 500 pi de tampon MACS (figure 1F). Transfert suspendu solution de cellules sur la colonne MS, et jetez la fraction de flux continu (cellules α7 négatif intégrines). Rincer avec 1 ml de tampon MACS, et répéter cette étape deux fois. Après rinçage, enlever la colonne du champ magnétique de séparateur. Appliquer 1,0 ml de tampon MACS dans la colonne et éluer les cellules magnétiquement marquées (cellules positives α7-intégrine) dans un tube de 1,5 ml en poussant le piston de la seringue à partir du sommet de la colonne. Recueillir le flux continu dans un tube de 1,5 ml. Répétez l'élution avec 1,5 ml de tampon MACS et recueillir le flux continu. Centrifugeuse à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 minutes, aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules purifiées avec 1 ml de milieu myoblastes (20% de FBS contenait Hams F-10 avec bFGF), et cellules de la plaque sur Matrigel revêtues de 10 cmplaque avec 8 ml de myoblastes moyen (5 ml à 6 cm) plaque (figure 1G). Notez que 1-2 x 10 5 cellules peuvent potentiellement être isolés à partir de souris 1 muscle intact. 3. Maintenance Nourrir les cellules tous les jours avec un milieu de myoblastes. L'apparition de myoblastes croissance est de petite et de forme ronde exprimant MyoD (Figure 2) et Pax7 (données non présentées) dans leur noyau. Myoblastes doivent être soumises à des passages avant de 50% de confluence ou lors du démarrage de la fusion cellulaire. Après rinçage une fois avec du PBS, incuber les cellules avec une solution de trypsine à 0,25% à 37 ° C pendant 3 min dans un incubateur à CO 2 et de recueillir des cellules dissociées avec du milieu de myoblastes. Après que les cellules de centrifugation (1000 rpm pendant 5 min), avec un milieu de suspendre myoblastes et Réensemencement cellules sur de nouvelles plaques enduites de Matrigel. des plaques revêtues de collagène peuvent être utilisés après le passage 3. Une plaque peut généralement être divisée en trois à cinq plaques. 4. Différenciation Réinsérez avec différenciation moyenne tous les deux jours. Le jour 1 en milieu de Différenciation, myoblastes sortent du cycle cellulaire et subissent une différenciation en chaîne lourde de myosine (MHC)-positif myocytes. Ces myoctyes commencent fusion cellulaire avec l'autre pour générer des myotubes multinucléés. En général, la plupart des myoblastes deviennent myocytes mononucléaires positives MHC-différenciation ou des myotubes (figure 2) par jour en 3-5 Différenciation Medium. 5. Transplantation de myoblastes dans la souris pour la régénération musculaire squelettique Anesthésier les souris avec Avertin (250 mg / kg) par voie intrapéritonéale (IP) d'injection. Raser les poils de la peau autour de jambier antérieur (TA) muscle. Vingt-quatre heures avant la transplantation de myoblastes, 10 uM CTX (50 ul) est injectée par voie intramusculaire dans la souris NOD / Scid muscle TA souris pour induire la régénération des muscles par l'intermédiaire d'une seringue de 31 U d'insuline à travers la peau rasée (Figure60, 3). Myoblastes en prolifération sont dissociées avec une solution de trypsine à 0,25%, et centrifugées à 1000 rpm pendant 5 min. Aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension à 1 x 10 6 cellules avec 50 ul de 2% de FBS dans du DMEM. Transférer les cellules en suspension dans un 31 G seringue à insuline. Les souris receveuses seront anesthésiés avec Avertin (250 mg / kg) par injection IP, et les 1 x 10 6 myoblastes (Figure 2) sont injectées par voie intramusculaire dans le muscle TA régénération. Récolte muscle TA par 1-4 semaines après l'injection des cellules pour l'analyse histologique (figure 3).

Representative Results

Cellules satellites quiescentes fraîchement isolés affichent une petite forme ronde (figure 1G), et Pax7 express comme marqueur définitif pour les cellules satellites de repos. Plus de 90% des cellules fraîchement isolées expriment Pax7 (Figure 1H et 1I). La plupart des cellules contaminées sont des cellules sanguines qui ne poussent pas efficacement in vitro suivant les conditions de culture de myoblastes. Par conséquent, des myoblastes dérivés de cel…

Discussion

Dans ce protocole, les cellules satellites quiescentes peuvent être facilement purifiés à partir de muscle squelettique de souris adultes, par digestion à la collagénase et de séparation MACS médiée par des anticorps de surface. Cette méthode prend environ 6 heures et ne nécessite pas d'équipement coûteux tel qu'une machine FACS. En outre, ce procédé est relativement peu coûteux par rapport à la surface médiée par les anticorps séparation FACS. On obtient un rendement plus élevé de cellules …

Materials

			Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18G needle with 12cc Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipet	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
			Reagents
Name of the reagent			Recipie
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C.
Myoblast medium			500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.