Abstract
Telomeraz, bir ribonükleoprotein, telomer uzunluğu muhafaza ve dolayısıyla genomik bütünlüğü, çoğalmasını ve ömrünü teşvik sorumludur. Nöronlar gibi mitotik olmayan, son derece aktif hücreler için hayatta kalan olası önemini göstermektedir, ilave olarak, telomeraz gibi oksidatif stresten mitokondri korur ve apoptoza direnç kazandırmaktadır. Daha önce çeşitli fare beyin bölgelerinde telomeraz aktivitesi ve ekspresyonunu artırmak ve oksidatif stres motor nöronlar hücreleri korumak için yeni telomeraz aktivatörlerinin yeteneğini gösterdi. Bu sonuçlar telomeraz çeşitli lezyonlar gelen nöronların korunması dahil olduğu görüşünü güçlendirmektedir. Beyinde telomeraz rolünü vurgulamak amacıyla, burada erkek ve dişi fare beyninde telomeraz aktivitesini ve yaş olan bağımlılığını karşılaştırın. TRAP yönteminin çeşitli dokular veya hücre hatlarında telomeraz aktivitesini tespit etmek için standart bir yöntemdir. Burada analı göstermekCHAPS kullanılarak protein çıkarımı ile denatüre edici olmayan fare beyninin üç bölgede telomeraz aktivitesi sis, standart TRAP modifikasyonu ile, ardından tampon lisis.
Bu 2-aşamalı bir deneyde, endojen telomeraz TTAGGG 6 bp'lik bir tekrar (telomeraz reaksiyonu) ekleyerek belirli bir alt-tabaka, telomeraz (TH primer) ilerlemektedir. Telomeraz reaksiyonu ürünleri 6 bp'lik fazlalıklarının bir DNA merdiveni oluşturarak bir PCR tepkimesi ile yükseltilir. DNA merdiveni analizi son derece hassas bir nükleik asit boyası ile boyandı, ardından% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel elektroforezi ile yapılır.
32P DNA tespiti ve DNA merdiveni çözülmesi için poliakrilamid jel elektroforez için radyoaktif dCTP etiketlenmiş kullanabilecektir geleneksel TRAP ile karşılaştırıldığında, bu protokol, fare beyninin telomeraz aktivitesini değerlendirmek yeteneğini göstermek için TRAP tasarruf toksik olmayan bir zaman sunar telomeras farklılıkları tespitÇeşitli dişi ve erkek fare beyin bölgesinde aktiviteye sahiptir.
Introduction
Telomeraz telomeraz bir ribonükleoprotein oluşan ters transkriptaz (TERT), telomeraz katalitik alt birimi, ve bir RNA bileşen (TERC) 'dir. Telomeraz kanonik rolü, bu nedenle genomik bütünlüğü ve hücre proliferasyonunu 1 teşvik telomerik uçlarına tekrar dizileri (TTAGGG) eklenerek telomerlerin uygun uzunluğunun korumaktır. Bu çeşitli zarar verici madde 2 ile uyarılan apoptoza karşı direnç kazandıran, yani başka roller de, hücrelerde TERT atfedilmiştir oksidatif stres 3 insan mezenkimal kök hücrelerini koruyan ve pozitif RNA TIA1 ile olan ilişkisi ile tam olarak farklılaşmış nöronların hayatta kalma yanlısı bir rol oynar granüller 4.
Enzim ekspresyonu ve aktivitesi düzeyleri sıkı Bölünmeyen hücreler 5,6 olarak düzenlenmiş olsa da, TERT, ifade edilen ve daha çok somatik bölünen hücreleri ve kanser tiplerinin çoğunda aktif bir biçimde gösterilmiştir. Çalışmalar r göstermiştirTERT mRNA, erişkin 7 içine daha düşük düzeyde muhafaza edilirken Odent beyin, telomeraz aktivitesi, doğum sonrası 10. günde fark edilemez hale gelecektir. Diğer çalışmalar yetişkin alt-ventriküler bölge, koku ampul, hipokampus içinde telomeraz aktivitesini gösterdi ve yetişkin beyincik ve kortekste 8. , Enjekte edilen fareler SOD1 transjenik amiyotrofik lateral skleroz hastalığının başlamasını ve ilerlemesini yavaşlattığı - Yakın zamanda beyin ve omurilik telomeraz ekspresyonunu ve aktivitesini de artırır yeni bileşikler, N-metil-D-aspartat (NMDA) nöro-koruyucu etkiler üretmiştir göstermiştir fare ve bu farelerin 9 omurilikteki motor nöronların hayatta kalma artmıştır. Tam nöronlarda ve beyinde telomeraz pro survival rolünü anlamak için, beynin farklı bölgelerinde telomeraz aktivitesinin tespit edilmesi için basit, hızlı ve nispeten hassas bir analiz geliştirmek için gereklidir.
Telomerik rEPEAT amplifıkasyon protokolü (TRAP) sıraları düzenlenmiştir telomeraz aktivitesi kanonik ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) birleştiren bir iyi bilinen hassas bir deneydir. Bu deneyde, telomeraz TTAGGG telomeraz substrata TH ters primeri kullanılarak 6 baz çifti (bp) DNA merdiveni oluşturur PCR amplifikasyonu takiben (TH astar) oligonükleotid, tekrar ekler -. ACX 32P dCTP etiketli en tespit etmek için kullanılır PCR ürünlerinin, düşük miktarda. DNA merdiveni dizileme poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözümlenir. Her iki DNA bantların yoğunluğu ve DNA merdiven uzunluğu, aktif enzim moleküllerinin miktarını ve işlem kapasitesi, sırasıyla 10 yansıtmaktadır.
Bu geleneksel tahlil bazı önemli zorluklar tutar: (gecede her iki durumda) sıralama PAGE ve jel çalışan zaman tüketimi ve radyoaktif ürünün filmi pozlama işlemek için büyük ve sert radyoaktif maddelere maruz kalma tehlikesi. Bu protokol, gelişmiş bir radyoaktif olmayan bir agaroz mini jel bazlı bir deney sağlar. DNA, 6 bp'lik bir basamağı% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak çözümlenir ve algılama son derece hassas bir nükleik asit leke kullanılarak başarılabilir. Agaroz mini yüksek çözünürlük jel ve duyarlı nükleik asit leke kullanılarak kombinasyonu, analizi kullanımı kolay sunar radyoaktiviteye maruz tehlikesini bertaraf eder ve önemli bir kaç saate kadar 3 gün genel deney süresini kısaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri Ben-Gurion Üniversitesi'nde (IL-39-08-2010) hayvan deneyleri için etik kurul tarafından onaylandı.
1. Fare Beyin Protein Ekstraksiyonu
- Her bir buz üzerinde 5 mi Ringer çözeltisi ve yeri içeren tüplerde 15 ml 3 tüpleri hazırlayın.
- (DİKKAT - kimyasal kaput kullanmak) İsofloran anestezi kullanarak fare Kurban servikal dislokasyon ve hemen dekapitasyon 10-20 sn.
- Kafatası beyin çıkarın ve beyin dokusunda hasar görmesini önlemek için buz gibi soğuk Ringer solüsyonu ile bir kaç saniye için durulayın.
- Cerrahi bıçak kullanılarak, frontal korteks beyincik (CR) ve sapı (BS) ayırır. Sonra, beyin sapından beyincik ayırmak ve frontal korteks, frontal lobu (FL) kesilmiş; frontal lob koku ampulü çıkarın. Belirlenen, 15 ml tüpler içinde 3 beyin bölgelerinin yerleştirin.
- Her bir tüp içinde doku homojenize edilir. Fr EkleESH, buz soğukluğundaki Ringer solüsyonu, her bir tüp, 800 xg da 7 dakika için aynı hacim ve santrifüj içerir.
- Süpernatantı ve her tüp CHAPS lizis tamponu 100 ul ekleyin. , Bir 21 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile çözelti, birkaç kez (~ 10) geçirilerek, iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 13,000 x g'de 30 dakika boyunca yeni bir mikro santrifüj tüpüne ve santrifüj tüpünün her aktarın. Yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve süpernatan, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. -80 ° C'de 10 ul alikolar içinde protein muhafaza edilir.
Araçların, Reaksiyon Çözümleri ve Protein Sulandırma Hesaplamaları 2. TUZAK Testi Hazırlık
- Protein ekstresi seyreltilerde ve telomeraz reaksiyon tamponu için etiketli mikro-santrifüj tüplerine uygun sayıda hazırlayın. Kontaminasyonu önlemek için filtre ipuçlarını kullanarak protokoldeki tüm pipetlenmesini gerçekleştirin. TRAP Reaksiyon karışımı 10x TS astar, dNTP'ler, Ultra saf su ve protein ekstreleri (reaktif ve reaktif konsantrasyonları için malzeme tabloya bakınız): buz aşağıdaki çözümleri çözülme.
- Ultra saf su (Ultra saf su) ile 1 mg / ml nihai konsantrasyona kadar bir protein ekstresi çözeltisi ile seyreltilir.
3. Reaksiyon Telomeraz
- Bir mikro santrifüj tüpüne aşağıdakiler eklenerek telomeraz reaksiyonu karışımı hazırlayın: 2 ul TRAP karışımı (10x), 1 ul TS primer (0.1 ug), 1 ul dNTPs (10 mM) ve 15 ul UPW. Çoklu örnekler için, numuneler, artı 1 sayısına göre yukarıda sözü edilen birimler çarpın.
- Her reaksiyon tüpüne, reaksiyon karışımı 19 ul ve 20 ul son hacim için, her bir tüpe seyreltilmiş protein ekstresi (1 ug protein) 1 ul.
- 45 dakika süre ile, 30 ° C'de önceden ısıtılmış bir su banyosu içinde, reaksiyon tüpleri yerleştirin.
4. PCR Reaksiyonu:
- Onbeş milACX astar, Titanyum Taq Buffer, UPW: n telomeraz reaksiyon sonundan önce, aşağıdaki çözümleri eritin.
- 2.5 ul Titanyum Taq Buffer (10x), 1 ul ACX astar (0.1 ug), 2 ul (IC kullanıldığında 1 ul) UPW ve 0.5 ul Titanyum Taq Polimeraz: mikro-santrifüj tüpüne aşağıdaki ekleyerek PCR reaksiyon karışımı hazırlayın (50x). Çoklu örnekler için, numuneler artı 2 sayısına göre yukarıda sözü edilen birimler çarpın.
- PCR 6 ul her bir PCR tüpü 26 ul karıştırmak ve bir son hacim için her bir tüpe telomeraz reaksiyonu (20 ul), tüm birimi ekleyin.
- Bir PCR termo döngü cihazı için PCR tüpleri yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın:
- 90 ° C - 2 dk.
- 94 ° C - 30 san. *
- 60 ° C - 30 san. *
- 72 ° C -. 45 sn *
- 72 ° C - 2 dk.
-20 ° C'de muhafaza PCR ürünleri.
* = 34 devir
5. Agaroz Mini-gel Hazırlama, Örnekleri Koşu ve Jel Boyama
- 25 ml soğuk tampon maddesi elektroforezi (TBE) ve tampon solüsyonu 2-4 kez hacminin yavaş yavaş yüksek çözünürlüklü (HR) agaroz toz halinde 1,125 g çözelti hızlı bir şekilde karıştırılır iken serpmek, bir cam kaba, bir karıştırma çubuğu ilave edin . Karıştırma çubuğu çıkarın, havalandırma için küçük bir delik plastik bir şal ve delgi ile beher kaplayın. Daha sonra 3 dakika boyunca "düşük" güç mikrodalga beher ısıtın ve "Yüksek" güç anahtarı ve dökülmesini neden değil itina ile kısa bakliyat çözüm ısıtın. Isıtılarak oluşturulan köpük, birkaç saniye sonra, büyük kabarcıklar haline gelir ve kaybolur, agaroz hazır olduğuna dikkat edin.
- Jel, oda sıcaklığında katılaşan sonra jel, kullanımdan önce 4 ° C'de 20 dakika boyunca soğuk izin yatay mini jel cihazına jel döküm.
- 25 TUZAK numune ul (20 ul TRAP PCR ürünlerinin ve 5 ul 6x jel yükleme boyası) ile her şerit yerleştirin ve 11 çalıştırmak4 ° C soğuk oda içinde 3 saat boyunca 0 V.
- 15 ul 10,000X nükleik asit leke, 0.1 M NaCl (0.29 g) ile 50 ml iki defa destillenmiş su (DDW) stok çözeltisi eklenerek çalışma çözeltisi nükleik asit lekesi 3x hazırlayın. Nazik çalkalama ile 20 dakika boyunca jel Leke.
- TRAP merdiven DNA bantları görmek için 302 nm dalga boyunda UV transilluminator kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm hücre protein için 1 ve 3 aylık yaş 3, CD-1 erkek ve 3, CD-1 erkek fareler türetilen, frontal lob (FL), beyin sapı (BS), serebellum (CR) hazırlanmıştır modifiye TRAP tahlil ve radyoaktif TRAP eski 2 aylık yaşta 3 CD-1 erkek fareler. Telomeraz aktivitesi modifiye TRAP deneyi kullanılarak ayıkla 1 mcg proteinler tespit ve 2 mcg proteinler radyoaktif TRAP için ayıklamak edildi. Radyoaktif TRAP ile ve modifiye TRAP ile telomeraz aktivitesinin tespiti 1C genel DNA merdiveni (Şekil 1A uzunluğuna ve yoğunluğu görüldüğü gibi, DNA telomeraz ürünlerin daha iyi bir çözünürlük ve görselleştirme değiştirilmiş test ile görülmüştür olduğunu göstermektedir ve 1D). Telomeraz DNA ürünleriyle bir kademeli azalma glioblastom olan U-251 hücre hattı türetilmiş protein ekstrelerinin, konsantrasyonları azalan zaman görülmektedir Sugge kullanıldıproteinlerin daha düşük konsantrasyonlarda telomeraz aktivitesinin tespiti için modifiye TRAP yönteminin yönteminin duyarlılığını ekstreleri sting (Şekil 1B).
DNA bantlarının yoğunluğu ve DNA ürünlerinin merdiven uzunluğu ile ortaya çıktığı gibi bir anlamlı olarak yüksek telomeraz aktivitesi 3 aylık kadın ve erkeklerde CR kıyasla FL ve BS bölgelerinde görülür. Buna ek olarak, FL erişkinlik telomeraz aktivitesi artar içine geçişi sırasında fare olduğu gösterilmiştir ve BS ve CR (Şekil 1D) olarak azalır. Cinsiyetler arasındaki karşılaştırma FL telomeraz aktivitesinde erkeklerde daha yüksek telomeraz aktivitesini gösteren BS aksine ve CR kadınlarda daha yüksek olduğunu göstermektedir.
IC T kullandığı için, telomeraz aktivitesinin düşük seviyelerini sentezleyen dokuların biz, PCR kullanılarak, DNA merdiven algılama iç kontrol (IC) bir primer kullanılarak bir şekilde daha verimli olduğunu buldukS ileri doğru primer olarak ve böylece DNA merdiveni amplifikasyonu ile çelişmektedir. Verilerin tekrarlanabilirliği Her deney birkaç kez tekrarlanması ile elde edilir.
Fare beyninde Şekil 1. Telomeraz aktivitesi: değiştirilmiş TRAP karşı Geleneksel. Radyoaktif TRAP (2 aylık, CD-1 erkek fareler, 2 ug protein özü). B) protein konsantrasyonlarının azaltılmasıyla gösterilir modifiye TRAP duyarlılığı ile analiz 3 beyin bölgelerinde A) Telomeraz aktivitesi, glioblastoma U türetilen ayıklamak -251 hücre çizgisi. C, D) 1 (c) ve 3 (d) aylık, CD-1 dişi ve erkek farenin 3 beyin bölgelerinde Telomeraz aktivitesi. DNA merdiveni 6 bp'lik bir darbesi ile 50 bp bandı başlar. (NC - negatif kontrol, IC- iç kontrol, BS - beyin sapı, CR - beyincikFL - frontal lob).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PCR 4 ile telomeraz reaksiyonu 3) telomeraz reaksiyon ürünlerinin amplifikasyonu - beyin dokusu 2) spesifik bölgelerinden 1) proteinlerinin ekstre Telomeraz suretiyle, primer uzaması TS: TRAP ile fare beyin telomeraz aktivitesi analizi 4 ana adımdan oluşur yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak, PCR-ürünlerinin) ayrılması.
DNA merdiveni ve PAGE PCR ürünleri ayırma hassas bir şekilde tespit radyoaktif dCTP 'lerin kullanımı: Bu değiştirilmiş TRAP yönteminin Geleneksel tahlilde yükselen iki büyük problemlere yöneliktir. Yüksek çözünürlüklü agaroz jel dizileme PAGE işlemek için sabit oranla telomeraz reaksiyon ürünlerinin bulgulanması (DNA merdiven) kolaylaştırır. Buna ek olarak, nükleik asit, DNA boyama küçük bir miktarının tespiti için gerekli olan yüksek hassasiyete sahip, toksik olmayan bir çözümdür.
Özel dikkat aşağıdaki kritik adımlar verilmelidir: 1) Minimum doku çıkarılmasına ve homojenizasyon arasındaki zamanı tutmak) proteini bütünlüğünü 2 korumak için lizis tamponu tekrar soğutulmasından 3) protein ekstreleri alikotlarda tuttu ve kullanılmadan önce bir kez çözdürülmelidir kaçınılmalıdır adamlar. Numune tekrar soğutulmasından kaçınmak.
Sorunlar yüksek konsantrasyon agarozjeli beri jel hazırlık aşaması sırasında oluşabilecek yayılma eğilimli ve pişirme sırasında yakın ilgi gerektirir. Teknik, soğuk bir odada jel çalışan gerekliliği çeşitli sınırlamalar tutar. Buna ek olarak, PCR ürünlerinin, düşük miktarda UV tabloda izlenemez.
Telomeraz aktivitesi seviyesi, farklı dokular arasında çeşitlilik gösterir ve beyinde düşük olduğu kabul edilir. Bu protokol, daha duyarlı bir algılama yöntemi sunar, beyinde telomeraz aktivitesinin daha iyi bir algılamayı sağlayan geleneksel radyoaktif tahlile karşılaştırın. Farklı zaman koruyan yöntemler kullanılarak elde labele (bir adım TRAP tahlil kitleri olmalarına rağmen,d TH tespiti için astar), bu yöntemler, önemli ölçüde daha pahalıdır. Ayrıca, agaroz kullanımı poliakrilamid jel kullanılarak, bir toksik tehlikesini ortadan kaldırır.
Temsilcisi sonuçlarından ortaya gibi, yukarıda anlatılan yöntemi kullanarak, bu beynin çeşitli bölgeleri arasındaki kadın ve erkek arasındaki telomeraz aktivite düzeyleri farklılıkları göstermek mümkündür. Bu yöntem, düşük telomeraz aktivitesi olan başka normal dokulardaki telomeraz aktivitesinin tespit edilmesi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
