Summary
We beschrijven hier hoe je multi-electrode matrix recordings van menselijke epileptische corticale weefsel uit te voeren. Epileptische weefsel resectie, slice voorbereiding en multi-electrode matrix recordings van interictale en ictal gebeurtenissen worden gedemonstreerd in detail.
Abstract
Epilepsie, die ongeveer 1% van de bevolking, omvat een groep van neurologische stoornissen die worden gekenmerkt door periodiek optreden van aanvallen die normale hersenfunctie verstoren. Ondanks behandeling met de huidige beschikbare middelen tegen epilepsie targeting neuronale functies, een derde van de patiënten met epilepsie zijn farmacoresistente. In deze toestand, chirurgische resectie van het hersengebied genereren aanvallen blijft de enige alternatieve behandeling. Studie van de menselijke epileptische weefsels heeft bijgedragen aan nieuwe epileptogene mechanismen te begrijpen tijdens de laatste 10 jaar. Inderdaad, deze weefsels te genereren spontane interictale epileptische ontladingen evenals-farmacologisch geïnduceerde ictal gebeurtenissen die kunnen worden opgenomen met klassieke elektrofysiologische technieken. Opmerkelijk, multi-elektrode arrays (MEA's), die microfabricated apparaten inbedden van een reeks van ruimtelijk geregeld micro-elektroden zijn, bieden de unieke mogelijkheid om gelijktijdig te stimuleren en op te nemen gebied potentials, alsmede actiepotentialen van meerdere neuronen uit verschillende gebieden van het weefsel. Zo MEA-opnames bieden een uitstekende benadering van de ruimtelijke en temporele patronen van spontane interictale en evoked inbeslagneming-achtige verschijnselen en de mechanismen die ten grondslag liggen aan beslaglegging begin en de voortplanting bestuderen. Hier beschrijven we hoe de menselijke corticale plakjes bereiden van chirurgisch weggesneden weefsel en op te nemen met MEA interictale en ictal-achtige verschijnselen ex vivo.
Introduction
Epilepsie is een chronische aandoening waarbij epileptische aanvallen, die intermitterend patroon lozingen van enkele seconden tot tientallen seconden elektro-encefalogram (EEG) opnames geassocieerd met klinische manifestaties, onderbreekt een interictale toestand, gekenmerkt door de aanwezigheid van synchrone neuronale ontladingen hooguit een paar milliseconden en riep interictale gebeurtenissen 1. Het treft populatie ongeveer 1% wereld en hoewel aanvallen worden bestuurd in de meeste patiënten, hebben ongeveer een derde van de mensen met epilepsie onvoldoende respons op anti-epileptica 2 tonen. In deze toestand, genaamd farmacoresistente epilepsie en waarvan de mechanismen nog moeten duidelijk worden geïdentificeerd, de chirurgische resectie van het specifieke deel van de hersenen geïdentificeerd als de inbeslagneming-onset zone blijft de enige alternatieve behandeling geven van een positief resultaat voor de patiënten. Dus de resectiepreparaten van een operatie leveren de opporgesteld om de mechanismen van interictale lozingen en beslag productie en kweken, alsmede farmacoresistentie op levensvatbare menselijke centrale zenuwstelsel ex vivo.
Multielektroden (MEA), dat bestaat uit een opstelling van ruimtelijk verdeelde micro-elektroden, zodat het simultaan stimuleren en registratie van elektrofysiologische activiteit in verscheidene plaatsen van het weefsel, waardoor een goede benadering van de ruimtelijke en temporele patronen van spontane en uitgelokte -activiteit . Deze techniek, eerst toegepast op het ontwikkelingsveranderingen van neuronale celkweek activiteit 3 bewaken en aangepast voor acute en organotypische hersenen en ruggenmerg slices 4-6 wordt momenteel beschouwd als een waardevol elektrofysiologische tool.
Het huidige protocol beschrijft hoe de menselijke corticale plakjes bereiden van chirurgisch weggesneden weefsel en op te nemen met MEA betrouwbare ex vivo interictale en inbeslagneming-achtige gebeurtenissen uit deze plakjes. Deze techniek verschaft dus een manier om de fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen epileptische activiteiten initiatie, propagatie en effecten van anti-epileptica zowel cellulair en netwerkniveau pakken. Alle procedures voor het verkrijgen, bereiden, onderhouden en opnemen menselijke plakjes worden hier beschreven.
Protocol
LET OP: De hier beschreven protocol volgt de richtlijnen van het Franse "Raadgevende Commissie inzake National d'Ethique" en is gedeclareerd als een verzameling activiteit door het INSERM.
1. Resectie van Human Epileptische Tissue
- Patiënten
- Verkrijgen hersenweefsel van patiënten die lijden aan onbehandelbare epilepsie. Het verkrijgen van een schriftelijke toestemming voor de operatie.
- Voor alle gekoppelde epileptische patiënten uitvoeren uitgebreide prechirurgische opwerking zoals neurologisch onderzoek, neuropsychologisch onderzoek, oppervlakte EEG en neuroimaging (MRI en soms 18 FDG-PET scan Figuur 1A), gevolgd door post-operatieve histologisch onderzoek van gereseceerd weefsel (Figuur 1B) . OPMERKING: Chirurgie wordt aangegeven wanneer de diverse verkenningen lokaliseren evenzo de inbeslagneming onset zone en wanneer het voordeel van de verwijdering groter is dan de chirurgische risico's.
- Chirurgie
- Maintain anti-epileptica pre-operatief. Operatieve ingrepen onder algemene anesthesie inductie met inhalatie sevofluraan (6% geleverd verhouding en 100% fractie van ingeademde O2), intra- veneuze sufentanyl (0,3 ug / kg) en antracurium (0,5 mg / kg), gevolgd door onderhoud intra veneuze sufentanyl (0,5 ug / kg / uur) en geïnhaleerde sevofluraan (1 MAC).
- Gebruik een neuronavigatie systeem een nauwkeurige lokalisatie van de laesie cortex (figuur 1C) mogelijk. Na incisie in de huid, het uitvoeren van een braam gat in het bot, gevolgd door een craniotomie met een hoge spill boor. Voorzichtig verheffen het bot flap, en open de dura met een schaar (figuur 1D).
- Gebruik intra-operatieve ultrageluid de identificatie van de abnormale cortex en microchirurgische instrumenten en een ultrasone aspirator onder operatiemicroscoop vergemakkelijken.
- Stollen en snijd de pio-arachnoidal vliegtuig volgens de sulcal grenzen. Gebruik subpial dissectie aan rElease de cortex van de pia rond het laesiegebied.
- Snijd de witte stof onder de abnormale cortex aan één stuk uit te voeren "en bloc" resectie, spaarde zoveel mogelijk het vaatstelsel. Vermijd traumatische manipulatie van de cortex.
- Snij een 1 cm dikke plak uit de gereseceerde weefsel langs een richting loodrecht op de pial oppervlak, met inbegrip van de sulcus bodem en overgangsbepalingen cortex.
2. Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voor Slice Voorbereiding, Incubation en opnemen
- ACSF voor slice voorbereiding
- Bereid 1 liter sucrose gebaseerde ACSF 7,8, bevattende (in mM): 250 sucrose, 3 KCl, 25 NaHCO3, 10 D-Glucose, 1 CaCl2, MgCl2 10; lossen deze zouten in gedeïoniseerd water en zuurstof de oplossing carbogen ten minste 10 min.
- Gezet ~ 700 ml sucrose ACSF bij -80 ° C gedurende 50-60 min (of -150 ° C gedurende 15-20 min). Houd de rest van deoplossing onder oxygenatie in ijs. OPMERKING: De ACSF voor slice preparaat bij 4 ° C worden bewaard; in dit geval, voeg CaCl2 en MgCl2 de dag van het experiment, alvorens te koelen.
- ACSF voor slice incubatie en opname
- Bereid ten minste 3 l opname ACSF 7,8, bevattende (in mM): 124 NaCl, KCl 3, 26 NaHCO3, 10 D-glucose, 1,6 CaCl2, 1,3 MgCl2; lossen deze zouten in gedemineraliseerd water en zuurstof de oplossing met carbogen. Voor het toevoegen van MgCl2, houden sommige ACSF om opnames uit te voeren in 0 Mg 2+ ACSF. OPMERKING: De incubatie / opname ACSF kan bij 4 ° C worden bewaard; in dit geval, voeg CaCl2 en MgCl2 de dag van het experiment.
3. apparatuur voor Slice Incubation en opnemen
- Interface kamer voor slice incubatie
- Gebruik een brein slice kamer te onderhouden levende plakjes ex vivo </ Em> in de interface van de modus. OPMERKING: De kamer bestaat uit een onderste deel, dat de verwarming en de sensorelementen en een keramische bubbler bevat en wordt gevuld met gedestilleerd water, en een bovenste deel, waar de plakjes rusten op een vel lens weefsel in het vlakke gebied het midden van de kamer (Figuur 2A - B).
- Gebruik twee aparte fijne PTFE buizen, waardoor de preoxygenated ACSF komt in de kamer. OPMERKING: De buizen spiraal in het verwarmde water en bereikt de bovenzijde van de kamer; dan is de oplossing verlaat door middel van capillaire werking met lens weefsel, dat de oplossing in afrit putten uitstraalt.
- Sluit de PTFE buizen van de interface, tot een peristaltische pomp, om continue perfusie van de plakjes met de preoxygenated medium mogelijk.
- Handhaving van de hoge zuurstofspanning door zuurstof met carbogen (95% O 2 en 5% CO 2) door de keramische wasfles. LET OP: Deze verwarmd en bevochtigd gasmengsel bereikt desegmenten in het bovenste gedeelte van de kamer door passende gaten.
- Houd de temperatuur in het bovenste gedeelte van de kamer door het verbinden van de kamer met een temperatuurregelaar, via een speciale kabel met twee uiteinden heeft connector voor de kamer verwarmingselement en een externe temperatuursensor aan één uiteinde. Plaats de sensor nabij de plakjes om de temperatuur in de incubatie (Figuur 2C) controleren.
- Meerdere elektroden matrix recordings
- Gebruik planaire multielektroden 120 titanium nitride elektroden (30 urn diameter) geïsoleerd met siliciumnitride en interne referentie electrode, gerangschikt in een matrix 12 x 12 200 urn hart op hart afstand. OPMERKING: Andere configuraties met verschillende elektrode diameter en afstand zijn mogelijk. In het bijzonder kan de MEA chip worden uitgebreid tot grotere segmenten van menselijke weefsels proeven.
- Acquire elektrische signalen van 10 kHz met behulp van een MEA2100-120 systeem (pre- en filter versterker met geïntegreerde data-acquisitie en analoog-digitaal-omzetter, 16 bit data resolutie, ingangsspanning bereik en bandbreedte instelbaar via software) via een speciale software (MC_Rack). OPMERKING: De MEA2100 headstage is begiftigd van een metalen plaat voor het fixeren van verwarmbare perfusie element via magnetische houders, om continu perfuseren de schijfjes gedurende de opnamesessie.
- Houd het weefsel beneden op de MEA door een kleine eigengemaakte platina anker, dat een goede elektrische koppeling tussen het segment en de elektroden waarborgt.
4. Voorbereiding van de Interface Chamber and Tools voor Dissection en Snijden
- Interface kamer
- Vul het onderste gedeelte van de interface kamer met gedestilleerd water. Zorg ervoor dat het niveau van het water volledig onderdompelt het verwarmingselement en is 2 tot 4 mm onder de kruising tussen de onderste en bovenste deel van de kamer. Controleer dit niveau dagelijks vóór het inschakelen van de verwarming,om beschadiging van het verwarmingselement te voorkomen.
- Sluit de kamer om een carbogen bron, begiftigd met een secundaire stroom regulator voor fijne aanpassingen van de gasdruk.
- Snijd een vel lens weefsel om het vlakke gebied van de slice kamer past, en plaats deze dicht bij de ingang oplossing buizen, elke bubble ontsnapping uit de input lijn laat vóór het bereiken van de plakjes.
- Snij twee stukken gestrande katoendraad zolang het stuk lens weefsel en positioneren langs de hoofdzijden van het vlakke gebied van de kamer. OPMERKING: Dit helpt om de perfusie-oplossing niveau in de kamer iets te verhogen.
- Stel de stroomsnelheid van de peristaltische pomp bij 1 ml / min en de pomp inschakelt.
- Begin zuurstofvoorziening van het water in het onderste gedeelte van de kamer.
- Stel de temperatuur van de thermostaat op 37 ° C en zet hem aan. Bedek het bovenste deel van de interface kamer met een stuk parafilm en wacht ten minste 30 minuten voor de temperature te verhogen en te stabiliseren.
- Gereedschap voor dissectie en snijden
- Bereid een dissectie kit bestaande uit twee fijne tang, een spatel, een kleine lepel en een mes; twee glazen petrischaaltjes, twee borstels en cyanoacrylaat lijm.
- Stel de parameters van de vibratome: dikte, 400 micrometer; frequentie, 70-90 Hz; amplitude, 0,9-1 mm, snelheid: 0,1 mm / sec.
5. Human Corticale Slice Voorbereiding
- Verwijder de sucrose gebaseerde ACSF van -80 ° C vriezer en mengen om een soort slush verkrijgen. Zuurstof toe te voeren met carbogen, zet ~ 250 ml in een glazen fles en bewaar het in een fles Dewar gevuld met ijs, terwijl het gaan naar de operatiekamer van het ziekenhuis om het weefsel te krijgen. Ondertussen houden de rest bij -20 ° C.
OPMERKING: Tijdens de operatie, de neurochirurg ontleedt een klein blok van corticale weefsel. Onmiddellijk het monster in ijskoude sucrose ACSF voor overdracht naar het laboratorium. - Houd de tijd die nodig is voor de overdracht van het ziekenhuis in de laboratoria maximaal 30 min. In het laboratorium, neem de sucrose gebaseerde zuurstofrijk ACSF van -20 ° C vriezer, meng het tot een slush hebben, vullen een petrischaal en de vibratome buffer lade en start zuurstof beide met carbogen. Verwijder voorzichtig het stukje menselijk weefsel uit de fles met een lepel en zet het in de petrischaal (figuur 2D).
- Met behulp van de tang, verwijder voorzichtig bloedstolsels, schepen en hersenvliezen aan weerstand tijdens het snijden te voorkomen. Verwijder de hersenvliezen, bestaande uit pia materiaal vanaf de zijkanten van het weefsel blok, let het corticale oppervlak niet beschadigt. Met een mes, snijd een zijde van het weefsel op een vlak oppervlak te verkrijgen, dat wordt gelijmd aan de vibratome preparaatplateau. OPMERKING: De hersenvliezen, bestaande in pia-materie, worden verwijderd vanaf de zijkanten van het weefsel blok, met aandacht de corticale oppervlak niet te beschadigen.
- Als het blok van tissue is groter dan de MEA kamer, snijd een stukje van de juiste afmetingen voor het lijmen van het op het monster plaat (figuur 2E).
- Lijm het weefsel om transversale corticale plakjes te krijgen, zet het in de buffer lade en snijd 400 micrometer dikke plakken bij lage snelheid (0,1 mm / sec) (figuur 2F).
- Snij stukjes lens weefsel met slice afmetingen; met een spatel en een borstel, dragen de segmenten op deze lens weefsels en incubeer ze in de interface kamer bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur voordat opnamen (Figuur 2G - I). Continu slaan de segmenten in dezelfde omstandigheden tot gebruik. OPMERKING: Het plaatsen van schijfjes op lens papier is een belangrijke stap om zowel de perfusie van de onderkant van de plakjes en het verwijderen van segmenten van de interface kamer vóór de opname te vergemakkelijken.
- Tijdens de overdracht van de plakjes op de lens weefsel, beheren ze heel voorzichtig, het vermijden van de corticale laag gebied aan metde borstel.
- Bereid de segmenten één voor één en onmiddellijk over elk van hen om de interface kamer, teneinde een goede zuurstoftoevoer en temperatuur waarborgen; snijd het blok resectie weefsel zo snel mogelijk.
6. Voorbereiding van MEA Setup voor Recordings
- Sluit het perfusie systeem een peristaltische pomp en het MEA systeem een computer. Van zuurstof de opname ACSF. Zet een leeg MEA chip in de versterker.
- Stel de temperatuurregelaar voor verwarming canule element tot 37 ° C bereikt in de kamer MEA en start de perfusie aan 5-6 ml / min. Opmerking: Het is meestal noodzakelijk om de temperatuur in te stellen 3-4 ° C hoger dan de gewenste, afhankelijk van de temperatuur en de stroomsnelheid.
- Controleer de temperatuur in de kamer MEA met een fijne thermometer, het plaatsen het dichtst mogelijk bij het midden, zonder de elektrode raken.
- Start de opname software en controleer of alle MEA elektroden goed zijn aangesloten en dat er geen lawaai als gevolg van perfusie.
- Start MEA_Monitor om de werking van de camera tafel te controleren.
7. Overdracht van een Plak Van Interface Kamer om MEA Chip voor opname
- Giet wat opgewarmd opnemen ACSF in een glazen petrischaal; met een tang, neem een stukje van de interface kamer, door grijpen het door de lens weefsel, en zet het in de petrischaal. Voorzichtig los het schijfje uit het weefsel. Als het niveau van de oplossing in de interface kamer zorgvuldig aangepast tijdens incubatietijd zal de plak los van de lens weefsel alleen door onderdompeling in de oplossing; anders, gebruik dan een kleine borstel om het detachement te vergemakkelijken.
- Vul een MEA chip met enkele ACSF en met een spatel, de overdracht van de snee in. Met een plastic Pasteur pipet, verwijder voorzichtig de oplossing om het schijfje zich houden aan de elektrode-oppervlak en houd het op zijn plaats met een platina anchof. Voeg 1 ml van opname ACSF, plaatst de MEA chip in de versterker en beginnen perfusie aan 5-6 ml / min (Figuur 2J - L).
- Controleer de slice positie op de MEA-opname gebied met behulp MEA_Monitor, stel deze indien nodig om op te nemen van de corticale lagen en maak een foto. Start de opname.
Representative Results
De opname van de menselijke corticale slice activiteit start terwijl perfuseren het weefsel met een normale opname ACSF (zoals eerder beschreven) 7,8. In deze toestand, wanneer het weefsel goed bewaard is gebleven tijdens de operatie en later tijdens weefsel overdracht uit het ziekenhuis en slice voorbereiding, kan men spontane activiteit waarnemen, in de vorm van kleine interictale-achtige verschijnselen, waargenomen van kleine clusters van MEA elektroden. Interictale-achtige ontladingen bestond uit een veldpotentiaal, meestal bifasische, omvattende een eerste scherpe negatieve uitwijking bereiken tientallen microvolt, gevolgd door een langere tegenover golf van enkele tientallen milliseconden. Snelle multi-unit activiteiten doorgaans ingebed in het veldpotentiaal voornamelijk in het eerste deel. Een representatief voorbeeld van interictale-achtige activiteit wordt geïllustreerd in figuur 3Aii, waar de sporen geregistreerd door een MEA elektrode getoond.
Voor epileptische aanvallen uit in een recordtijdvitro humane corticale schijfjes, moet ze perfuseren met een "epileptogeen" ACSF, waarbij Mg 2+ afwezig en K + wordt verhoogd tot 6 mM, weefsel prikkelbaarheid 1 (de toename van K + 3-6 mM stimuleren alleen is niet genoeg om epileptische aanvallen te veroorzaken; gegevens niet getoond). Zodra de perfusie met 0 Mg2 + 6 mM K + ACSF begonnen, de activiteit van corticale schijfjes geleidelijk toe en de eerste aanval wordt binnen 15 tot 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, uit 5 patiënten Figuur 3 Ai ). We opgeroepen ictal-achtige activiteit, zoals getoond in figuur 3, in 75% van de geteste patiënten en 66,7% van alle geregistreerde segmenten.
Epileptische werkzaamheden leggen van aangrenzende elektroden van de MEA chip, en vergelijking van het begin dynamiek van veldpotentiaal gebeurtenissen maakt het bestuderen van hun plaats van ontstaan en vermeerdering. Een vertegenwoordiger inbeslagneming uit een schijfje humeen cerebrale cortex bij de MEA wordt getoond in figuur 3B (vertegenwoordiger spoor van een aanval opgenomen door een MEA elektrode getoond bij hogere temporele resolutie in figuur 3 Aiii). Merk op dat het beslag is opgenomen van bijna alle elektroden van de MEA chip, daarmee aangevend dat het kan doorgeven aan een groot corticale gebied. Voorts blijkt uit de enkelvoudige sporen opgenomen van elke elektrode, is het mogelijk om de geleidelijke verspreiding van het beslag in het weefsel observeren: inderdaad, het begint eerst in het corticale gebied dat de rechterhelft van de elektrode-reeks, en geleidelijk uitbreidt naar het gebied dat de linker helft (.. i e, vergelijk sporen uit elektrode L6 en B6; Figuur 3B).
Figuur 1: Een corticale dysplasie een. d haar chirurgische verwijdering A Taylor soort focale corticale dysplasie (witte pijl) ingebed in een linker frontale kwab sulcus wordt gevisualiseerd op het preoperatieve MRI (A), en later bevestigd door histologisch onderzoek (B) MAP-kinase-etikettering; schaal bar: 200 pm) met een corticale dyslamination, abnormale neuronen en een track op de neuronen met een onvolledige migratie in de onderste witte stof. Tijdens de operatie wordt de dysplasie gelokaliseerd volgens de MRI data met een neuronavigatie systeem (C). Visualisatie van de gyrus met de dysplasie tijdens chirurgie (D).
Figuur 2. Apparatuur en werkwijze voor menselijke corticale slice voorbereiding Een interface kamer wordt toegepast om menselijke corticale schijfjes handhaven ex vivo (A); de plakjes rust op een vel lens weefsel in het vlakke gebied in het bovenste deel van de kamer (B), waarbij een temperatuursensor (C, links), verbonden met een temperatuurregelaar (C, rechts, boven) via een dubbele ended kabel (C, rechts, beneden), wordt geplaatst om te onderhouden 37 ° C in het gehele schijfje incubatietijd. Eenmaal bekomen, plaats de gereseceerde blok van weefsel in een petrischaal gevuld met ijskoude sucrose gebaseerde ACSF (D) en verwijder bloedstolsels, schepen en hersenvliezen, om het snijden te vergemakkelijken. Wanneer het weefsel blok groter dan MEA kamers, isoleren een stuk van geschikte afmetingen met een mes (E) en lijm deze op de vibratome preparaatplateau (F). Snij 400 urn dikke plakken en met behulp van een spatel (G) overbrengen op stukjes weefsel lens (H) en incubeer ze in de interface kamer (I). Vóór de opname remove de lens weefsel door onderdompeling het schijfje in een petrischaal gevuld met ACSF en overbrengen naar een ACSF gevuld MEA chip met een spatel (J). Verwijder de oplossing te laten de slice zich houden aan de MEA (K) en bewaar het in positie met behulp van een platina anker. Plaats de MEA in de versterker (L), beginnen perfusie en opname.
Figuur 3: MEA opnames van epileptische aanvallen bij humane corticale schijfjes (A) Een vertegenwoordiger spoor van menselijke corticale plak activiteit geregistreerd door een MEA elektrode wordt getoond in paneel i.. In aanwezigheid van normale ACSF, is het mogelijk om interictale-achtige spontane activiteit (kleine grijze rechthoek, ingezoomd panel ii) na te leven; Vervolgens, wanneer de perfusie met 0 Mg2 + 6 mM K + ACSF begonnen, de eerste seizuopnieuw verschijnt na ~ 15 min vertraging en wordt gevolgd door andere gebeurtenissen in 2-3 min interval. Panel III toont de aanvallen in de grote grijze rechthoek in panel i met een ingezoomde schaal. De blauw spoor illustreert een gezoem van de activiteit, zoals aangegeven door de blauwe lijn en een pijl. Panel iv) toont de gegevens weergegeven in panel iii) high-pass gefilterd bij 250 Hz, die multi-unit activiteit wanneer ingezoomd (blauw spoor) te onthullen. (B) Vertegenwoordiger opname van een aanval in aanwezigheid van 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF uit alle MEA elektroden. Elk vierkantje vertegenwoordigt een elektrode van 12 x 12 MEA array en toont een 80 sec tijdvenster; De stippellijn geeft de positie van het corticale oppervlak relatief aan MEA array.
Discussion
Farmacoresistente epilepsie is een zeldzame aandoening, die kan worden verkend in menselijk weefsel in vitro. Dit maakt het bestuderen epileptische menselijke cortex, die specifiek gebreken die slechts gedeeltelijk zijn weergegeven in diermodellen weergegeven. De hier beschreven methode maakt het voorbereiden en opnemen postoperatieve menselijke weefsels ex vivo met geconserveerde cellulaire levensvatbaarheid en netwerken zodat zij spontaan epileptische activiteiten. Het behouden van soortgelijke activiteiten dan die gevonden in vivo is cruciaal om mechanismen van ontstaan van pathologische activiteiten te bestuderen. Verder dergelijke werkwijzen toestaan verkennen menselijke weefsels en voorkomen niet perfect diermodellen van de ziekte. Echter, het bestuderen van menselijk weefsel vereist synchronisatie tussen neurochirurgen en de experimentele laboratorium. Tissue vervoer vraagt om specifieke zorg niet traumatisch te zijn. Bovendien zijn zowel de hoeveelheid monster en weefsels is beperkt. Tot slot, de toegang tot een goede controle weefsels is de main zorg. Met deze voorbereiding, de postoperatieve weefsels spontaan interictale-achtige ontladingen in normale ACSF 7,8. Ictal-achtige verschijnselen kunnen ook worden uitgelokt in gewijzigde, proconvulsieve ACSF zodat de mechanismen van inbeslagneming initiatie en de overgang van de interictale staat om epileptische aanvallen kunnen worden onderzocht.
Menselijk weefsel kan tot 10 uur in interfaces levensvatbaar zijn. Plakjes werden levensvatbaar beschouwd als multi-unit activiteit of veldpotentialen spontaan werden waargenomen en wanneer deze activiteiten werden opgeroepen door toenemende prikkelbaarheid door extracellulair kalium toeneemt en / of magnesium afname. Hoewel de variatie in de activiteit plaatsvindt, waarschijnlijk als gevolg van verschillen in pathologie en corticale gebieden, we verkend epileptogene kenmerken van een weefsel alleen bij gezonde plakjes tonen spontane interictale en opgeroepen ictal ontladingen. Om weefsel vitaliteit en activiteit behouden, wordt een interface-kamer gebruikt voor het opslaan thij moten bij 36-37 ° C voor herstel voordat het opnemen met de MEA-systeem. Inderdaad, hebben verschillende groepen duidelijk de voordelen van interface-gebaseerde storage-systeem ten opzichte van standaard beker opslag en het belang van de temperatuur voor het behoud van het netwerk van activiteit, zoals spontane scherpe wave-ribbels of-cholinerge geïnduceerde oscillaties 9,10. Interface opslag van plakjes is al eerder gebruikt om epileptische activiteit uit menselijke hippocampus en subicular plakjes 1,11 opnemen. Met de huidige MEA-techniek, na de herstelperiode van het snijden in de interface van omstandigheden, wordt het netwerk activiteit opgenomen in ondergedompeld omstandigheden, in aanwezigheid van hoge stroomsnelheid (5-6 ml / min) bij 37 ° C, met de MEA-systeem. De gereduceerde diameter (1,8 cm) van MEA chip, die een kleine kamervolume (<1,5 ml) begrenst, tezamen met de verhoogde stroomsnelheid, verbetert zuurstoftoevoer van de plak, dat is aangetoond dat een belangrijke factor voor spontane en pharmacologically-geïnduceerde netwerkactiviteiten 9,10. Verder, de verminderde hoeveelheid circulerend ACSF maakt farmacologische testen.
Het snijden procedure is echter een trauma voor de weefsels 12. Zowel neuronale architectuur en chloride homeostase lijken verstoord worden op het weefseloppervlak (50 urn). De oorsprong van de opgenomen door MEA chips, welk monster het weefsel meestal oppervlakkig zonder diepe penetratie, kunnen voortvloeien uit getraumatiseerde gebieden activiteiten. Echter, onze gegevens blijkt dat het extracellulaire veldpotentialen gedetecteerd plaatselijk worden in de meeste MEA elektroden en eerder werk blijkt dat ze geïntegreerd over 100 tot 200 urn afstand van de opname onderzocht 13, suggereert dat aanvallen genoteerd in onze bereiding is onwaarschijnlijk dat door getraumatiseerde gebieden. Verder is uit onderzoeken die met wolfraam elektroden waardoor diepe penetratie, de epileptische activiteiten opgenomen in menselijke weefsels zijn vergelijkbaarmet die waargenomen bij epileptische patiënten 1,7,8.
Een andere beperking van ex vivo weefsel opname is de verstoring van de verbindingen tussen de verschillende hersengebieden, waardoor het beperken van dynamische neuromodulations. Dit kan verklaren waarom in dergelijk weefsel geen ictal-achtige gebeurtenis wordt spontaan opgenomen, maar vereist om te worden geactiveerd door ionische manipulatie of farmacologische stimulatie versterken prikkelbaarheid. Dienovereenkomstig, in dit protocol, beslag-achtige verschijnselen geïnduceerd door het combineren van een verandering in extracellulaire K + 3-6 mM en een vermindering van de externe Mg2 + van 1,3 mM tot Mg2 + -vrij ACSF, teneinde weefsel prikkelbaarheid verhogen en verwijder Mg 2+ -afhankelijk NMDA receptor blokkeren. Inderdaad, is eerder aangetoond dat epileptische activiteit geïnduceerd in humane neocortical en hippocampale plakjes met Mg2 + -vrij ACSF lijkt het elektrografische aanvallen die in vivo 14. Bovendien,Het is aangetoond dat epileptiforme ontladingen verkregen in temporale kwab plakjes resistent geworden klinisch gebruikte anti-epileptica na langdurige blootstelling aan Mg 2 + -vrij ACSF 15,16, en zo een model voor het onderzoeken farmacoresistente inbeslagneming-achtige gebeurtenissen in vitro.
MEA laten opnemen van beide, field potentials en multi-unit activiteiten waarbij neuronale actiepotentialen ex vivo. Zo MEA zijn een krachtig elektrofysiologische hulpmiddel vergeleken met EEG's, die potentials veld gegenereerd door synchrone activiteiten van neuronale ensembles in vivo te onderzoeken, maar geef niet op de toegang tot één enkel neuron gedragingen 17. Hoewel meer recente micro-elektroden in vivo multi-unit activiteiten waarbij neuronale actiepotentialen kan opnemen, ze zijn invasief, waardoor gebruik meestal beperkt is tot het onderzoek doel tijdens intracraniële opnames. Vooral MEA opnames vormen een techniek keuzenaar de ruimtelijke en temporele patronen van epileptische gebeurtenissen te bestuderen, de mechanismen die de inbeslagname ontstaan en de verspreiding en de actie van klassieke en nieuwe anti-epileptica. Opmerkelijk, de celtypes en de signalering basis van epileptische ontladingen ontrafelen spike sorteringstechnieken en farmacologische proeven moeten worden gecombineerd met MEA technieken. Hoewel MEA toegang tot individuele spikes kan geven, verstrekken zij geen informatie over de synaptische en biofysische eigenschappen. In de toekomst, moeten andere technieken worden gekoppeld MEA opnamen om beter monster cellulair gedrag netwerkactiviteiten en synaptische signalering. Bijvoorbeeld fluorescentie beeldvorming neuronen of gliacellen gedrag en ion dynamiek ontrafelen, worden gecombineerd met MEA opnames. Verder post hoc histologische analyse kan ook iets over bepaalde veranderingen van celtypen, eiwitten of receptoren zodat de locatie van de epileptische activiteiten kunnen worden gecorreleerd met specifieke herschikkingen van denerveuze structuur. De MEA-systeem kan ook worden ingebed in een patch-clamp set-up om enkele cellen of conductances correleren met de bevolking activiteiten. In de toekomst kan optogenetic instrumenten worden gebruikt, mits menselijke schijfjes kunnen worden gekweekt op lange termijn, zoals uitgevoerd voor organotypische plakjes, waardoor transfectie of infectie van bepaalde celtypes kunnen worden uitgevoerd.
Disclosures
Sponsoring door Multichannel Systems werd verstrekt voor de productie van de video en open access publicatie.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van ANR (Programme Blanc Neurosciences), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), City of Paris (Programme Emergence), INSERM en La Pitié Salpêtrière Hospital (Translationeel onderzoek contract) naar NR, van Neuropôle de Recherche Francilien (NERF) naar ED, aan de Université Pierre et Marie Curie UPMC (Programma Convergentie) en aan het Institut du Cerveau et e la Moelle epiniere (Parijs) naar GH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
| 2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
| Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
| 6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
| MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
| Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
| Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
| Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
| MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
| Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
| Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
| Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
| Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
| Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
| Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |
References
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays. Neuroscience Letters. 361 (1-3), 86-89 (2004).
- Sun, J. -J., Luhmann, H. J. Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1995-2004 (2007).
- Dossi, E., et al. Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System. Cerebral cortex. 23 (12), New York, N.Y. 2905-2922 (1991).
- Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks. The European journal of neuroscience. 15 (4), 671-683 (2002).
- Cohen, I., et al. On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (1126).
- Huberfeld, G., et al. Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy. The Journal of neuroscience. 27 (37), 9866-9873 (2007).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro. PLoS ONE. 4 (9), (2009).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
- Wittner, L., et al. The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro. Brain. 132 (11), 3032-3046 (2009).
- Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain. The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).
- Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts. Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).
- Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -G. Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro. Annals of neurology. 30 (4), 589-596 (1991).
- Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons. Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).
- Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants. Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents - EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
