Summary
Siamo qui descritto come eseguire multi-elettrodo registrazioni matrice di tessuto corticale epilettica umana. Resezione del tessuto epilettico, preparazione e fetta di array multi-elettrodo di registrazioni di eventi interictali e ictali sono dimostrati in dettaglio.
Abstract
L'epilessia, che colpisce circa l'1% della popolazione, comprende un gruppo di disturbi neurologici caratterizzati dalla presenza periodica di crisi epilettiche, che perturbano la normale funzione cerebrale. Nonostante il trattamento con farmaci antiepilettici attualmente disponibili il targeting funzioni neuronali, un terzo dei pazienti affetti da epilessia farmacoresistente sono. In questa condizione, la resezione chirurgica della zona del cervello generando convulsioni rimane l'unico trattamento alternativo. Studiare tessuti epilettici umani ha contribuito a capire i nuovi meccanismi epilettogene nel corso degli ultimi 10 anni. In effetti, questi tessuti generano scariche epilettiche spontanee interictali così come gli eventi ictali farmacologicamente indotto, che possono essere registrati con le tecniche di elettrofisiologia classiche. Sorprendentemente, gli array multi-elettrodo (MEA), che sono i dispositivi che incorporano microfabbricate un array di microelettrodi spazialmente disposte, offrono l'opportunità unica di stimolare contemporaneamente e campo del record potentials, nonché potenziali di azione di molteplici neuroni di diverse zone del tessuto. Così MEA registrazioni offrono un ottimo approccio per studiare i modelli spazio-temporali di interictale spontanea ed eventi convulsivi, come evocati e dei meccanismi alla base delle crisi insorgenza e la propagazione. Qui si descrive come preparare fettine corticali umani dal tessuto asportato chirurgicamente e per registrare con MEA interictali e ictali simili eventi ex vivo.
Introduction
L'epilessia è una malattia cronica in cui crisi epilettiche, che sono scarichi fantasia intermittenti della durata di diversi secondi a decine di secondi su elettroencefalografici (EEG) registrazioni associate a manifestazioni cliniche, interrompono uno stato interictale, caratterizzato dalla presenza di scariche neuronali sincrone decine di millisecondi durata e ha invitato gli eventi interictali 1. Essa colpisce popolazione di circa l'1% mondo e sebbene convulsioni sono controllate nella maggior parte dei pazienti, circa un terzo delle persone con epilessia non mostrano risposta adeguata ai farmaci antiepilettici 2. In questa condizione, chiamato epilessie farmacoresistenti ei cui meccanismi devono ancora essere chiaramente identificata, la resezione chirurgica della parte specifica del cervello identificata come la zona di sequestro insorgenza rimane l'unico trattamento alternativo dà un risultato positivo per i pazienti. Così, i campioni asportati da un intervento chirurgico producono la opporoppor- per studiare i meccanismi di scarichi interictali e la generazione e la propagazione delle crisi, così come farmacoresistenza sul tessuto nervoso centrale umano vitale ex vivo.
Multi-elettrodo array (MEA), presenta una disposizione di microelettrodi spazialmente distribuiti, consentono la stimolazione simultanea e registrazione dell'attività elettrofisiologica da diversi siti del tessuto, fornendo così un metodo eccellente per studiare gli schemi spazio-temporali di attività spontanea ed evocata . Questa tecnica, prima applicazione di monitorare i cambiamenti dello sviluppo di attività colture cellulari neuronali 3 e poi adattato per il cervello acuto e organotipica e fette del midollo spinale 4-6, è oggi considerato uno strumento prezioso elettrofisiologico.
Il protocollo attuale descrive come preparare le fette corticali umani dal tessuto asportato chirurgicamente e per registrare con MEA affidabile ex VIvo interictale ed eventi convulsivi, come da queste fette. Questa tecnica fornisce quindi un modo per affrontare i meccanismi fondamentali alla base delle attività epilettiche iniziazione, propagazione e gli effetti dei farmaci antiepilettici sia a livello cellulare e di rete. Tutte le procedure utilizzate per ottenere, preparare, mantenere e registrare fette umani vengono qui descritti in dettaglio.
Protocol
NOTA: Il protocollo qui descritto segue le linee guida del francese "Comité Consultatif National d'Ethique" e viene dichiarata come attività di raccolta da INSERM.
1. La resezione di tessuto epilettico umano
- Pazienti
- Ottenere tessuto cerebrale di pazienti affetti da epilessia intrattabile. Ottenere un consenso informato scritto prima dell'intervento chirurgico.
- Per tutti operati pazienti epilettici eseguire una vasta work-up preoperatorio compreso l'esame neurologico, valutazione neuropsicologica, EEG di superficie, e di neuroimaging (risonanza magnetica e, a volte 18 FDG-PET scansione; Figura 1A), seguita da post-chirurgica esame istologico del tessuto asportato (Figura 1B) . NOTA: L'intervento chirurgico è indicato quando le diverse esplorazioni localizzare allo stesso modo la zona delle crisi e quando i benefici della sua rimozione supera i rischi chirurgici.
- Chirurgia
- Maifarmaci antiepilettici ntain pre-operatorio. Eseguire chirurgia in anestesia generale: induzione con sevoflurano inalato (6% Rapporto consegnato e 100% Frazione inalazione di O 2), intra sufentanyl venosa (0,3 mg / kg) e antracurium (0,5 mg / kg), seguita da mantenimento con intra sufentanyl venosa (0,5 mg / kg / ora) e sevoflurano per via inalatoria (1 MAC).
- Utilizzare un sistema neuronavigazione per consentire una localizzazione precisa della corteccia lesionata (Figura 1C). Dopo l'incisione cutanea, eseguire un foro cranico nell'osso seguita da una craniotomia con un alto trapano fuoriuscita. Elevare delicatamente il lembo osseo, e aprire la dura madre con le forbici (Figura 1D).
- Utilizzare ultrasuoni intra-operatoria per facilitare l'identificazione della corteccia anormale e strumentario microchirurgico e un aspiratore ad ultrasuoni sotto il microscopio operatorio.
- Coagulazione e tagliare il piano di pio-aracnoidea secondo i limiti sulcal. Utilizzare dissezione subpiale per rElease corteccia dalla pia intorno alla zona lesionata.
- Tagliare la materia bianca sotto la corteccia anormale effettuare un pezzo "in massa" resezione, risparmiando il più possibile la vascolarizzazione. Evitare la manipolazione traumatica della corteccia.
- Tagliare una fetta dello spessore di 1 cm dal tessuto resecato lungo una direzione ortogonale alla superficie piale, compreso il fondo del solco e la corteccia transitorio.
2. artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) per Slice preparazione, incubazione e Registrazione
- ACSF per la preparazione fetta
- Preparare 1 L di base di saccarosio-ACSF 7,8, contenente (in mM): 250 saccarosio, 3 KCl, 25 NaHCO3, 10 D-glucosio, 1 CaCl 2, 10 MgCl 2; sciogliere questi sali in acqua deionizzata e ossigenare la soluzione con carbogeno per almeno 10 min.
- Mettere ~ 700 ml di saccarosio ACSF a -80 ° C per 50-60 minuti (o -150 ° C per 15-20 min). Tenere il resto delsoluzione sotto ossigenazione nel ghiaccio. NOTA: Il ACSF per la preparazione fetta può essere conservato a 4 ° C; in questo caso, aggiungere CaCl2 e MgCl2 il giorno dell'esperimento, prima di raffreddarlo.
- ACSF per la fetta di incubazione e la registrazione
- Preparare almeno 3 L di registrazione ACSF 7,8, contenente (in mM): 124 NaCl, KCl 3, 26 NaHCO3, 10 D-glucosio, 1.6 CaCl 2, 1.3 MgCl 2; sciogliere questi sali in acqua deionizzata e ossigenare la soluzione con CarboGen. Prima di aggiungere MgCl 2, mantenere un po 'ACSF di effettuare registrazioni in 0 Mg 2+ ACSF. NOTA: Il ACSF incubazione / registrazione può essere conservato a 4 ° C; in questo caso, aggiungere CaCl2 e MgCl2 il giorno dell'esperimento.
3. apparecchiature per la fetta di incubazione e Registrazione
- Camera di Interfaccia per fetta di incubazione
- Utilizzare una camera fetta cervello per mantenere fette ex vivo vivente </ Em> in modalità interfaccia. NOTA: La camera è composta da una sezione inferiore, che contiene il riscaldamento e gli elementi sensori e un gorgogliatore ceramica e viene riempita con acqua distillata, ed una parte superiore, dove le fette poggiano su un foglio di tessuto lente nella zona pianeggiante il centro della camera (Figura 2A - B).
- Utilizzare due tubi separati fini di PTFE, attraverso il quale il preoxygenated ACSF entra nella camera. NOTA: I tubi spirale in acqua riscaldata e raggiungono la parte superiore della camera; allora la soluzione esce tramite azione capillare salviette, che trasmette la soluzione nei pozzetti di uscita.
- Collegare i tubi PTFE della camera di interfaccia per una pompa peristaltica, per consentire perfusione continua delle fette con il mezzo preoxygenated.
- Mantenere alta la tensione di ossigeno da ossigenante con carbogeno (95% O 2 e 5% CO 2) attraverso il gorgogliatore di ceramica. NOTA: Questa miscela di gas riscaldato e inumidito raggiunge lasezioni nella parte superiore della camera attraverso appositi fori.
- Mantenere la temperatura nella parte superiore della camera collegando la camera ad un regolatore di temperatura, attraverso un cavo doppio attacco speciale, avente un connettore per l'elemento riscaldante camera ed un sensore di temperatura esterno ad una estremità. Posizionare il sensore vicino le fette di controllare la temperatura durante tutto l'incubazione (Figura 2C).
- Registrazioni di array multi-elettrodo
- Utilizzare planari array multi-elettrodo con 120 elettrodi di nitruro di titanio (30 micron di diametro) isolati con nitruro di silicio ed elettrodo di riferimento interno, disposti in una matrice di 12 x 12 con 200 micron da centro a centro di spaziatura. NOTA: Altre configurazioni con differente diametro dell'elettrodo e la spaziatura sono possibili. In particolare, il chip MEA può essere allargata per campionare grandi fette di tessuti umani.
- Acquisire segnali elettrici a 10 kHz con un sistema MEA2100-120 (pre e fiamplificatore ltro con l'acquisizione integrata dei dati e convertitore analogico-digitale, la risoluzione dei dati a 16 bit, range di tensione di ingresso e la larghezza di banda regolabile via software) attraverso un software dedicato (MC_Rack). NOTA: Il headstage MEA2100 è dotato di una piastra metallica per il fissaggio dell'elemento perfusione riscaldabile mediante supporti magnetici, per perfusione continuamente le fette durante la sessione di registrazione.
- Tenere il tessuto verso il basso sul MEA da un piccolo ancoraggio di platino casalingo, che assicura un buon accoppiamento elettrico tra la fetta e gli elettrodi.
4. Preparazione della Camera di interfaccia e strumenti per la dissezione e affettare
- Camera di Interfaccia
- Riempire la parte inferiore della camera di interfaccia con acqua distillata. Assicurarsi che il livello dell'acqua immerge completamente l'elemento riscaldante ed è da 2 a 4 mm sotto la giunzione tra la parte inferiore e superiore della camera. Controllare il livello di tutti i giorni prima di accendere il riscaldamento,al fine di evitare danni dell'elemento riscaldante.
- Collegare la camera ad una fonte carbogeno, dotato di un regolatore di flusso secondario per regolazioni fini di pressione del gas.
- Tagliare un foglio di tessuto per obiettivi al fine di adattare la zona pianeggiante della camera fetta, e posizionarlo vicino ai tubi di soluzione di ingresso, per permettere la fuoriuscita di bolle dalla linea di ingresso prima di raggiungere le fette.
- Tagliare due pezzi di filo di cotone filamento finché il pezzo di tessuto dell'obiettivo, e posizionarle lungo i principali lati della zona piana della camera. NOTA: Questo aiuta a sollevare leggermente il livello della soluzione nella camera di perfusione.
- Impostare la portata della pompa peristaltica a 1 ml / min e attivare la pompa.
- Avviare ossigenazione dell'acqua nella parte inferiore della camera.
- Impostare la temperatura del regolatore di temperatura a 37 ° C e accenderlo. Coprire la parte superiore della camera di interfaccia con un pezzo di parafilm e attendere almeno 30 minuti per la temperatURE per aumentare e stabilizzare.
- Strumenti per la dissezione e affettare
- Preparare un kit di dissezione costituito da due pinza sottile, una spatola, un piccolo cucchiaio e una lama; due capsule di Petri in vetro, due pennelli e colla cianoacrilato.
- Impostare i parametri del vibratome: spessore 400 micron; frequenza, 70-90 Hz; ampiezza, 0,9-1 mm, velocità di 0,1 mm / sec.
5. corticale Fetta Preparazione umano
- Rimuovere il ACSF base di saccarosio-da -80 ° C congelatore e mescolare in modo da ottenere una sorta di granita. Ossigenare con CarboGen, mettere ~ 250 ml in una bottiglia di vetro e conservarlo in una bottiglia di Dewar pieno di ghiaccio, mentre andando in sala operatoria dell'ospedale per ottenere il tessuto. Nel frattempo, tenere il resto a -20 ° C.
NOTA: Durante l'intervento, il neurochirurgo analizza un piccolo blocco di tessuto corticale. Subito posizionare il campione in ghiacciata saccarosio ACSF per il trasferimento al laboratorio. - Mantenere il tempo necessario per il trasferimento dall'ospedale al laboratorio ad un massimo di 30 min. In laboratorio, prendere la ACSF ossigenato a base di saccarosio-out di -20 ° C freezer, mescolare di avere una granita, riempire una capsula di Petri e la vasca del buffer vibratome e iniziare ossigenante entrambi con CarboGen. Estrarre con attenzione il pezzo di tessuto umano dalla bottiglia con un cucchiaio e metterlo nella capsula di Petri (Figura 2D).
- Utilizzando le pinze, rimuovere con attenzione i coaguli di sangue, i vasi e le meningi per evitare resistenza durante affettare. Rimuovere le meningi, consistente nella pia-materia, a partire dai lati del blocco di tessuto, facendo attenzione a non danneggiare la superficie corticale. Con una lama, tagliare un lato del tessuto per ottenere una superficie piana, che sarà incollato sulla piastra campione vibratome. NOTA: Le meningi, consistenti nella pia-materia, vengono rimossi a partire dai lati del blocco di tessuto, facendo attenzione a non danneggiare la superficie corticale.
- Se il blocco di TiSSUE è più grande della camera di MEA, tagliare un pezzo di dimensioni appropriate prima di incollare sul piatto campioni (Figura 2E).
- Incollare il tessuto in modo da ottenere fette corticali trasversali, metterlo nella vasca del buffer e tagliare 400 micron fette spesse a bassa velocità (0,1 mm / sec) (Figura 2F).
- Tagliare pezzi di tessuto lenti con dimensioni di sezione; con una spatola e una spazzola, trasferire le fette su questi tessuti lenti e incubare nella camera di interfaccia a 37 ° C per almeno 1 ora prima della registrazione (Figura 2G - I) a partire. Continuamente memorizzare le fette nelle stesse condizioni fino al momento dell'uso. NOTA: Mettere le fette su carta obiettivo è un passo importante per facilitare sia la perfusione del lato inferiore delle fette e la rimozione delle fette dalla camera di interfaccia prima di registrare.
- Durante il trasferimento le fette sul tessuto dell'obiettivo, gestirle con molta attenzione, evitando di toccare l'area strato corticale conla spazzola.
- Preparare le fette uno alla volta e trasferire immediatamente ciascuno di essi alla camera di interfaccia, al fine di garantire il corretto apporto di ossigeno e temperatura; tagliare il blocco di tessuto asportato il più rapidamente possibile.
6. Preparazione del programma di installazione MEA per Recordings
- Inserire il sistema di perfusione ad una pompa peristaltica ed il sistema MEA a un computer. Ossigenare il ACSF registrazione. Inserire un chip MEA vuoto all'interno dell'amplificatore.
- Impostare il regolatore di temperatura per il riscaldamento dell'elemento cannula raggiungere 37 ° C nella camera di MEA e iniziare la perfusione a 5-6 ml / min. NOTA: Di solito è necessario impostare la temperatura di 3-4 ° C superiore a quella desiderata, a seconda della temperatura ambiente e della portata.
- Controllare la temperatura nella camera MEA con una multa termometro, ponendo così il più vicino possibile al centro, senza toccare la superficie degli elettrodi.
- Avviare la registrazione software e verificare che tutti gli elettrodi MEA siano ben collegati e che non c'è alcun rumore a causa di perfusione.
- Inizia MEA_Monitor per verificare il funzionamento della tabella fotocamera.
7. Trasferimento di una fetta dalla camera Interfaccia MEA Chip per la registrazione
- Versare un po 'riscaldato registrazione ACSF in una capsula di Petri di vetro; con una pinza, prendere una fetta dalla camera di interfaccia, afferrando attraverso il panno per lenti, e metterlo nella capsula di Petri. Staccare con cautela la fetta dal tessuto. Se il livello della soluzione nella camera di interfaccia è accuratamente regolata durante il tempo di incubazione, la fetta si stacca dal tessuto lenti solo immergendo nella soluzione; altrimenti, usare uno spazzolino per facilitare il distacco.
- Riempire un chip MEA con qualche ACSF e con una spatola, trasferire la fetta in esso. Con una pipetta Pasteur di plastica, rimuovere delicatamente la soluzione per rendere la fetta aderire sulla superficie degli elettrodi e tenerlo in posizione con un anch di platinoo. Aggiungere 1 ml di ACSF registrazione, posizionare il chip MEA all'interno dell'amplificatore e inizia a perfusione in 5-6 ml / min (Figura 2J - L).
- Controllare la posizione fetta su l'area di registrazione MEA utilizzando MEA_Monitor, regolare, se necessario, al fine di registrare dagli strati corticali e scattare una foto. Avviare la registrazione.
Representative Results
La registrazione dell'attività fetta corticale umano inizia mentre perfusione del tessuto normale con ACSF registrazione (come descritto in precedenza) 7,8. In questa condizione, quando il tessuto è ben conservata durante l'intervento e successivamente durante il trasferimento del tessuto dalla preparazione ospedaliero e fetta, si può osservare attività spontanea, in forma di piccoli eventi interictali simili, identificati da piccoli gruppi di elettrodi MEA. Scarichi interictale simile consistevano in un campo potenziale, di solito bifasico, comprendente una brusca deviazione negativa iniziale, raggiungendo decine di microvolt, seguita da un'onda più opposto durata diverse decine di millisecondi. Attività veloci più elementi sono di solito incorporati nel potenziale di campo soprattutto nella parte iniziale. Un esempio rappresentativo di attività interictale come è illustrato nella Figura 3Aii, dove viene mostrata la traccia registrata da un elettrodo MEA.
Per registrare crisi epilettiche da invitro fettine corticali umane, è necessario perfusione loro con un ACSF "epilettogena", in cui Mg 2+ è assente e K + viene portata a 6 mM, per aumentare l'eccitabilità del tessuto 1 (l'aumento di K + da 3 a 6 mM da sola non è sufficiente per indurre convulsioni, dati non mostrati). Una volta che la perfusione con 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF è iniziata, l'attività di fette corticali aumenta gradualmente e la prima crisi compare entro 15 a 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, da 5 pazienti; la figura 3 Ai ). Abbiamo ricordato attività accessuale simile, come mostrato in figura 3, nel 75% dei pazienti testati e 66,7% di tutte le sezioni registrate.
Attività epilettiche sono registrati da elettrodi adiacenti del chip MEA, e il confronto delle dinamiche di insorgenza di potenziali eventi di campo permette di studiare il loro sito di genesi e propagazione. Un sequestro rappresentante registrata da una fetta di ronziouna corteccia cerebrale con il sistema MEA è mostrato nella Figura 3B (una traccia rappresentativa di un sequestro registrato da un singolo elettrodo MEA è mostrato in maggiore risoluzione temporale in figura 3 AIII). Si noti che il sequestro è registrata da quasi tutti gli elettrodi del chip MEA, indicando così che è in grado di propagare a una grande area corticale. Inoltre, guardando le singole tracce registrate da ciascun elettrodo, è possibile osservare la propagazione progressiva del sequestro di tutti i tessuti: infatti, inizia prima nella zona corticale che copre la metà destra della matrice di elettrodi, e si estende gradualmente l'area che copre la metà sinistra (.. i e, confrontare tracce di elettrodo L6 e B6; Figura 3B).
Figura 1: Una displasia corticale un. d la sua rimozione chirurgica di tipo A Taylor focale displasia corticale (freccia bianca) incorporato in un lobo solco frontale sinistro è visualizzato sul preoperatoria RM (A), e successivamente confermato da chinasi etichettatura esame istologico (B) MAP; barra della scala: 200 micron) che mostra un dyslamination corticale, i neuroni anormali e una traccia sui neuroni con una migrazione incompleta nella sostanza bianca in basso. Durante l'intervento chirurgico, la displasia è localizzata in base ai dati MRI con sistema neuronavigazione (C). Visualizzazione del giro contenenti la displasia durante l'intervento chirurgico (D).
Figura 2:. Attrezzature e procedure per la preparazione fetta corticale umano Una camera interfaccia viene utilizzata per mantenere le fette corticali umani ex vivo (A); Le fette di riposo su un foglio di tessuto lente nella zona pianeggiante nella parte superiore della camera (B), in cui un sensore di temperatura (C, sinistra), collegato ad un regolatore di temperatura (C, destra, sopra) attraverso un doppio Cavo ended (C, a destra, in basso), è posto a mantenere 37 ° C nel corso del tempo fetta di incubazione. Una volta ottenuto, posizionare il blocco resecato di tessuto in una capsula di Petri riempita con ACSF base di saccarosio-ghiacciata (D) e rimuovere coaguli sanguigni, vasi e meningi, per facilitare il taglio. Se il blocco di tessuto è più grande di camere MEA, isolare un pezzo di dimensioni adeguate con una lama (E) e la colla sul piatto portacampione vibratome (F). Tagliare 400 micron fette spesse e con l'aiuto di una spatola (G) trasferirle su pezzi di tessuto lente (H) e incubare nella camera di interfaccia (I). Prima di registrare, remove la lente tessuto immergendo la fetta in una capsula di Petri riempita con ACSF e trasferirlo ad un ACSF riempito di chip MEA con una spatola (J). Rimuovere la soluzione di lasciare la fetta aderire sulla MEA (K) e mantenerlo in posizione utilizzando un ancoraggio platino. Posizionare il MEA dell'amplificatore (L), avviare perfusione e la registrazione.
Figura 3: registrazioni MEA di crisi epilettiche in fettine corticali umani (A) Una traccia rappresentante dell'attività fetta corticale umana registrata da un elettrodo di MEA è come da tabella i.. In presenza di normale ACSF, è possibile osservare l'attività interictale simile spontanea (piccolo rettangolo grigio, ingrandita Panel II); poi, quando la perfusione con 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF è iniziata, la prima seizure appare dopo un minuto di ritardo ~ 15 ed è seguito da altri eventi a 2-3 minuti di intervallo. Panel III mostra il sequestro nel grande rettangolo grigio nel pannello di I con una scala ingrandita. La traccia blu illustra uno zoom dell'attività, come indicato dalla linea blu e freccia. Pannello iv) mostra i dati illustrati nel pannello iii) con filtro passa alto a 250 Hz, che rivelano l'attività più unità in caso di zoom (traccia blu). (B) Registrazione Rappresentante di un sequestro in presenza di 0 Mg 2+ 6 K mm + ACSF da tutti gli elettrodi MEA. Ogni quadrato rappresenta un elettrodo di 12 x 12 serie MEA e mostra una finestra di tempo di 80 sec; la linea tratteggiata indica la posizione della superficie corticale relativamente alla matrice MEA.
Discussion
Epilessia farmacoresistente è una condizione rara, che può essere esplorato in tessuti umani in vitro. Ciò consente lo studio corteccia umana epilettica, che visualizza difetti specifici che sono solo parzialmente riprodotte in modelli animali. Il metodo qui descritto consente la preparazione e la registrazione dei tessuti post-operatori umani ex vivo con la vitalità cellulare conservato e reti in modo che essi spontaneamente producono attività epilettiche. Mantenendo attività simili rispetto a quelli registrati in vivo è fondamentale per studiare i meccanismi di genesi di attività patologiche. Inoltre, tali metodi permettono di esplorare i tessuti umani e di evitare modelli non perfetti animali della malattia. Tuttavia, lo studio dei tessuti umani richiede la sincronizzazione tra neurochirurghi e il laboratorio sperimentale. Il trasporto dei tessuti richiede una cura specifica di non essere traumatico. Inoltre, sia la quantità di campione e tessuti è limitata. Infine, l'accesso ai tessuti di controllo adeguati è il main preoccupazione. Con questa preparazione, i tessuti post-operatorie producono spontaneamente gli scarichi interictali-come nel normale ACSF 7,8. Eventi ictale-simili possono anche essere raggiunta in modificato, ACSF proconvulsivanti in modo che i meccanismi di sequestro iniziazione e di passaggio dallo stato interictale a crisi epilettiche possono essere studiate.
Tessuto umano può essere mantenuta valida per un massimo di 10 ore in condizioni di interfaccia. Fette sono stati considerati vitali quando più elementi o campo di attività potenziali sono state osservate spontaneamente e quando tali attività sono state evocate, aumentando l'eccitabilità attraverso l'aumento di potassio extracellulari e / o diminuzione di magnesio. Anche se la variabilità dell'attività si verifica, probabilmente riflettendo le differenze di patologie e aree corticali, abbiamo esplorato le caratteristiche epilettogene di un tessuto solo in fette sani mostrano interictale spontanea ed evocata scarichi ictali. Per salvaguardare la vitalità e l'attività del tessuto, una camera interfaccia è utilizzata per memorizzare tegli fette a 36-37 ° C per il recupero prima della registrazione con il sistema MEA. Infatti, molti gruppi hanno dimostrato chiaramente i vantaggi del sistema di memorizzazione basato interfaccia rispetto allo stoccaggio becher standard e l'importanza della temperatura per il mantenimento dell'attività di rete come onda increspature taglienti spontanee o colinergici indotta oscillazioni 9,10. Stoccaggio Interfaccia di fette è stato precedentemente utilizzato per registrare l'attività epilettica da dell'ippocampo umano e fette subicular 1,11. Con la tecnica MEA corrente, dopo il periodo di recupero affettatura in condizioni di interfaccia dai, l'attività di rete viene registrato in condizioni sommerse, in presenza di elevata portata (5-6 ml / min) a 37 ° C, con il sistema MEA. Il diametro ridotto (1,8 cm) di circuito integrato MEA, che delimita una piccola camera a volume (<1,5 ml), insieme con la portata aumentata, aumenta il rifornimento di ossigeno della fetta, che è stato dimostrato essere un fattore critico per spontanea e PHArmacologically indotta da attività di rete 9,10. Inoltre, la ridotta quantità di circolante ACSF facilita test farmacologici.
La procedura di taglio è comunque un trauma per i tessuti 12. Sia l'architettura neuronale e cloruro omeostasi sembrano essere perturbato alla superficie del tessuto (50 micron). L'origine delle attività registrate a scarti di MEA, che campione di tessuto per lo più superficialmente, senza penetrazione in profondità, può derivare da aree traumatizzate. Tuttavia, i nostri dati mostrano che i potenziali di campo extracellulari identificati localmente sono registrati nella maggior parte degli elettrodi MEA e precedente lavoro mostrano che esse sono integrate in un 100 a 200 micron di distanza dal sito di registrazione 13, suggerendo che i sequestri registrati nella nostra preparazione è improbabile che siano prodotto da aree traumatizzate. Inoltre, in studi effettuati con elettrodi di tungsteno che consentono la penetrazione in profondità, le attività epilettici registrati nei tessuti umani sono similia quelli osservati nei pazienti epilettici 1,7,8.
Un altro limite del franco registrazione tessuto vivo è la rottura delle connessioni tra le diverse aree del cervello, limitando così neuromodulations dinamici. Questo potrebbe spiegare il motivo per cui in tale tessuto nessun evento ictale, come è registrato spontaneamente, ma richiede di essere attivato dalla manipolazione ionica o farmacologica stimolazione migliorare eccitabilità. Pertanto, in questo protocollo, attacchi simili sono indotti combinando una variazione K + extracellulare da 3 a 6 mm e una diminuzione di Mg 2+ esterno da 1,3 mM Mg 2 + -free ACSF, al fine di aumentare l'eccitabilità del tessuto e rimuovere il blocco del recettore NMDA-dipendente Mg 2+. Infatti, è già stato dimostrato che l'attività epilettiforme indotta in fettine di ippocampo e neocorteccia umana con Mg 2 + -free ACSF ricorda i sequestri elettrografiche registrati in vivo 14. Inoltre,è stato dimostrato che gli scarichi epilettiformi ottenuti in fette lobo temporale diventano resistenti anticonvulsivanti utilizzati clinicamente dopo esposizione prolungata a Mg2 + -free ACSF 15,16, fornendo così un modello per studiare attacchi simili farmacoresistenti in vitro.
MEA consentono la registrazione di entrambi i potenziali di campo, e le attività a più elementi costituiti in potenziali d'azione neuronali ex vivo. Così, MEA sono un potente strumento elettrofisiologico rispetto al EEG, che esplorano potenziali di campo generati dalle attività sincrone di gruppi neuronali in vivo, ma non dà accesso al singolo neurone comportamenti 17. Anche se microelettrodi più recenti in grado di registrare le attività a più elementi in vivo che consistono in potenziali d'azione neuronali, che sono invasivi, quindi il loro uso è per lo più limitato a scopi di ricerca durante le registrazioni intracraniche. In particolare, le registrazioni MEA rappresentano una tecnica di sceltadi studiare i modelli spazio-temporali di eventi epilettici, i meccanismi che controllano il sequestro insorgenza e la propagazione e l'azione di farmaci antiepilettici classici e nuovi. Sorprendentemente, per svelare i tipi di cellule e la base di segnalazione di scarichi epilettici, picco tecniche di ordinamento e la sperimentazione farmacologica deve essere combinata con tecniche di MEA. Anche se MEA possono dare accesso alle singole punte, non forniscono informazioni sulle proprietà sinaptiche e biofisici. In futuro, altre tecniche devono essere accoppiati alle registrazioni MEA, al fine di migliorare il comportamento cellulare di esempio, le attività di rete e segnalazione sinaptica. Per esempio, fluorescenza a dipanare neuroni o cellule gliali comportamento, e anche la dinamica di ioni, può essere combinato con MEA registrazioni. Ulteriori analisi istologica post hoc può anche rivelare alterazioni specifiche di tipi di cellule, proteine o recettori in modo che la posizione delle attività epilettici può essere correlata con riarrangiamenti specifici delstruttura nervosa. Il sistema MEA può anche essere incorporato in un patch-clamp set-up per correlare singole cellule o conduttanze con le attività della popolazione. In futuro, strumenti optogenetic potrebbero anche essere utilizzati, purché fette umani possono essere coltivati a lungo termine, interpretato per fette organotipiche, in modo che la trasfezione o infezione di specifici tipi cellulari possono essere eseguite.
Disclosures
Sponsorizzazione da sistemi multicanale è stato fornito per la produzione della pubblicazione video e accesso aperto.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da ANR (Programma Blanc Neuroscienze), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), Città di Parigi (Programma Emersione), INSERM e La Pitié Salpêtrière Hospital (contratto di ricerca traslazionale) per NR, da Neuropôle de Recherche Francilien (nerf) a ED, presso l'Université Pierre et Marie Curie UPMC (programma di convergenza) e presso l'Institut du Cerveau et à la Moelle epiniere (Parigi) di GH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
| 2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
| Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
| 6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
| MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
| Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
| Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
| Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
| MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
| Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
| Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
| Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
| Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
| Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
| Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |
References
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