Summary
Nós aqui descrevem como realizar gravações de matriz multi-eletrodo de tecido cortical epiléptico humano. Ressecção do tecido epiléptico, preparação e fatia de matriz multi-eletrodo gravações de eventos interictais e ictais são demonstrados em detalhes.
Abstract
Epilepsia, que afecta cerca de 1% da população, compreende um grupo de distúrbios neurológicos caracterizados pela ocorrência periódica de convulsões, que interrompem a função cerebral normal. Apesar do tratamento com fármacos antiepilépticos disponíveis atualmente visam as funções neuronais, um terço dos pacientes com epilepsia fármaco-são. Nesta condição, a ressecção cirúrgica da área do cérebro gerando convulsões continua a ser o único tratamento alternativo. Estudar tecidos epilépticos humanos tem contribuído para entender novos mecanismos epileptogênicas durante os últimos 10 anos. Na verdade, estes tecidos gerar descargas epilépticas interictais espontâneas, bem como eventos ictais induzida por farmacologicamente que podem ser gravados com técnicas de eletrofisiologia clássicos. Notavelmente, as matrizes multi-eletrodo (AMA), que são dispositivos microfabricados incorporação de um conjunto de microeletrodos espacialmente arranjados, oferecem a oportunidade única para estimular simultaneamente e registro pote campontials, bem como potenciais de múltiplos neurônios de diferentes áreas do tecido de ação. Assim AMA gravações oferecem uma excelente abordagem para estudar os padrões espaço-temporais de interictal espontânea e eventos do tipo convulsivas evocadas e os mecanismos subjacentes início e propagação das crises. Aqui nós descrevemos como preparar fatias corticais humanos a partir de tecido ressecado cirurgicamente e gravar com AAM interictais e ictais-like eventos ex vivo.
Introduction
A epilepsia é uma doença crônica em que as crises epilépticas, que são descargas estampados intermitentes que duram vários segundos para dezenas de segundos em (EEG) registros eletroencefalográficos associados com manifestações clínicas, interromper um estado interictal, caracterizada pela presença de descargas neuronais síncronas dezenas de milissegundos duradouras e chamou os eventos interictais um. Ele afecta aproximadamente 1% da população do mundo e, embora as convulsões são controlados em que a maioria dos pacientes, cerca de um terço das pessoas com epilepsia não mostram uma resposta adequada às drogas antiepilépticas 2. Nesta condição, chamada epilepsia fármaco e cujos mecanismos ainda precisam ser claramente identificados, a ressecção cirúrgica da parte específica do cérebro identificado como zona apreensão de início continua sendo a única alternativa de tratamento que dá um resultado positivo para os pacientes. Assim, os espécimes ressecados de cirurgia deu a oportuniopor- para estudar os mecanismos de descargas intercríticas e geração e propagação das crises, bem como pharmacoresistance sobre o tecido nervoso central humano viável ex vivo.
Multi-eléctrodo matrizes (AAM), que consiste de um arranjo de microeléctrodos distribuídos espacialmente, permitir que a estimulação simultânea e gravação de actividade electrofisiológica de vários locais do tecido, proporcionando assim uma abordagem excelente para estudar os padrões espaço-temporais da actividade espontânea e evocada . Esta técnica, aplicada pela primeira vez para acompanhar as mudanças no desenvolvimento de atividades de cultura de células neuronais 3 e depois adaptado para cerebral aguda e organotípico e fatias de medula espinhal 4-6, é actualmente considerada uma ferramenta valiosa eletrofisiológico.
O protocolo atual descreve como preparar fatias corticais humanos a partir de tecido ressecado cirurgicamente e gravar com AAM confiável ex vivo interictal e eventos apreensão semelhante destas fatias. Esta técnica proporciona, assim, uma forma de abordar os mecanismos básicos subjacentes atividades epilépticas iniciação, propagação e efeitos das drogas antiepilépticas, tanto em nível celular e de rede. Todos os procedimentos utilizados para obter, preparar, manter e gravar fatias humanos são aqui descritos em pormenor.
Protocol
NOTA: O protocolo aqui descrito segue as diretrizes do francês "Comitê Consultivo Nacional d'Ethique" e é declarada como uma atividade de coleta por INSERM.
1. A ressecção de Epilepsia Human Tissue
- Pacientes
- Obter o tecido cerebral de pacientes que sofrem de epilepsia de difícil controle. Obter um consentimento informado antes da cirurgia.
- Para todos operados pacientes epilépticos realizar uma extensa propedêutica pré-cirúrgica, incluindo exame neurológico, avaliação neuropsicológica, EEG de superfície, e de neuroimagem (ressonância magnética e, por vezes, 18 FDG-PET scan; Figura 1A), seguido pelo exame histológico pós-cirúrgica do tecido ressecado (Figura 1B) . NOTA: A cirurgia é indicada quando as diversas explorações localizar de forma semelhante a zona de início das crises e quando o benefício de sua remoção excede os riscos cirúrgicos.
- Cirurgia
- Maiantiepilépticos ntain pré-operatório. Realizar uma cirurgia, sob anestesia geral: a indução com sevoflurano inalado (taxa de 6% e 100% entregues inalado fracção de O 2), sufentanil intravenosa (0,3 ug / kg) e antracurium (0,5 mg / kg), seguido de manutenção com sufentanil intravenosa (0,5 ug / kg / h) e sevoflurano inalado (1 MAC).
- Usar um sistema de neuronavegação para permitir uma localização precisa do córtex lesionado (Figura 1C). Após a incisão da pele, realizar um furo da rebarba no osso seguido por uma craniotomia com uma broca de alta derramamento. Gentilmente elevar a retalho ósseo, e abrir a dura-máter com uma tesoura (Figura 1D).
- Use ultra-som intra-operatório para facilitar a identificação do córtex anormal, e instrumentos de microcirurgia e um aspirador ultra-sons sob o microscópio de operação.
- Coagular e cortar o avião pio-arachnoidal de acordo com os limites sulcamento. Use dissecção subpial para release o córtex da pia em torno da área lesionada.
- Corte a massa branca sob o córtex anormal para executar uma peça "em bloco" ressecção, poupando o máximo possível da vasculatura. Evite manipulação traumática do córtex.
- Cortar uma fatia de 1 cm de espessura para fora do tecido ressecado ao longo de uma direcção ortogonal à superfície pial, incluindo a parte inferior do sulco e no córtex de transição.
2. cefalorraquidiano artificial Fluid (ACSF) para Slice Preparação, Incubação e Gravação
- ACSF para a preparação fatia
- Prepare 1 L de sacarose com base em ACSF 7,8, contendo (em mM): 250 de sacarose, 3 de KCl, 25 de NaHCO3, 10 de D-Glucose, 1 CaCl 2, MgCl 2 10; dissolver estes sais em água desionizada e oxigenar a solução com carbogénio durante pelo menos 10 min.
- Coloque ~ 700 ml de sacarose ACSF a -80 ° C durante 50-60 minutos (ou -150 ° C durante 15-20 min). Manter o resto dosolução sob oxigenação no gelo. NOTA: O ACSF para a preparação fatia pode ser armazenado a 4 ° C; neste caso, adicionar CaCl2 e MgCl2 a dia da experiência, antes de se arrefecer lo.
- ACSF para incubação fatia e gravação
- Preparar pelo menos 3 L de gravação ACSF 7,8, contendo (em mM): 124 NaCl, 3 KCl, 26 de NaHCO3, 10 D-Glicose, 1,6 de CaCl2, 1,3 de MgCl2; dissolver estes sais em água desionizada e oxigenar a solução com carbogénio. Antes de adicionar MgCl2, manter algum ACSF para realizar gravações em 0 Mg 2+ ACSF. NOTA: O ACSF incubação / gravação pode ser armazenado a 4 ° C; neste caso, adicionar CaCl2 e MgCl2 no dia do experimento.
3. Equipamentos para Fatia de Incubação e Gravação
- Câmara de interface para a fatia de incubação
- Use uma câmara fatia do cérebro para manter fatias ex vivo vivendo </ Em> no modo de interface. NOTA: A câmara é composta por uma secção inferior, que contém o aquecimento e os elementos sensores e um borbulhador de cerâmica e é enchido com água destilada, e uma parte superior, onde as fatias descansar sobre uma folha de tecido da lente na área plana em o centro da câmara (Figura 2A - B).
- Usar dois tubos de PTFE finas separadas, através do qual o ACSF realizada pré-oxigenação entra na câmara. NOTA: Os tubos em espiral na água aquecida e atingir a parte superior da câmara; então a solução sai por meio de ação capilar com lenço de papel, que transmite a solução em poços de saída.
- Ligar os tubos de PTFE da câmara de interface a uma bomba peristáltica, para permitir perfusão contínua das fatias com a forma realizada pré-oxigenação.
- Manter a alta tensão de oxigénio por oxigenar com carbogénio (95% O 2 e 5% CO 2) através do borbulhador de cerâmica. NOTA: Esta mistura de gás aquecido e umedecido atinge ofatias na parte de cima da câmara, através de orifícios adequados.
- Manter a temperatura na parte superior da câmara, ligando a câmara a um controlador de temperatura, através de um cabo de duas extremidades especial, que tem um conector para o elemento de aquecimento da câmara e um sensor de temperatura externo numa das extremidades. Colocar o sensor perto das fatias para verificar a temperatura em toda a incubação (Figura 2C).
- Gravações de matriz multi-eletrodo
- Use planares matrizes multi-eletrodos com 120 eletrodos de nitreto de titânio (30 mm de diâmetro) isolados com nitreto de silício e eletrodo de referência interno, dispostos em uma matriz de 12 x 12 com 200 mm de espaçamento de centro a centro. NOTA: Outras configurações com diferente diâmetro do eletrodo e espaçamento são possíveis. Em particular, o chip MEA pode ser alargada de modo a provar maiores fatias de tecidos humanos.
- Adquirir sinais elétricos em 10 kHz usando um sistema MEA2100-120 (pré e fiamplificador ltro com a aquisição integrada de dados e conversor analógico-digital, resolução de dados de 16 bits, escala de tensão de entrada e largura de banda ajustável via software) através de um software dedicado (MC_Rack). NOTA: O headstage MEA2100 é dotado de uma placa metálica para fixação de elemento perfusão aquecido através de suportes magnéticos, para aspergir continuamente as fatias ao longo da sessão de gravação.
- Segure o tecido para baixo no MEA por uma pequena âncora platina caseiro, o que garante um bom acoplamento elétrico entre a fatia e os eletrodos.
4. Preparação de interface Câmara e Ferramentas para Dissecção e Slicing
- Câmara de interface
- Encher a secção inferior da câmara de interface com água destilada. Assegure-se que o nível de água mergulha completamente o elemento de aquecimento e é 2 a 4 mm abaixo da junção entre a parte inferior e superior da câmara. Confira este nível diariamente antes de ligar o aquecimento,a fim de evitar danos do elemento de aquecimento.
- Ligue a câmara a uma fonte de carbogénio, dotado com um regulador de fluxo secundário para ajustamentos finos da pressão do gás.
- Corte uma folha de tecido lente, a fim de ajustar a área plana da câmara de fatia, e posicioná-lo perto de tubos de solução de entrada, para deixar qualquer fuga bolha da linha de entrada antes de chegar às fatias.
- Corte dois pedaços de fio de algodão de cadeia, desde que o pedaço de tecido da lente, e posicioná-los ao longo dos principais lados da área plana da câmara. NOTA: Isso ajuda a aumentar ligeiramente o nível de solução de perfusão na câmara.
- Definir a taxa de fluxo da bomba peristáltica, a 1 ml / min e activar a bomba.
- Iniciar a oxigenação da água na parte inferior da câmara.
- Regule a temperatura do controlador de temperatura a 37 ° C e ligá-lo. Cobrir a parte superior da câmara de interface com um pedaço de parafilm e esperar pelo menos 30 min para a temperature para aumentar e estabilizar.
- Ferramentas para dissecção e corte
- Preparar um kit de dissecção consistindo de duas pinças de finos, uma espátula, uma pequena colher e uma lâmina; duas placas de petri de vidro, duas escovas, bem como cola de cianoacrilato.
- Defina os parâmetros do vibratome: espessura, 400 mm; freqüência, 70-90 Hz; amplitude, 0,9-1 mm, de velocidade: 0,1 mm / seg.
5. Human Cortical Slice Preparação
- Remover o ACSF à base de sacarose a partir de -80 ° C congelador e misturá-lo, a fim de se obter uma espécie de lama. Oxigenar com carbogen, colocar ~ 250 ml em um frasco de vidro e guarde-o num frasco de Dewar cheio de gelo, ao ir para a sala de cirurgia do hospital para obter o tecido. Nesse meio tempo, manter o resto a -20 ° C.
NOTA: Durante a cirurgia, o neurocirurgião disseca um pequeno bloco de tecido cortical. Coloque imediatamente a amostra em gelada sacarose ACSF para transferência para o laboratório. - Manter o tempo necessário para a transferência do hospital ao laboratório a um máximo de 30 min. No laboratório, pegue a ACSF oxigenado à base de sacarose fora do freezer -20 ° C, misturá-lo a ter uma lama, encher uma placa de Petri e bandeja de tampão do vibratome e começar a oxigenar tanto com carbogen. Retire cuidadosamente o pedaço de tecido humano a partir da garrafa com uma colher e colocá-lo na placa de Petri (Figura 2D).
- Usando a pinça, retire cuidadosamente a formação de coágulos sanguíneos, vasos e meninges para evitar a resistência durante o corte. Retirar as meninges, que consiste na matéria-pia, a partir dos lados do bloco de tecido, tendo cuidado para não danificar a superfície cortical. Com uma lâmina, cortar um lado do tecido para obter uma superfície plana, que vai ser colado na placa de amostras vibratome. NOTA: As meninges, que consistem em matéria-pia, são removidos a partir dos lados do bloco de tecido, tendo cuidado para não danificar a superfície cortical.
- Se o bloco de tissue é maior do que a câmara de MEA, corte um pedaço de dimensões apropriadas antes de colá-lo na placa de amostras (Figura 2E).
- Cole o tecido, a fim de obter fatias corticais transversais, colocá-lo na bandeja de tampão e cortar 400 mm de espessura em velocidade baixa (0,1 mm / seg) (Figura 2F).
- Corte pedaços de tecido lente com dimensões fatia; com uma espátula e uma escova, transferir as fatias nesses tecidos de lente e incubar-los na câmara de interface a 37 ° C durante pelo menos 1 hr antes de iniciar gravações (Figura 2G - I). Continuamente armazenar as fatias nas mesmas condições até à sua utilização. NOTA: Colocar as fatias em papel lente é um passo importante para facilitar tanto a perfusão da parte inferior de fatias ea remoção de fatias da câmara de interface antes de gravar.
- Ao transferir as fatias sobre o tecido lente, gerenciá-los com muito cuidado, evitando tocar a área da camada cortical coma escova.
- Preparar as fatias de um de cada vez e transferir imediatamente a cada um deles para a câmara de interface, a fim de garantir o fornecimento adequado de oxigénio e temperatura; cortar o bloco de tecido ressecado tão rapidamente quanto possível.
6. Preparação da instalação MEA para Gravações
- Ligue o sistema de perfusão a uma bomba peristáltica e o sistema de MEA a um computador. Oxigenar o ACSF gravação. Coloque um chip MEA vazio dentro do amplificador.
- Definir o controlador de temperatura para o aquecimento elemento de uma cânula para chegar a 37 ° C na câmara de MEA e começar a perfusão em 5-6 ml / min. NOTA: É geralmente necessário ajustar a temperatura de 3-4 ° C mais elevada do que o desejado, dependendo da temperatura ambiente e a taxa de fluxo.
- Verifique a temperatura na câmara de MEA com uma multa termômetro, colocando-o mais próximo possível do centro, sem tocar na área do eletrodo.
- Iniciar a gravação software e verifique se todos os eletrodos MEA estão bem conectados e que não há nenhum ruído devido à perfusão.
- Comece MEA_Monitor para verificar o funcionamento da mesa da câmara.
7. Transferência de uma fatia de interface Câmara de MEA Chip para Gravação
- Despeje um pouco aquecido gravação ACSF em uma placa de Petri de vidro; com uma pinça, pegue um pedaço de câmara de interface, agarrando-o através do tecido da lente, e colocá-lo na placa de Petri. Retirar cuidadosamente a fatia a partir do tecido. Se o nível da solução na câmara de interface é cuidadosamente ajustado durante o tempo de incubação, a fatia irá separar-se a partir do tecido da lente única, submergindo-a em solução; caso contrário, use um pincel pequeno para facilitar o desprendimento.
- Encher um chip de MEA com alguns ACSF e com uma espátula, a fatia transferir para ele. Com uma pipeta Pasteur de plástico, retire suavemente a solução para tornar a fatia aderir sobre a área do eletrodo e mantê-lo no lugar com um anch platinaou. Adicionar 1 ml de gravação ACSF, colocar o chip MEA no amplificador e começar a perfusão em 5-6 ml / min (Figura 2J - L).
- Verifique a posição da fatia na área de gravação do MEA usando MEA_Monitor, ajuste-a, se necessário, a fim de gravar a partir de camadas corticais e tirar uma foto. Iniciar a gravação.
Representative Results
O registro da atividade cortical fatia humano começa enquanto irrigando o tecido com ACSF gravação normal (como descrito anteriormente) 7,8. Nesta condição, quando o tecido é bem preservada durante a cirurgia e mais tarde, durante a transferência de tecido a partir da preparação do hospital e fatia, pode-se observar a actividade espontânea, sob a forma de eventos semelhantes a pequenas intercríticas, detectados a partir de pequenos aglomerados de eléctrodos de MEA. Descargas intercríticas-like consistiu em um potencial de campo, geralmente bifásica, que compreende uma deflexão negativa afiado inicial, atingindo dezenas de microvolts, seguido por uma onda mais longo oposto durando várias dezenas de milissegundos. Actividades multi-unidade rápidas são geralmente incorporado no potencial de campo, principalmente na parte inicial. Um exemplo representativo de actividade interictal-como é ilustrado na Figura 3Aii, onde o traço registado por um eléctrodo MEA é mostrado.
Para gravar as crises epilépticas de emvitro fatias corticais humanos, é necessária para perfundir-los com um ACSF "epileptogénica", em que está ausente Mg2 + e K + é aumentada para 6 mM, para aumentar a excitabilidade do tecido 1 (o aumento de K + de 3 a 6 mM por si só não é suficiente para induzir convulsões; dados não mostrados). Uma vez que a perfusão com 0 Mg 2+ 6 mM de K + ACSF foi iniciado, a actividade de fatias corticais aumenta gradualmente e a primeira convulsão aparece dentro de 15 a 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, a partir de 5 pacientes; Figura 3 Ai ). Nós evocado actividade ictal semelhante, como mostrado na Figura 3, em 75% dos pacientes testados e em 66,7% de todas as fatias gravados.
Atividades epilépticas são registrados a partir de eletrodos adjacentes do chip MEA, e comparação das dinâmicas de início de campo potenciais eventos permite estudar seu local de gênese e propagação. A apreensão representante gravado a partir de uma fatia de humum córtex cerebral com o sistema de MEA é mostrado na Figura 3B (um traçado representativo de uma convulsão gravado por um único eléctrodo MEA é mostrado em maior resolução temporal na Figura 3 Aiii). Note-se que a convulsão é gravado a partir de quase todos os eléctrodos do chip de MEA, indicando, assim, que é capaz de se propagar de uma grande área cortical. Além disso, olhando para os traços individuais gravadas de cada eletrodo, é possível observar a propagação progressiva da apreensão em todo o tecido: de fato, ele começa primeiro na área cortical que cobre a metade direita do conjunto de eletrodos, e gradualmente se espalha para a área que cobre a metade esquerda (.. i e, comparar os vestígios de L6 eléctrodo e B6; Figura 3B).
Figura 1: A uma displasia cortical. d sua remoção cirúrgica do tipo A Taylor displasia cortical focal (seta branca) encaixado em um sulco lobo frontal esquerdo é visualizado no MRI pré-operatório (A), e mais tarde confirmado por exame rotulagem quinase (B) MAP histológico; barra de escala: 200 mm), mostrando uma dyslamination cortical, os neurônios anormais e uma faixa de neurônios com uma migração incompleta na substância branca inferior. Durante a cirurgia, a displasia é localizada de acordo com os dados de ressonância magnética com um sistema de neuronavegação (C). A visualização do giro contendo a displasia durante a cirurgia (D).
Figura 2:. Equipamento e processo de preparação fatia cortical humano Uma câmara de interface é utilizada para manter fatias corticais humanos ex vivo (A); o fatias repouso sobre uma folha de tecido da lente na área plana na parte superior da câmara (B), em que um sensor de temperatura (C, esquerda), ligada a um controlador de temperatura (C, à direita, acima) por meio de um duplo cabo ended (C, direita, para baixo), é colocado para manter a temperatura de 37 ° C ao longo do tempo fatia de incubação. Uma vez obtido, colocar o bloco de tecido ressecado numa placa de petri cheia com ACSF gelado à base de sacarose (D) e remover coágulos sanguíneos, vasos e meninges, para facilitar o corte. Se o bloco de tecido é maior do que as câmaras de MEA, isolar um pedaço de dimensões apropriadas com uma lâmina (E) e colá-la na placa de amostras vibratome (F). Cortar 400 mm de espessura e com a ajuda de uma espátula (L) transferi-las em pedaços de tecido lente (H) e incubar-los na câmara de interface (I). Antes de gravar, remove o tecido do cristalino por submersão da fatia numa placa de petri cheia com ACSF e transferi-lo para um chip de MEA ACSF preenchido com uma espátula (J). Remover a solução para permitir que a fatia aderir sobre a MEA (K) e mantê-lo em posição usando uma âncora de platina. Coloque o MEA no amplificador (L), começar a perfusão e gravação.
Figura 3: MEA gravações de convulsões epilépticas em fatias corticais humanos (A) Um traço representante da atividade fatia cortical humano registado por um eléctrodo MEA é mostrada no painel i.. Na presença de ACSF normal, é possível observar a atividade interictal-like espontânea (pequeno retângulo cinza, ampliada no painel ii); em seguida, quando a perfusão com 0 Mg 2+ 6 mM de K + ACSF foi iniciado, o primeiro seizure aparece depois de um ~ 15 min de atraso e é seguido por outros eventos no intervalo de 2-3 min. Painel III mostra a apreensão no grande retângulo cinza no painel i com uma escala ampliada. O traço azul ilustra um zoom da atividade, como indicado pela linha azul-e-flecha. Painel iv) mostra os dados ilustrados no painel iii) high pass filtradas em 250 Hz, que revelam atividade-unidade de multi quando ampliada (traço azul). (B) gravação Representante de uma convulsão na presença de 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF de todos os pólos da MEA. Cada quadrado representa um eletrodo de 12 x 12 matriz de MEA e mostra uma janela de tempo de 80 seg; a linha pontilhada indica a posição da superfície cortical relativamente à matriz de MEA.
Discussion
Epilepsia fármaco é uma condição rara, que pode ser explorada no tecido humano in vitro. Isto permite estudar córtex humano epiléptico, que exibe defeitos específicos que são apenas parcialmente reproduzidas em modelos animais. O método aqui descrito permite a preparação e gravação de tecidos humanos no pós-operatório ex vivo com viabilidade e redes para que eles produzem espontaneamente atividades epilépticas celular preservada. Retenção de atividades semelhantes do que os registrados em vivo é crucial para estudar mecanismos de gênese das atividades patológicas. Além disso, tais métodos permitem explorar tecidos humanos e modelos animais para não evitar perfeitos da doença. No entanto, estudo de tecidos humanos requer sincronização entre neurocirurgiões e laboratório experimental. Transporte de tecidos requer cuidados específicos para não ser traumático. Além disso, tanto a quantidade da amostra de tecido e é limitada. Finalmente, o acesso aos tecidos de controlo adequadas é o main preocupação. Com esta preparação, os tecidos pós-operatórias produzir espontaneamente descargas interictais-like em ACSF normal de 7,8. -Ictais eventos como também pode ser atingida em modificado, ACSF proconvulsivantes de modo que os mecanismos de iniciação e apreensão de transição para o estado interictal convulsões podem ser investigadas.
Tecido humano pode ser mantido viável por até 10 horas em condições de interface. As fatias foram considerados viáveis quando atividade ou campo de potencialidades multi-unidades foram observados de forma espontânea e quando essas atividades foram evocados pelo aumento da excitabilidade através de aumentos de potássio extracelular e / ou diminuição de magnésio. Embora a variabilidade da atividade ocorre, provavelmente refletindo diferenças em patologias e áreas corticais, exploramos as características epileptogênicas de um tecido só em fatias saudáveis mostrando interictal espontânea e evocada descargas ictais. A fim de preservar a vitalidade e a actividade do tecido, numa câmara de interface é utilizada para armazenar tele corta a 36-37 ° C para a recuperação antes de gravar com o sistema MEA. De facto, vários grupos demonstraram claramente as vantagens do sistema de armazenamento com base em comparação com interface de armazenamento copo padrão e a importância da temperatura para a preservação da actividade da rede, tais como espontâneos de onda ondulações acentuadas ou oscilações induzidas por colinérgicos 9,10. Armazenamento de interface de fatias foi previamente usada para gravar a atividade epiléptica do hipocampo humano e fatias subicular 1,11. Com a técnica actual MEA, após o período de recuperação de cortar em condições de interface, a actividade de rede é registrado em condições submersas, na presença de uma elevada velocidade de fluxo (5-6 ml / min) a 37 ° C, com o sistema de MEA. O diâmetro reduzido (1,8 cm) de chip de MEA, que delimita uma câmara de volume pequeno (<1,5 ml), juntamente com o aumento da taxa de fluxo, aumenta o fornecimento de oxigénio da fatia, que foi demonstrada ser um factor crítico para a espontânea e pharmacologically induzida por atividades de rede 9,10. Além disso, a quantidade reduzida de ACSF circulante facilita os testes farmacológicos.
O processo de corte é no entanto um traumatismo nos tecidos 12. Ambos arquitectura neuronal e homeostase cloreto parecem ser perturbados na superfície do tecido (50 um). A origem das atividades gravadas por chips de MEA, que amostra do tecido principalmente superficialmente sem penetração profunda, podem surgir a partir de áreas traumatizadas. No entanto, nossos dados mostram que os potenciais de campo extracelulares detectadas localmente são registrados na maioria dos eletrodos MEA e anterior trabalho mostram que eles estão integrados a uma distância do local de gravação de 13 100 a 200 mm, o que sugere que as apreensões registradas em nossa preparação não são susceptíveis de ser produzida por áreas traumatizadas. Além disso, em estudos realizados com eléctrodos de tungsténio que permitam a penetração profunda, as actividades epilépticos gravadas em tecidos humanos são semelhanteaos observados em doentes epilépticos 1,7,8.
Outro limite da ex vivo a gravação do tecido é o rompimento das ligações entre as diferentes áreas do cérebro, restringindo assim neuromodulações dinâmicas. Isto pode explicar porque em tal tecido nenhum evento ictal semelhante é registrado de forma espontânea, mas precisa ser desencadeada por manipulação iônica ou estimulação reforço farmacológico excitabilidade. Por conseguinte, neste protocolo, eventos convulsivos semelhante são induzidos através da combinação de uma mudança de K + extracelular de 3 a 6 mM e uma redução de Mg 2+ externo de 1,3 mM de Mg 2 + livre ACSF, a fim de aumentar a excitabilidade dos tecidos e remover Mg bloco receptor NMDA dependente 2+. Na verdade, ele já havia sido demonstrado que a atividade epiléptica induzida em fatias neocortical e do hipocampo humanos utilizando Mg 2 + livre ACSF lembra as convulsões eletrográficas gravadas in vivo 14. Além disso,demonstrou-se que as descargas epilépticas obtidos em fatias do lobo temporal tornar-se resistentes aos anticonvulsivos utilizados clinicamente após exposição prolongada ao Mg 2 + livre ACSF 15,16, proporcionando assim um modelo para investigar acontecimentos como fármaco-convulsivos-in vitro.
AAM permitir a gravação de ambos, potenciais de campo e atividades multi-unidade constituída em potenciais de ação de neurônios ex vivo. Assim, os AAM são uma poderosa ferramenta de eletrofisiológico em comparação com eletroencefalogramas, que explorar potenciais de campo gerados pelas atividades síncronas de conjuntos neuronais in vivo, mas não dão acesso ao único neurônio comportamentos 17. Apesar de microeletrodos mais recentes pode gravar em vivo actividades multi-unidade constituída em potenciais de ação de neurônios, eles são invasivos, assim que seu uso é mais restrito para fins de pesquisa durante as gravações intracranianos. Em particular, as gravações AMA representam uma técnica de escolhaestudar os padrões espaço-temporais de eventos epilépticos, os mecanismos que controlam o início e propagação das crises e da ação de fármacos antiepilépticos clássicos e novos. Notavelmente, a desvendar os tipos de células e base de sinalização de descargas epilépticas, spike técnicas de triagem e testes farmacológicos deve ser combinada com técnicas de MEA. Embora AAM pode dar acesso aos picos individuais, eles não fornecem informações sobre as propriedades sinápticas e biofísicos. No futuro, a outras técnicas deve ser acoplado a gravações da MEA, a fim de melhor comportamento celular exemplo, atividades de rede e sinalização sináptica. Por exemplo, imagens de fluorescência para desvendar neurônios ou células gliais comportamento, bem como a dinâmica de íons, pode ser combinada com AAM gravações. Além disso análise histológica post hoc pode também revelou alterações específicas de tipos de células, proteínas ou receptores, de modo que a localização das actividades epilépticos podem ser correlacionados com rearranjos específicos doestrutura nervosa. O sistema AAM também pode ser incorporado em um patch-clamp set-up para correlacionar as células individuais ou condutâncias com atividades de população. No futuro, as ferramentas Optogenetic também poderia ser utilizado, desde que as fatias humanos podem ser cultivadas a longo prazo, tal como realizada para fatias organotípicas, de modo que a transfecção ou infecção de tipos específicos de células pode ser realizada.
Disclosures
Patrocínio por sistemas multicanal foi fornecido para a produção da publicação de vídeo e acesso aberto.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações de ANR (Programa Blanc Neurociências), CRF (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), Cidade de Paris (Emergence Programa), INSERM e La Pitié Salpêtrière Hospital (contrato de investigação translacional) para NR, a partir de Neuropôle Recherche Francilien (NERF) para ED, da Université Pierre et Marie Curie UPMC (Programa de Convergência) e do Institut du Cerveau et la e Moelle epiniere (Paris) para GH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
| 2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
| Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
| 6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
| MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
| Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
| Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
| Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
| MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
| Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
| Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
| Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
| Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
| Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
| Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |
References
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays. Neuroscience Letters. 361 (1-3), 86-89 (2004).
- Sun, J. -J., Luhmann, H. J. Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1995-2004 (2007).
- Dossi, E., et al. Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System. Cerebral cortex. 23 (12), New York, N.Y. 2905-2922 (1991).
- Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks. The European journal of neuroscience. 15 (4), 671-683 (2002).
- Cohen, I., et al. On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (1126).
- Huberfeld, G., et al. Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy. The Journal of neuroscience. 27 (37), 9866-9873 (2007).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro. PLoS ONE. 4 (9), (2009).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
- Wittner, L., et al. The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro. Brain. 132 (11), 3032-3046 (2009).
- Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain. The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).
- Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts. Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).
- Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -G. Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro. Annals of neurology. 30 (4), 589-596 (1991).
- Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons. Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).
- Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants. Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents - EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
