Ce rapport décrit une méthode de mesure de l’activité larvaire de la drosophile à l’aide du moniteur d’activité de la drosophile TriKinetics. L’appareil utilise des faisceaux infrarouges pour détecter les mouvements d’un maximum de 16 animaux individuels. Les données peuvent être analysées pour représenter les paramètres de mouvement, y compris les vitesses et les positions des animaux dans les chambres d’essai.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les larves de drosophile sont utilisées dans de nombreuses études comportementales, mais il n’existe pas d’appareil simple pour mesurer les paramètres de base de l’activité larvaire. Ce protocole réutilise un instrument souvent utilisé pour mesurer l’activité des adultes, le moniteur d’activité de la drosophile TriKinetics (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) pour étudier l’activité larvaire. L’instrument peut surveiller les mouvements des animaux dans 16 tubes d’analyse en verre individuels de 8 cm, en utilisant 17 faisceaux de détection infrarouge par tube. Le logiciel d’enregistrement enregistre automatiquement les données sur un ordinateur, enregistrant des paramètres tels que le nombre de mouvements, l’heure de déclenchement des capteurs et la position des animaux dans les tubes. Les données peuvent ensuite être analysées pour représenter la locomotion globale et/ou la préférence de position, ainsi que d’autres mesures. Toutes les données sont facilement accessibles et compatibles avec les logiciels de base de représentation graphique et de manipulation de données. Ce protocole abordera l’utilisation de l’appareil, le fonctionnement du logiciel et l’exécution d’un test d’activité larvaire du début à la fin.
Introduction
L’utilisation de la drosophile comme outil génétique a transformé la connaissance scientifique des systèmes biologiques. Les larves de drosophile ont été utilisées dans une variété d’études, y compris la nociception1, le développement2 et comme modèle pour l’étude des gènes de maladies humaines3. L’activité de la drosophile englobe une gamme de comportements qui varient dans différentes conditions, y compris les températures2, l’exposition aux médicaments4 et entre différents génotypes. Pourtant, malgré l’utilisation importante de la larve comme organisme modèle, il n’existe pas de méthode simple et normalisée pour analyser l’activité larvaire. À l’heure actuelle, de nombreuses études sur la locomotion larvaire utilisent des logiciels d’analyse vidéo sophistiqués5. Bien que puissants, la complexité de ces outils automatisés peut décourager les laboratoires qui ne sont pas déjà équipés pour étudier la locomotion d’inclure l’analyse des paramètres d’activité informative dans leurs études. Dans d’autres méthodes non automatisées actuelles, telles que l’analyse du crawling de la grille, le mouvement est noté par un observateur humain, ce qui introduit la possibilité de subjectivité et limite le débit à un animal à la fois6-7. Une étude similaire a utilisé un test de rampement à 5 voies, qui a mesuré le temps qu’il fallait aux larves pour parcourir une certaine distance linéaire8. Dans de tels tests non automatisés, le déplacement est mesuré, mais cela ne tient pas compte du déplacement non linéaire entre les points de départ et d’arrivée. Comme nous le verrons ci-dessous, la méthode décrite ici tient davantage compte du mouvement réel des larves, est objective, facile à utiliser et offre un débit robuste.
Pour étudier facilement le comportement de l’activité larvaire sans compromettre la précision, l’efficacité ou le coût, cette méthode utilise le TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), un appareil souvent utilisé pour étudier l’activité des adultes. L’utilisation d’un seul appareil pour étudier l’activité des adultes et des larves est rentable et permet de comparer directement le mouvement des animaux à ces deux stades de la vie. Le système, doté du plus haut niveau de résolution du fabricant, utilise 17 faisceaux de détection infrarouge par tube de dosage, qui enregistrent l’activité larvaire lorsque les faisceaux du capteur sont brisés à l’intérieur des 16 tubes individuels. Le système enregistre ensuite automatiquement les informations enregistrées sur un ordinateur, les rendant disponibles pour être manipulées à l’aide d’un logiciel graphique de base. Les données obtenues représentent les faisceaux qui ont été brisés par des larves individuelles (qui peuvent être convertis en taux), le mouvement lorsqu’une larve reste dans un faisceau détecteur et la position des animaux dans les chambres d’essai pendant une période d’enregistrement (ce qui permet de calculer la préférence de position). Le système est efficace et relativement simple à utiliser, et met l’analyse de l’activité de base hautement reproductible à la portée de tout laboratoire étudiant les larves de drosophile.
Pour démontrer la puissance de ce test, des données sont présentées qui montrent son utilisation pour vérifier les différences d’activité résultant de températures ambiantes variables, ainsi qu’à travers la comparaison d’un mutant précédemment décrit comme hypoactif (IAV1)9 avec un contrôle largement analysé (w1118).
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Protocole
1. Préparation des larves
- Pour analyser une larve souhaitée pour la locomotion ou la préférence de positionnement, de grandir larves dans des conditions standard pour l'âge souhaité pour doser 10 à l'aide alimentaire à la mouche norme 11.
- Faites un filtre à mailles en étirant nylon sérigraphie de qualité maille sur un entonnoir. Fixez le maillage au niveau du col de l'entonnoir avec une bande élastique. Placez l'entonnoir dans un bêcher.
- Pour collecter des larves pour l'analyse, ramasser une spatule-plein de nourriture contenant la recherche de nourriture des larves de la bouteille de culture et laver avec de l'eau du robinet RT sur le filtre de maille, la collecte de larves individuelle directement à partir de la maille avec un pinceau 10.
2. Préparation d'Assay Tubes
- Pour se préparer à boucher les tubes à essai, faire bouillir avec soin un gel d'agar à 4% et verser dans un plat de Petri à une profondeur de 1,5 cm. Cela fournira une fiche pour chaque côté du tube lorsque l'animal est enfermé. La solution à 4% est suffisamment dense pour empêcher les larves de penetrating les bouchons.
- Veiller à ce que les tubes sont propres et claires avant l'insertion de larve. Si elles ne sont pas, cela peut bloquer les mouvements de cours d'enregistrement.
- Pour assurer larves ont suffisamment d'humidité pour le mouvement, préparer un flacon souple contenant une petite quantité d'eau chaude. Retourner le flacon, orienter soigneusement la sortie vers un évier et presser doucement pour expulser l'eau du tube de ramassage.
- Insérer la sortie de la bouteille dans le tube de dosage. Pressez la bouteille pour fournir de la vapeur d'eau dans le tube à essai jusqu'à ce qu'une fine couche de la condensation apparaît sur la paroi du tube. Vidéo 1 représente une larve se déplaçant dans un tube avec une quantité appropriée de l'humidité.
- Pour sceller la larve dans le tube, enlever le gel d'agar 1,5 cm d'épaisseur de la boîte de Pétri et placez sur une surface de grillage pour permettre aux flux d'air sous l'agar de sorte qu'un bouchon de gélose peut être inséré dans le tube. Appuyer sur une extrémité du tube à essai dans le gel deux fois pour insérer deux bouchons de gel dans une extrémité.
- Avec un paintbprécipiter, placer une larve dans le tube d'environ 1,5 pouces de profondeur et sceller le tube en appuyant sur la fin proche de la larve dans le gel d'agar. La pression résultante va forcer le second bouchon de gel de gélose à partir de l'extrémité opposée de l'animal et sceller l'intérieur du tube.
- Placer les tubes dans le dispositif MB5 multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM), et ajuster les positions des tubes de sorte que les animaux ne peuvent pas aller au-delà de la portée des capteurs.
- Pour veiller à ce que dosage tubes ne glissent pas hors du cadre de lecture infrarouge de l'appareil pendant le transport, maintenir le tube en place par la fixation d'un anneau de mastic autour de chaque tube où il est en contact de l'appareil d'enregistrement.
3. mesure de l'activité
- l'activité d'enregistrement dans un incubateur pour éviter des lectures erronées qui peuvent survenir en raison d'ombres, les lumières fluorescentes ou aux variations de température dans le laboratoire. Voir la figure 5 pour un agencement proposé du système.
- Définir un incubateur à 20 ° C (voir Figure 1). Pour éviter les faux enregistrements de perturbations dues à des sources lumineuses incandescentes pendant l'enregistrement, éteindre les lumières fluorescentes de pépinières et d'utiliser une source de lumière LED séparée lors de l'enregistrement dans l'incubateur. Effectuer un essai sans animaux pour assurer que les conditions d'éclairage ne déclenche pas aberrante capteurs. Il devrait y avoir pas de données de mouvement enregistrées après ce test.
- Permettre aux larves de acclimater à 20 ° C les paramètres de l'incubateur pendant 5 min avant le début de l'essai.
- Pour définir le système de DAM à intervalles d'enregistrement désirée (par exemple, 1 min), assurer le logiciel d'enregistrement du système DAM est téléchargé sur l'ordinateur hôte 12 et ouvrez le fichier du système de DAM avant de connecter la chambre d'enregistrement à l'interface Psiu.
- Pour définir la fréquence souhaitée d'enregistrement à laquelle les données seront sauvegardées, sélectionnez Préférences, puis cliquez dessus ou en dessous de l'option d'intervalle de lecture pour sélectionner différentes échelles de temps dans lequel les donnéesseront stockées. Par exemple, sélectionnez la lecture temps de pause de 1 sec à 1 h.
- Pour sélectionner le paramètre variable pour l'enregistrement de données, choisissez Préférences puis cochez les cases correspondantes dans la section Sortie type de données (comptes, mouvements, positions et vous habiterez, voir le tableau 1). Chaque paramètre fournit une analyse unique de l'activité des larves à l'intérieur du tube.
- Pour commencer l'enregistrement, connecter le moniteur à l'unité d'interface d'alimentation (de Psiu) en utilisant le câble CAB6 téléphonique. Connectez le Psiu à une prise de courant. Une lumière verte indiquera un branchement approprié.
- Connectez le Psiu par un câble Universal Serial Bus (USB) à un Macintosh ou PC sous Windows pour l'enregistrement de données. Ouvrez le programme DAM SystemMB1v6x sur l'ordinateur de démarrer automatiquement l'enregistrement de données.
- Après le temps de collecte souhaitée est terminée, sélectionnez Quitter, puis Quitter maintenant sur l'écran de l'activité de DAM; données seront ensuite automatiquement enregistrée sous Données système DAM. Prenez ce fichier de données (par exemple, surveiller 1) et faites glisser dans un dossier distinct. Cela permettra de stocker les données brutes à partir du logiciel de DAM afin qu'ils puissent être traitées par la suite.
4. Préparation des données pour le traitement (DAM FileScan)
- Pour traiter les données brutes en un format compréhensible ouvrir l'application DAM FileScan et sélectionnez Sélectionner le dossier des données d'entrée. Ensuite, choisissez le dossier de données et le fichier souhaité, et sélectionnez l'option de numérisation. Enfin sélectionner la longueur de bin à la période de lecture souhaitée. Ce sera d'organiser les données brutes en paramètres fixés par l'opérateur et le programme va rapporter les données recueillies dans cette gamme particulière.
- Sélectionnez le type de données de sortie à analyser le paramètre de mouvement souhaitée (nombre de moniteurs, se déplace, habitent). Dans le menu des lectures supplémentaires, sélectionnez somme dans le bac (ce qui est si la longueur du bac est plus grande que le système intervalle de lecture sélectionnée).
- Nommez le fichier de manière appropriée et économisez. Le fichier sera stocké dans le même emplacement que le dossier de l'étape 3.9.
- Afin de recueillir des mouvements moyens, processus, les données brutes générées par l'étape 4. Pour générer une table dans un tableur, ouvrez le fichier qui a été précédemment enregistrée (étape 4.3), et lorsque la fenêtre de l'assistant d'importation de texte apparaît, sélectionnez Terminer pour ouvrir les fichiers de données dans un format de tableur.
Remarque: Selon le type de données analysées, la feuille de calcul sera lu différemment. Typiquement pour mesurer se déplace du moniteur ou chefs d'accusation, la période de l'étude sera enregistrée numériquement, tandis que chaque tube individuel de lecture recevra une lettre désigné. Lors de la visualisation des données dans le tableur, KZ colonnes représentent les fentes pour tubes à essai de 1 à 16, respectivement. Les lignes représentent les points de données collectés. - Par exemple, si se déplace ont été recueillies pendant 20 min à 1 min d'intervalle, la moyenne des 20 lignes de calculer un nombre moyen de coups / minute et d'autres mesures.
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Résultats
La figure 1 montre les résultats d'une étude de réponse à la température de contrôle des larves de troisième stade larvaire, 1118 w, à l'aide du dispositif de surveillance pour détecter des différences dans la locomotion des larves à sept températures différentes. Les larves ont été lavées et placées dans le dispositif de l'activité de DAM comme décrit ci-dessus, et placé dans un incubateur réglé à la température désirée. L'appareil a ensuite été laissé à acclimater à l'en...
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Discussion
L'activité des larves de Drosophila est influencée par divers facteurs, y compris génotype 8, 13 l'âge et de la température ambiante 2. Bien que les méthodes vidéographiques puissants capables d'analyse très détaillée ont été développés par ceux qui étudient la locomotion 5, ce niveau de détail peut être superflu pour ceux qui souhaitent pour déterminer les paramètres de base de l'activité. La méthode décrite ici emploie un appareil qui est disponible dans de nom...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le NIH P20GM103643 à I. Meng.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Moniteur d’activité de la drosophile, multifaisceaux, 16 tubes, y compris les fils | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| pour le moniteur d’activité ; | TriKinetics Inc. ; | PSIU24 | |
| Tubes en verre 80 x 5 mm pour moniteur d’activité (100) | TriKinetics Inc. ; | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Logiciel d’acquisition de données pour Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | téléchargement gratuit | |
| du logiciel DAMFileScan 108x pour Macintosh | www.trikinetics.com | téléchargement gratuit | |
| du logiciel USB (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | téléchargement gratuit | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | téléchargement gratuit | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | ||
| Tampon anti-mouches | Genesee | 59-114 | surface pour le tri des mouches anesthésiées |
| Petit pinceau ; | Winsor & Newton | #2 ROUND | ou similaire, utilisé pour le tri des mouches anesthésiées |
| Maille de sérigraphie (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | La taille des pores utilisée dans ce protocole était de ~ 0,1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | |
| conservateur Éthanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | utilisé pour dissoudre Tegosept |
| 6 oz Bouteille à fond carré (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs » pour flacons anti-mouches en plastique | Genesee | 49-100 | |
| Flacons de drosophile, larges (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs pour flacons larges en plastique | Genesee | 49-101 | |
| Jaune Dégermé Semoule de Maïs | Médaille d’Or Drosophila | ||
| agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Levure de boulanger - Farine Red Star | King Arthur | 1270 | |
| Sucre cristallisé - Domino |
Références
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Réimpressions et autorisations
