In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle

Les tumeurs solides diffusent de trois façons principales: invasion directe, la propagation lymphatique, et la propagation hématogène. Cependant, il y a un quatrième moyen de propagation du cancer qui est souvent négligées, la diffusion le long des nerfs. Cancerous invasion neural (CNI) est un itinéraire bien connu de la propagation du cancer, en particulier dans les cancers de la tête et du cou, ¹ prostate ^{2, 3} et du pancréas. ^4-8 CNI se produit dans plus de 80% des individus avec adénocarcinome pancréatique, conduisant à la tumeur rétropéritonéale se propager à travers les nerfs coeliaque ganglionnaires. Ces cellules cancéreuses neurotrope ont une capacité unique à migrer vers unidirectionnellement le long des nerfs du système nerveux central (SNC). ⁹ Cette constatation suggère que le microenvironnement périneural peut être exploitée par des cellules cancéreuses, en fournissant des facteurs qui favorisent la croissance maligne.

L' un des rares modèles in vitro pour la recherche CNI est le ganglion de la racine dorsale (DRG) / modèle de cellules cancéreuses. Ce model est fréquemment utilisé pour étudier l'interaction paracrine entre les cellules stromales et les cancers de neurones. ^10-18 Dans ce modèle, les souris ou les lignées de cellules cancéreuses humaines sont cultivées dans une matrice extracellulaire (ECM) adjacent à la préparation de DRG en culture fraîchement dissociées.

Cet article vidéo montre l'application de CNI vitro dans des adénocarcinomes canalaires pancréatiques.

Quatre à six semaines d'âge C57BL femelle / souris CJ (Harlan, Jérusalem, Israël) ont été utilisés dans l'expérience selon l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des spécifications Laboratory Animal Care. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec Institutional Animal Care et l'utilisation Comité et le Département de la réglementation de l'agriculture.

1. récolte la moelle épinière

1. Euthanize la souris à l' aide d' une chambre de CO _2. Évitez la dislocation cervicale car elle pourrait causer des dommages aux racines ganglionnaires dues aux forces de cisaillement. A partir de là, effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles.
2. Faire tremper l'animal vers le bas avec 70% d'éthanol. Cette étape est importante pour la stérilisation et pour empêcher les cheveux de glisser à travers les organes internes.
3. Laissez la souris pour sécher l'éthanol. Empêcher tout contact de l'éthanol avec les organes internes dus à la neurotoxicité.
4. Après séchage de la souris, la position à l'aide d'épingles dans la position couchée(face cachée). Placez les broches sur chaque hindlimb et forelimb.
5. En utilisant des pinces, faire une incision médiane étendant craniocaudally du cou postérieur à la colonne lombaire. Ensuite, soulever des rabats dermiques bilatéralement en utilisant une pince et d'exposer le tissu sous-cutané.
6. Palper le crâne de la souris jusqu'à la jonction cranio. Avec des ciseaux perpendiculaires à l'animal, couper à travers les muscles cervicaux et la colonne vertébrale à la jonction cranio (le 7 ^ème vertèbre cervicale), en utilisant des pinces lourdes. Disséquer la colonne vertébrale caudale et exciser la colonne vertébrale avec des pinces lourdes jusqu'à atteindre le niveau lombaire (postérieur au niveau des membres).
7. Effectuer une transection caudale complète au niveau du rachis lombaire (5 ^e lombaire vertèbres) en utilisant des pinces lourdes.
8. Passez la souris sur (face). Il n'y a pas besoin de couvrir l'incision puisque la DRG est extraite des niveaux vertébraux inférieur et non pas du col.
9. Couper à la ligne médiane du cou à l'abdomen, rétracter lepeau latéralement et ensuite coupé pour ouvrir le péritoine.
10. Retirez les organes internes à l' intérieur du péritoine (foie, rate, du pancréas, de l' estomac et l' intestin grêle) en bloc. Ensuite, retirez les organes rétropéritonéaux (c. -à , les reins et le pancréas). Céphalique, ouvrez la paroi thoracique.
11. En utilisant des pinces et une lame chirurgicale, couper les côtes, en laissant 5 mm de côtes bilatéralement loin de la colonne vertébrale. A ce stade, la colonne vertébrale est séparée du reste du corps.
12. Laver la colonne vertébrale à partir du sang de froid (4 ° C) phosphate frais saline tamponnée (PBS) à deux reprises.

2. Isoler les ganglions rachidiens (DRG)

1. Utilisez un stéréomicroscope avec grossissement 4X.
2. Positionner la colonne vertébrale sur une plate-forme non absorbante non adhérente (Telfa / nylon). Placez la face de la colonne vertébrale à la même orientation cranio-caudale.
3. Retirez tous les muscles de la colonne vertébrale et les tissus conjonctifs. Utilisez les nervures comme un point de repère pour les nerfs comme ilsquitter la colonne vertébrale. Ribs protègent également les nerfs des outils chirurgicaux. Le DRG est situé au, thoraciques et lombaires sites cervicales des vertèbres.
4. Ensuite, à l'aide de ciseaux coupent le corps vertébral dans la ligne médiane et d'exposer la moelle épinière et les racines DRG par la rétraction latérale douce du corps vertébral.
5. Dans l'espace intercostal, suivre le nerf périphérique médiale le long de la nervure latérale du DRG.
6. Identifier le DRG. Il semble que le jaune d' 'œuf frit' couché sur le nerf.
7. Couper le nerf intercostal distale du DRG laissant 2-3 mm de nerf distal aux ganglions, pour être utilisé aux fins de rachat. Cette "queue" sera supprimé après la récolte.
8. Saisir le nerf en utilisant une pince. Pincer le corps DRG lui-même causer des dommages aux cellules neurales et doit être évitée.
9. L'approche de la DRG proximalement le long de son attachement à la moelle épinière, par son antérieur et racines postérieures.
10. Appliquer la rétraction douce à la DRG en tirant l'efférentes nerf (nerf intercostal souche) latéralement, et couper la partie antérieure et postérieure racines près de la DRG.
11. Gardez le DRG dans une boîte de Pétri 35 mm rempli de fraîcheur, de la glace DMEM froid additionné de 10% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine, 1% d'acides aminés non essentiels, et 1% pyruvate de sodium.

3. Implantation dans la boîte de Pétri

1. Effectuez les étapes suivantes sur la glace à l'aide des conseils pré-refroidi pipettes pour empêcher ECM solidification.
2. En vertu d'un stéréomicroscope à 2-4x grossissement, placez un verre plat de Pétri en bas de 35 mm sur une grille de papier.
   IMPORTANT: Les travaux sur la glace afin de maintenir l'ECM à l'état liquide. Créer un spot de 1 mm de diamètre (environ 20 ul) de l'ECM du facteur de croissance appauvri au centre de la grille.
3. Sous la visualisation directe, placez le DRG au centre de la tache d'ECM à proximité du fond du plat.
   Note: Les cellules cancéreuses utilisées dans ce protocole sont les cellules cancéreuses pancréatiques murins (KPC) established à partir d' échantillons de tumeurs fraîchement isolés de souris CPK comme décrit ailleurs ^19.
4. cellules de récolte 40.000 cancéreuses provenant de cultures confluentes, les laver une fois avec PBS, et les remettre en suspension dans 40 ul ECM sur la glace.
5. Sous la visualisation directe de la grille en utilisant une mesure de um stéréomicroscope 500 à chaque direction du DRG. À ce stade ensemencer lentement 10.000 cellules / 10 ECM ul. Utiliser un embout prérefroidi 2-10 ul d'injecter les cellules proches du fond plat, en évitant leur propagation dans la matrice ou le détachement de la matrice. (Figure 1).
6. Laissez le plat dans une hotte à flux laminaire pendant 10-15 min à se solidifier. Évitez le séchage de l'ECM.
7. ajouter lentement du DMEM, préparé comme indiqué plus haut, contre la paroi latérale de la plaque. Ajouter assez moyen pour couvrir l'ECM (environ 2 ml).
8. Mettre le plat de retour à l'incubateur à 37 ° C.
9. Remplacer le milieu avec un milieu frais le lendemain.
10. Remplacez le support tous les 2 jours. </ Li>

4. Acquisition de données, Time-lapse vidéomicroscopie

1. Au jour 7 après l'implantation, prendre le plat pour la microscopie de laps de temps. Notez que certaines cellules peuvent nécessiter l'acquisition plus tôt en raison de la migration plus rapide.
2. Au cours de l'imagerie en direct, placez le plat dans un environnement fermé à une température moyenne de 37 ± 0,1 ° C et 5% de CO _2.
3. Enregistrer les cellules en utilisant une caméra à dispositif à couplage de charge placé sur le microscope.
4. Prendre des images numérisées toutes les 10 minutes jusqu'à 72 heures pour suivre la locomotion cellulaire de trois à six cellules différentes.
5. Remplacer milieu après 24 h.
6. Effectuer l'acquisition de données et d'analyse simple à l'aide du logiciel de microscope.

Analyse 5. Données

1. Pour des applications plus avancées ( par exemple, le suivi des cellules en 2D ou 3D) utilisent des logiciels spécialisés (tels que Imaris 4D). Remarque: Ce logiciel détermine les coordonnées xy d'une cellule àun moment donné, ainsi que la distance entre l'origine et la vitesse du mouvement.
2. Calculer la vitesse moyenne, en mesurant la distance entre les positions suivantes Voyage dans des intervalles de 10 min. Calculer l'indice de migration vers l'avant (FMI) qui est la distance entre l'avant de la cellule à partir de la neurite et décrit le mouvement unidirectionnel des cellules vers le DRG.

En utilisant la microscopie vidéo d'imagerie, DRG peut être vu bourgeonnement des neurites 5-7 jours après l'implantation, tandis que les cellules cancéreuses de migrer hors de leurs colonies vers le DRG. Par la 7 ème jour après l'implantation, les cellules cancéreuses viennent en contact avec les neurites (figure 2).

L'indice de migration vers l' avant des cellules cancéreuses pancréatiques utilisées dans le protocole est de 3-4 fois supérieure à celle d'autres lignées cellulaires (QLL2, B16F) (figure 3a). La figure 3b présente un représentant de coordonnées X et Y graphique illustrant le chemin de migration d'une cellule cancéreuse CPK en contact avec le nerf; analyse de vidéomicroscopie time-lapse a montré des différences dans le mouvement vers l' avant , mais pas la vitesse entre les cellules du CPK et les cellules non-invasion (Figure 3c-d).

gurer 1 "src =" / files / ftp_upload / 52990 / 52990fig1.jpg "/>
Figure 1:. Illustration schématique des étapes du protocole S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2:. Cancer Cell Invasion Le long de la Neurones de la DRG (a) DRG ( en haut) et les cellules cancéreuses (en bas) au jour 0 après ensemencement (grossissement 5X). (B) DRG et le cancer des cellules au jour 7 après le semis (grossissement 5X). Les cellules (c) Cancer migrent le long des neurones DRG (flèches). Toutes les barres représentent 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Cette recherche a été soutenue par la bourse de développement de carrière en recherche Barbara S. Goodman de l’ICRF (2011-601-BGPC) et une subvention de la Fondation scientifique binationale États-Unis-Israël. Aucune autre divulgation financière de la part des auteurs ne doit être faite.