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Research Article
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Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.
L'immunofluorescence indirecte est utilisé pour détecter et localiser des protéines d'intérêt dans un tissu. Le protocole présenté ici décrit un procédé simple et complet pour la détection de protéines immunitaire, la souris glande mammaire en lactation étant pris comme exemple. Un protocole de préparation des échantillons de tissu, en particulier en ce qui concerne la dissection de la glande mammaire de la souris, la fixation du tissu et la coupe de tissu congelé, sont décrites en détail. Un protocole standard pour effectuer immunofluorescence indirecte, y compris une étape de récupération de l'antigène en option, est également présenté. L'observation des coupes de tissus marqués ainsi que l'acquisition de l'image et post-traitements sont également indiqués. Cette procédure donne une vue d'ensemble, à partir de la collection de tissus d'origine animale pour la localisation cellulaire d'une protéine. Bien que ce procédé général peut être appliqué à d'autres échantillons de tissu, elle doit être adaptée à chaque couple d'anticorps de tissu / primaire étudié.
La glande mammaire est un organe exocrine mammifère atypique dont la fonction principale est de produire du lait pour nourrir les nouveau-nés. Le développement du tissu mammaire survient principalement après la naissance et se caractérise par un processus unique dans lequel l'épithélium envahit le stroma environnant. Ce tissu subit de nombreux changements (croissance, la différenciation et de régression), en particulier au cours de la vie adulte, de manière concomitante avec des variations dans l'état reproducteur (Figure 1). En plus de la morphologie globale du tissu, les proportions des différents types de cellules, ainsi que leur disposition à l'intérieur de la glande mammaire changer de façon spectaculaire au cours du développement 5.1.
Au cours de la vie embryonnaire, l'épithélium mammaire dérive de lignes de lait mammaires, qui est défini par un léger épaississement et la stratification de l'ectoderme, entre les parties avant et arrière des membres de chaque côté de la ligne médiane autour jour embryonnaire 10,5 (de E10.5) (Figure 1A ).Sur E11.5, la ligne de lait se décompose en placodes individuels, qui sont positionnés de manière symétrique le long de la ligne de lait mammaire en des emplacements reproductibles, et le mésenchyme environnant commence à se condenser. Les placodes commencent à sombrer plus profondément dans le derme et le mésenchyme mammaire organise en couches concentriques autour du bourgeon mammaire (E12.5-E14.5). Comme de E15.5, l'épithélium mammaire, commence à proliférer et allongé pour former le germe primaire qui pousse à travers le mésenchyme mammaire vers le coussinet adipeux. Le germe primaire développe un lumen creux avec une ouverture sur la peau, caractérisée par la formation de la gaine du mamelon. Sur a 18,5, le conduit allongeant a grandi dans le coussinet de graisse et a ramifié dans un petit système canalaire arborisée englobé dans le coussinet adipeux. Développement est essentiellement arrêté et la glande mammaire reste rudimentaire morphogenetically repos jusqu'à la puberté. Dans l'embryon mâle, l'activation des récepteurs androgènes conduit à la dégénérescence des bourgeons, qui disparaissentpar E15.5. Comme de E18, le développement mammaire cesse jusqu'à la puberté 6-9.
À la naissance, la glande mammaire abrite un système canalaire rudimentaire qui allonge et les branches lentement (croissance isométrique). Au début de la puberté, les structures sphériques situés aux extrémités des conduits appelés les bourgeons terminaux (TEBS), sont formées d'une couche externe de cellules de la coiffe et une âme interne multicouche de cellules (cellules de l'organisme). Ces structures sont très proliférative et infiltrent le tissu stromal environnante en réponse aux signaux hormonaux. Prolifération dans les résultats TEBS d'allongement canalaire, couplé avec la morphogenèse de ramification. Ce processus conduit à la mise en place d'un réseau arborisée épithéliale de base émanant de la tétine (figure 1B, la puberté). A ~ 10-12 semaines après la naissance, lorsque l'épithélium envahi tout le a coussinet adipeux, son expansion et arrête le TEB disparaître. Le développement de Ductal subit alors des modifications dynamiques, à savoir, successive la prolifération et la régression des cellules épithéliales selon des cycles oestraux 10 (figure 1B, adultes).
Dès le début de la gestation, le tissu mammaire subit une croissance importante et des changements morphologiques pour se préparer à l'allaitement. L'épithélium mammaire largement proliférer et se différencier, ce qui conduit à un réseau tubulo-alvéolaire hautement ramifié. En même temps, les cellules epitheliales mammaires (CEM) deviennent polarisés et capable de synthétiser et sécréter des produits laitiers. CEM organisent en de nombreuses structures alvéolaires (de acini) qui sont entourés par des cellules myoépithéliales contractiles et incorporés dans un stroma composée de tissus conjonctifs et adipeux, les vaisseaux sanguins et les terminaisons nerveuses (figure 1B, la grossesse). En outre, le côté basal de CEM est en contact étroit avec la membrane basale (de la matrice extracellulaire), et les interactions entre ces deux entités réguler étroitement à la fois fonction de la morphogenèse et sécrétoire de la mamanry épithélium 11-13.
Tous ces procédés reposent sur l'action de divers signaux de l'environnement, dont les plus importants sont les facteurs paracrines hormones14, et la matrice extracellulaire. Par exemple, la progestérone induit étendue latérale de ramification 15 et alveologenesis qui, en combinaison avec la prolactine (PRL) 16,17, favorise et entretient la différenciation des alvéoles. En plus de stéroïdes et PRL18, les cytokines et les voies de signalisation associées au développement (Wnt et Notch voies de signalisation) sont également impliqués dans l'engagement de la lignée mammaire et le développement 19-21. À la fin de la grossesse, les CEM luminal commencent à produire un lait riche en protéines connu sous le nom de colostrum dans la lumière des alvéoles. En outre, la progestérone agit sur la perméabilité épithéliale et depuis les jonctions serrées sont encore ouverts, le colostrum est également trouvé dans la circulation sanguine maternelle.
Après l'accouchement, la mammarépithélium y occupe la quasi-totalité du volume de la glande mammaire et est hautement organisée (Figure 2, l'épithélium mammaire). Unités productrices de lait, à savoir les alvéoles (Figure 2, alvéole), sont formés par une monocouche de cellules épithéliales mammaires sécrétoires polarisées (de mESCs), avec leur membrane plasmique apicale délimitant la lumière. Alvéoles se disposent en lobules qui sont regroupés en lobes reliés à des conduits qui drainent le lait au milieu extérieur (Figure 2, lobe). Allaitement se produit, ie., MESCs commencent à sécréter des quantités abondantes de lait, déclenchées principalement par la baisse des hormones placentaires (principalement la progestérone) (figure 1B, lactation). Les gènes de protéines de lait sont activés dans un cours à temps temporelle définie allant de la grossesse à l'allaitement 9,22,23, principalement en réponse à PRL pituitaire publié au moment de la tétée. Parallèlement, les contacts entre mESCs et la matrice extracellulaire de protéines de lait à la fois stimuler Synthesis par des signaux qui sont médiés par les interactions entre les intégrines cellulaires et laminine 24,25, et suppriment l'apoptose dans mESCs 26,27. Ces voies de signalisation donnent lieu à l'activation des protéines de lait de 28 promoteurs de gènes par le biais de l'activation de facteurs de transcription spécifique 29. Contacts cellule-cellule sont également importants pour certains aspects de la différenciation, y compris l'établissement de la polarité apicale et la sécrétion vectoriel de produits laitiers. Jonctions serrées rapidement fermer après le début de la lactation et mESCs orchestrer finement l'absorption de molécules dans le sang ainsi que la synthèse, le transport et la sécrétion des composants du lait, en réponse aux besoins nutritionnels des nouveau-nés. Au moment de la tétée, la contraction des cellules myoépithéliales entourant les alvéoles se produit en réponse à l'ocytocine et conduit à l'éjection du lait à travers les conduits et dans le mamelon. Le lait est un liquide complexe qui contient des protéines (surtoutcaséines), des sucres (lactose principalement), des lipides et des minéraux, ainsi que des molécules bioactives telles que des immunoglobulines A (IgA), des facteurs de croissance et hormones. Les caséines sont synthétisés, assemblés en structures supramoléculaires, à savoir les micelles de caséine, transportés le long de la voie sécrétoire, et ensuite libérés par exocytose, à savoir la fusion des vésicules de sécrétion contenant de la caséine (SV) avec la membrane plasmique apicale des MESC (figure 2).
Trafic intracellulaire repose sur les échanges de matériels entre les compartiments membranaires et implique Soluble N-éthylmaléimide sensible Fusion (NSF) Attachment Protein (SNAP) Receptor (SNARE) 30,31. La famille des protéines SNARE est subdivisé en SNAREs vésiculaires (v-SNARE), présents dans la membrane des vésicules, et des pièges cibles (t-SNARE), localisés sur les membranes cibles. Par zipping à travers leurs domaines coiled-coil, V- et t-SNARE assemblent pour former un complexe de faisceau à quatre hélices hautement stable, dénommé ecomplexe SNARE e. Ce complexe favorise la fusion de deux bicouches lipidiques opposées en les amenant progressivement à proximité immédiate 30,32. Ensuite, complexes SNARE sont dissociées par l'adénosine triphosphatase NSF et ses protéine adaptatrice protéines SNAP et le filet, sont recyclés à leur compartiment d'origine 33. Fait intéressant, chaque protéine SNARE réside principalement dans les compartiments cellulaires distincts et SNARE appariement peut contribuer à la spécificité des événements intracellulaires 34 de fusion. Des études antérieures suggèrent qu'au moins 23 protéines (SNAP23) et associée à la vésicule Membrane Protein 8 (VAMP8), et syntaxins (STX) Synaptosomal associée -7 et -12 jouent un rôle dans la caséine exocytose 35,36. Ces protéines ont également été trouvés en association avec la fraction lipidique du lait, à savoir, matière grasse du lait globules (MFG) 37. Le modèle qui prévaut courant postule que les gouttelettes lipidiques cytoplasmiques (CLD) sont formées par l'accumulation de l neutreipids (principalement des triglycérides et des esters de sterol) et cholestérol dérivé de l'alimentation maternelle entre les deux feuillets du réticulum endoplasmique (ER) de 38 à 41 membrane. Pour les CLD sont formées, au moins en partie, par la fusion de petites CLD pendant son transport vers le côté apical de mESCs où ils sont libérés en tant que MFG (1-10 um de diamètre) par bourgeonnement, étant enveloppé par la membrane plasmique apicale des MESC 40-42. Allaitement cesse après petits sont sevrés et les mESCs meurent progressivement par apoptose, conduisant à la régression du tissu mammaire à un état pubertaire (figure 1B, l'involution).
Immunofluorescence (IF) est une méthode de laboratoire analytique commun utilisé dans presque tous les aspects de la biologie, à la fois dans la recherche et en diagnostic clinique. Si les techniques peuvent être effectuées sur des coupes de tissus (immunohistochimie, IHC) ou cellulaires (immunocytochimie, CPI) échantillons. Cette approche puissante repose sur l'utilisation de fluorescent-des anticorps marqués qui se lient spécifiquement (directement ou indirectement) à l'antigène d'intérêt, permettant ainsi la visualisation de sa distribution dans les tissus par microscopie de fluorescence. Les signaux de fluorescence dépendent principalement de la qualité et la concentration des anticorps et la manipulation de l'échantillon. Un protocole simple immunofluorescence indirecte (IIF) est présenté pour détecter les produits de lait (caséines et MFG) et des protéines impliquées dans la sécrétion de lait produit (butyrophiline (BTN1), caisse claire protéines) sur des sections congelées de tissu mammaire de la souris (Figure 3). Bien que ce protocole fournit un aperçu complet IHC, allant de la collecte de tissus à l'image de post-traitement, critique et des étapes facultatives ainsi que quelques recommandations techniques sont également présentés et discutés.
Souris CD1 ont été élevés à l'INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, France). Tous les aspects éthiques du soin des animaux conformes aux lignes directrices et aux exigences d'octroi de licences prévues par le ministère français de l'Agriculture. Les procédures utilisées ont été approuvées par le comité d'éthique local (accord 12/097 du Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech).
1. glande mammaire Préparation d'échantillons
2. sectionnement de tissu congelé
Remarque: un cryostat, qui est essentiellement un microtome à l'intérieur d'un congélateur, qui est nécessaire pour faire des coupes de tissus congelés. Une température plus basse est souvent nécessaire pour les tissus adipeux ou riches en lipides tels que la glande mammaire vierge.
3. immunofluorescence indirecte
4. Observation fluorescence et Image Acquisition
Remarque: Un microscope à fluorescence équipé d'une caméra contrôlée par le logiciel d'acquisition d'image est nécessaire pour observer les résultats IHC.
5. Traitement de l'image
Remarque: Toutes les images post-traitements sont effectués en utilisant le logiciel gratuit ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).
La glande mammaire est une glande sous-cutané situé le long de la structure à la fois ventrale du thorax et de l'abdomen chez les rongeurs. L'emplacement des cinq paires de glandes de la souris pendant la gestation est montré dans la figure 4. La morphologie de la glande mammaire change radicalement au cours de son développement, reflétant des modifications fonctionnelles requises pour préparer la lactation complète (figure 1B). Chez les animaux vierges ou nullipares, la glande mammaire se compose d'un épithélium canalaire peu ramifiée intégré au sein d'un stroma gras mince qui peut être difficile à voir. Dès le début de la grossesse, les prolifère et se dilate épithélium mammaire, résultant dans les glandes mammaires grands qui deviennent plus faciles à voir et à retirer (Figure 4). Pendant la lactation, le tissu mammaire est plus épaisse et plus blanche apparaît en raison de la présence de lait. Seuls les glandes mammaires et inguinaux abdominaux sont collectées parce Glan mammaire cervicales et thoraciquesDS sont moins facilement retiré en raison de leur étroite association avec les muscles. Pour certaines expériences, les chiots peuvent être séparés de la femelle en lactation 4-6 h avant le sacrifice afin de limiter la sécrétion du lait par mESCs 46,47.
Identification des myoépithélial mammaires et les cellules épithéliales
Les cellules myoépithéliales contractiles entourant les alvéoles peuvent être distinguées des mESCs luminales grâce à l'utilisation d'anticorps dirigés contre des marqueurs spécifiquement exprimées par chacun de ces types de cellules. Dans la glande mammaire, les marqueurs actuellement utilisés sont les cytokératines (CK). CKs sont une grande famille de protéines cytoplasmiques qui se polymérisent pour former des filaments intermédiaires du cytosquelette (10 nanomètres de diamètre en moyenne) qui se trouvent dans les tissus épithéliaux. Les filaments intermédiaires sont extrêmement stables et fournissent un support mécanique pour l'architecture cellulaire, et organiser les tissus en contribuant à l'adhérence cellule-cellule et cellule-basale conjonctifinteractions tissulaires. Les sous-ensembles de CKs exprimées par les cellules épithéliales dépendent principalement du type de l'épithélium, son stade de développement et de son état de différenciation. En outre, cela vaut également pour les homologues malignes de l'épithélium. Par conséquent, ces marqueurs sont des outils simples et de grande valeur pour caractériser les populations de cellules dans un tissu dans des conditions physiologiques et sont utilisés pour le diagnostic et la caractérisation d'une tumeur en 48 pathologie chirurgicale.
Dans la glande mammaire normale, les cellules myoépithéliales de mESCs luminales et peuvent être distinguées sur la base de leur expression différentielle de CK14 et CK8, respectivement (Figure 5). Ces marqueurs cytoplasmiques sont détectés dans les sections mammaires de souris allaitantes après PFA fixation et AR. Les images ont été acquises avec un microscope à épifluorescence classique. CK8 semble être distribué dans le cytoplasme des mESCs luminale (figure 5), CK8. Notez que le fond rouge observerD pour le contrôle négatif sans anticorps primaire (figure 5, -Ig1) est principalement due à la coupe de tissu pliage, comme suggéré par le marquage d'ADN bleu, qui affiche plusieurs couches de noyaux (Figure 5, -Ig1, noyaux). CK14 est spécifiquement observée dans les cellules myoépithéliales et allongées plates situées à la base des alvéoles (figure 5), CK14. Une autre manière courante pour identifier les cellules myoépithéliales est de détecter l'actine musculaire lisse alpha (a - SMA) présents dans ces cellules contractiles (voir Figure 4 à 49).
La détection de produits laitiers de la souris
Après l'accouchement, les mESCs complètement différenciées commencent à produire des quantités abondantes de lait. Composants laitiers sont sécrétées par des voies distinctes 40,50. Micelles de caséines sont sécrétées par exocytose de SV-Golgi dérivés, tandis que les lipides sont libérés comme MFG par le bourgeonnement de la pl apicaleasma membrane de mESCs (figure 2, une cellule épithéliale mammaire sécrétoire). Pour certaines expériences, les chiots sont séparés de la femme 4-6 heures avant la collecte des glandes mammaires, afin de ralentir la sécrétion du lait 46,47. Dans ces conditions, la membrane plasmique apicale des mESCs et le contenu de la lumière peuvent être facilement observés, ce qui est le cas au cours de lait depuis les alvéoles sont contractés et la lumière sont fermés. En outre, ce qui ralentit la sécrétion est également essentiel lors de l'étude des protéines impliquées dans le trafic membranaire comme SNAREs. En effet, le cycle pièges entre le donneur et accepteur compartiments et leur localisation subcellulaire est difficile à déterminer car l'étiquetage est souvent diffusé lorsque le chiffre d'affaires de la membrane est élevée, ie., Pendant l'allaitement. Par conséquent, le ralentissement de la sécrétion de lait en enlevant les chiots offre des conditions appropriées pour étudier la localisation intracellulaire de SNAREs lorsque le T et V-SNAREs résident préférentiellement chez le donneuret le compartiment accepteur, respectivement (voir ci-dessous).
La figure 6 montre la localisation des caséines dans la glande mammaire en lactation de la souris au jour 10 de la lactation, en présence (Figure 6, p +) ou en l'absence (Figure 6, -p) des chiots. Les coupes de tissus ont été observées à la fois par la microscopie conventionnelle à épifluorescence (les trois colonnes de droite) et la microscopie confocale (figure 6, colonne de gauche). Au cours de lait, les caséines semblent être principalement accumulée dans la région apicale (Figure 6, p +, des pointes de flèches). La microscopie confocale révèle que les caséines sont également présents, bien que dans une moindre mesure, sur le côté basal de mESCs en présence de petits (Figure 6, + p, flèches), qui ne peuvent être clairement observées en microscopie classique (Figure 6, les caséines, comparer les panneaux gauche et droit). En effet, en grand champ épifluorescence, la fluorescence émise par l'échantillon (fond fluorescence) passe à travers le volume excité et modifie la résolution des objets observés dans le plan focal objectif (out-of-focus fluorescence). Cela est particulièrement vrai pour les échantillons épais (épaisseur supérieure à 2 um). La microscopie confocale permet d'obtenir des images de haute qualité à partir d'échantillons préparés à épifluorescence, comme la profondeur de champ peut être contrôlée et la fluorescence de fond exclu du plan focal. En outre, en présence de petits (Figure 6, + p), la lumière des alvéoles sont tout à fait fermé et le côté apical de mESCs est mieux observé en l'absence de petits (Figure 6), -p, lorsque la lumière de la alvéoles est dilaté en raison de l'accumulation de produits laitiers. Lorsque la sécrétion de lait est ralenti, les caséines apparaissent également accumulés sous la membrane plasmique apicale (Figure 6, -p, des pointes de flèches), et sont clairement observés sur le côté basal de mESCs (Figure 6, -p, flèches). Les contrôles négatifs sans ANTIB primaireOdy n'a montré aucun étiquetage (Figure 6, -Ig1).
Les produits laitiers peuvent être facilement co-détectés en combinant IHC pour les caséines et lipide neutre contre-coloration des CLD et MFG (figure 7). Les coupes de tissus ont été imagées en Z-piles par microscopie confocale, qui étaient post-traités avec ImageJ pour produire des projections Z ou projections en 3D pour chaque (Figure 7, caséines, lipides) ou tous les canaux de couleur (Figure 7, fusionner). Les séquences d'images produites ont été sauvegardés comme des images simples (figures 7 et 8) ou des films (voir Films complémentaires).
Bien que certains marquage n'a été observé sur le côté de la base, les caséines sont principalement accumulées sur le côté apical de mESCs (figure 7, p +), comme déjà décrit, lorsque les femelles ont été jusqu'à présent pas été séparés des petits (Figure 6, + p). CLD sont aussi principalement localisée dans la région apicale de mESCs, alors que plus grand secret,MFG és sont présents dans la lumière des alvéoles. Notez que les caséines et les MFG sont facilement visualisées à la lumière d'alvéoles en l'absence de petits (Figure 7, comparer + p et -p). Caséines ne co-localisent pas avec les CLD ou MFG dans l'une de ces conditions depuis la superposition des deux canaux de couleur ne produit pas d'étiquetage jaune (figure 7, de fusionner des images). Cependant, post-traitements d'image pile montrent que les caséines entourent les MFG sécrétées dans la lumière des alvéoles, ce qui suggère que ces protéines peuvent interagir avec le MFG (figure 7, de fusionner des images). Notez la différence des images produites par chaque post-traitement utilisé (Figure 7, comparer Zproj et 3D proj pour chaque canal de couleur).
Détection de butyrophiline, un marqueur protéique de MFG.
BTN1 est l'une des principales protéines associées à MFG 51 dans le lait. Cette protéine transmembranaire est mainly localisée à la membrane plasmique apicale des mESCs et est par conséquent trouvé à la surface de la MFG après sa libération par bourgeonnement 52. La figure 8 montre qu'au jour 10 de la lactation, BTN1 est principalement localisée au niveau de la membrane plasmique apicale et, dans une moindre mesure, dans la région apicale de mESCs. BTN1 entoure également les MFG présents dans le lumen d'alvéoles, ainsi que certains des CLD apicaux (Figure 8, proj 3D fusion, des pointes de flèches). Les résultats sont présentés comme une seule image extraite de l'image Z-stack acquise (Figure 8, image) ou une vue 3D généré avec la commande de projection 3D d'ImageJ, comme décrit ci-dessus (Figure 8, proj 3D). Notez qu'une seule image peut être suffisante pour observer la distribution apical de la protéine, mais l'association spatiale des BTN1 avec MFG sécrétées ou apicale CLD est observée seulement après la reconstruction 3D de la Z-stack (Figure 8 Comparer image BTN1 et 3D de la fusion PICTUres). Le Z-pile peut également être reconstruit comme un film pour donner une meilleure vue de la distribution spatiale de la protéine. L'image Z-stack acquis pour BTN1 seul (des films supplémentaires 1 et 3) ou superposée avec les deux autres canaux de couleur (fusionner, films supplémentaires 2 et 4) sont présentés à titre d'exemples. Le Z-pile peut être lue image par image à partir du haut vers le bas (films complémentaires 1 et 2) ou comme une vue de rotation (axe y) de la projection 3D de l'ensemble de la pile d'images (films supplémentaires 3 et 4 ).
La détection de deux protéines SNARE: STX6 et VAMP4
Comme mentionné précédemment, des pièges sont des protéines membranaires ce cycle entre les membranes de donneur et accepteur. Il est donc préférable de ralentir le chiffre d'affaires de la membrane associée à l'activité sécrétoire élevé de mESCs en séparant les femelles de chiots avant de recueillir la glande mammaire lors de l'étudeces protéines. STX6 et VAMP4 ont tous deux été décrit comme étant associé avec le réseau trans-Golgi 53,54. Cependant, ces protéines SNARE peuvent également jouer un rôle important au niveau des autres compartiments cellulaires comme les granules sécrétoires (STX6) 55,56 et l'appareil de Golgi (VAMP4) 57. Des études antérieures suggèrent que les protéines SNARE jouent un rôle dans la sécrétion de caséine 35,36. Pendant la lactation, STX6 VAMP4 et sont situés dans la région sub-apicale de mESCs. STX6 est observée entre le noyau et la membrane apicale de CEM, correspondant à l'appareil de Golgi et le réseau trans Golgi (figure 9, STX6), et est également présent, bien que dans une moindre mesure, de SV-36 contenant de la caséine. VAMP4 est également localisée dans la région sub-apicale de mESCs, mais l'étiquetage semble être plus ponctuée et est accumulée sous la membrane plasmique apicale (Figure 9, VAMP4) en raison de son association avec les deux CLD et caséine-contaSV de INING 36. Contrôle négatif sans anticorps primaire n'a pas donné lieu à aucun étiquetage.
Figure 1. Souris de développement de la glande mammaire pendant la vie embryonnaire et adulte. (A) Les glandes mammaires de souris commencent à se développer autour de jour embryonnaire 10 (E10) des ectodermique (bleu clair) lignes de lait (rose). À E11.5, placodes forment symétriquement le long de la ligne de lait mammaire et le mésenchyme environnant (bleu foncé) commence à se condenser. Les placodes invaginent pour former des bourgeons (E12.5-E14.5) et, sur E15.5, l'épithélium mammaire (rose), prolifèrent et allongée pour former le germe primaire qui pousse à travers le mésenchyme mammaire vers le coussinet adipeux (vert clair ). Il se forme un lumen creux et ouvre de donner lieu à la tétine (violet). Sur a 18,5, l'épithélium mammaire forme un Rudimentary structure ramifiée reliée à l'extérieur. Adapté de 6 permission de Macmillan Publishers Ltd: Nature Reviews Genetics, copyright 2007. (B) Au cours de la puberté, l'épithélium mammaire (violet) entre dans une phase importante de la croissance (extensive allongement, bifurcation et les ramifications latérales). Au début de la gestation, la prolifération vaste et rapide ainsi que la ramification latérale se produire, conduisant à l'expansion considérable de l'épithélium mammaire, qui envahit entièrement toute la coussinet adipeux mammaire. L'épithélium mammaire atteint un état fonctionnel très différencié pendant la lactation lorsque mESCs luminal sécrètent de grandes quantités de lait. Lorsque l'allaitement cesse après le sevrage, les involue glande mammaire. MESCs sont éliminées par phagocytose et l'apoptose, ce qui conduit à la disparition de structures de lóbulo-alvéolaire qui sont remplacés par le tissu adipeux. Adapté du schéma 1 de http://brisken-lab.epfl.ch/research et le chapitre 2.2. http://tvmouse.ucdavis.edu/bcancercd/22/index.html. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Architecture de la glande mammaire pendant la lactation. Pendant la lactation, l'épithélium entièrement développé et très ramifié (violet) représente la grande majorité du tissu mammaire. Le tissu épithélial est formée par des structures tubulo-alvéolaire noyés dans un stroma qui contient divers types de cellules (fibroblastes, les adipocytes, les cellules musculaires lisses, le sang et les vaisseaux lymphatiques et les terminaisons nerveuses). MESCs sont organisés en structures ou alvéoles acineuses, assemblés dans lobules qui forment lobes. Chaque alvéole est une unité produisant du lait fonctionnel qui est connecté à un réseau hautement ramifié de canaux interlobulaires et lobulaires, permettant ainsi le lait à Dplu vers l'extérieur. Chaque alvéole est délimitée par une monocouche de mESCs polarisées, le côté apical de qui borde un lumen central. Le côté basal de la mESCs est en contact étroit avec une matrice extracellulaire et les cellules myoépithéliales contractiles. Les produits laitiers sont libérés sur le côté apical de mESCs. Lait Major (de caséines) sont sécrétées sous forme de micelles de la caséine (points noirs) par exocytose des vésicules de sécrétion Golgi dérivés (SVS), tandis que les lipides sont libérés sous forme de globules de matière grasse du lait (de MFG) par bourgeonnement de la membrane plasmique apicale des mESCs. CLD: cytoplasmique gouttelette lipidique; ER: réticulum endoplasmique; MEC: cellules épithéliales mammaires. Adapté du chapitre 2.2. http://tvmouse.ucdavis.edu/bcancercd/22/index.html., Fig. Www.cellbiol.net/ste/alpHERCEPTIN1.php 02, Fig. 26-02 en 58, et de 50. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Procédure expérimentale pour effectuer immunofluorescence indirecte sur coupes congelées de la glande mammaire de la souris. La glande mammaire est recueilli à partir d'une souris femelle CD1 à 10 jours de lactation. Le tissu mammaire est coupé en petits fragments qui sont fixées avec du paraformaldehyde et infusées dans de saccharose avant d'être incorporé dans le composé PTOM et congélation rapide. Les échantillons de la glande mammaire sont ensuite découpés en coupes fines congelées et transformées pour IIF par incubation successive avec des anticorps primaires et secondaires conjugués à un fluorochrome, respectivement. Après le montage, les échantillons sont analysés avec un microscope à fluorescence, ce qui permet l'acquisition d'images pouvant ensuite être post-traitée./53179/53179fig3large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 4. anatomique emplacement des glandes mammaires de souris Gauche: vue ventrale du système mammaire de la souris à l'étape de fin de gestation. A droite: la localisation et l'aspect de la glande mammaire à la fin du stade de gestation chez la souris. On notera que pendant la lactation, la glande mammaire sont plus épaisses et plus blanches apparaissent en raison de la présence de lait dans les alvéoles. Adapté de http://ctrgenpath.net/static/atlas/mousehistology/Windows/femaleu/mousemammgldiagram.html et http://www.pathbase.net/Necropsy_of_the_Mouse/index.php?file=Chapter_3.html. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 5. Identification des cellules épithéliales luminales et les cellules myoépithéliales de base dans la glande mammaire de la souris. MESCs Luminal et les cellules myoépithéliales sont identifiés par IIF dans la glande mammaire de la souris au jour 10 de la lactation, sur la base de leur expression de la CK-8 et CK-14 , respectivement. L'ADN nucléaire a été coloré avec du DAPI (bleu). Les images ont été acquises avec un microscope à épifluorescence classique. L'image composite (fusionner) montre la superposition de l'étiquetage correspondant à caséines (rouge) et noyaux (bleu), respectivement. -Ig1, Contrôle négatif sans anticorps primaire. Les astérisques indiquent lumens. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 6. Localisation cellulaire des caséines dans la glande mammaire de la souris. Les caséines sont détectés par IIF dans la glande mammaire de la souris au jour 10 de lactation. La glande mammaire a été recueilli à partir de femelles en présence (+ p) ou en l'absence (-p) des chiots. Les images ont été acquises avec un conventionnelles (panneau de droite, caséines, des noyaux et fusionnent) ou un microscope confocal (caséines (rouge), panneau de gauche) microscope à fluorescence. Dans les deux conditions, les caséines (rouge) sont détectés dans la région apicale (têtes de flèches) et plus ou moins à la base de mESCs (flèches). Les contrôles négatifs sans anticorps primaires ne montrent aucun étiquetage (-Ig1). L'ADN nucléaire est coloré avec du DAPI (bleu). L'image composite (fusionner) montre la superposition de l'étiquetage correspondant à caséines (rouge) et noyaux (bleu), respectivement. Les astérisques indiquent lumens. Barre d'échelle = 100 um pour les images à épifluorescence (panneau de droite, les caséines, noyaux, fusionner) et = 10 &# 181;. M pour les images confocal (colonne de gauche) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Localisation cellulaire des produits de lait dans la glande mammaire de la souris. Les caséines (rouge) sont détectés par IIF dans la glande mammaire de la souris au jour 10 de la lactation en présence (+ p) ou en l'absence (-p) des chiots. Les lipides neutres (CLD) et les MFG sont contre avec bodipy 493/503 (vert). Les images composites (de fusion) montrent la superposition des deux marquages. Les images ont été acquises dans le Z-piles avec un microscope confocal. Z-piles ont été post-traités avec ImageJ pour générer des projections de Z (Zproj) ou des projections 3D (axe des ordonnées) (proj 3D) de l'ensemble des piles dans chaque canal pour les deux (fusionner). Les astérisques indiquent lumens. La barre d'échelle= 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. localisation cellulaire de butyrophiline et les lipides dans la glande mammaire de la souris. BTN1 (rouge) est détectée par IIF dans la glande mammaire de souris à 10 jours de lactation, en l'absence des chiots. Les lipides neutres (CLD et MFG) et l'ADN nucléaire sont de contraste avec bodipy 493/503 (vert) et DAPI (bleu), respectivement. Les images ont été acquises avec un microscope confocal comme images Z-piles. Les résultats sont présentés comme une seule image extraite de la pile d'images (images, BTN1, des lipides, des noyaux et fusionnent) ou après post-traitement avec ImageJ pour générer une vue 3D (axe des y) de l'ensemble de la pile d'image (proj 3D, BTN1 , des lipides, des noyaux, fusion). Les images composites (de fusion) montrent lessuperposition des trois canaux de couleur. -Ig1, Contrôle négatif sans anticorps primaire. Les astérisques indiquent lumens. La barre d'échelle = 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9. localisation cellulaire de deux protéines SNARE dans la glande mammaire de la souris. Syntaxine 6 (STX6) et VAMP4 (V4) sont détectés par IIF dans la glande mammaire de la souris au jour 10 de lactation. Les images ont été acquises avec un (conv) épifluorescence classique ou un microscope confocal (LSM) microscope. Les images composites (de fusion) montrent la superposition du marquage observé pour chaque protéine SNARE (rouge) et de l'ADN nucléaire DAPI (couleur vert faux), respectivement. -Ig1, Contrôle négatif sans anticorps primaire. Astérisques indiquent lumens. Barre d'échelle = 10 um pour les photos et confocale = 100 um pour épifluorescence images. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. L'immunohistochimie guide de dépannage.
Film supplémentaire 1. Localisation de butyrophiline dans la glande mammaire de la souris. BTN1 (rouge) est détectée par IIF dans la glande mammaire de la souris au jour 10 de lactation. Les images ont été acquises avec un co microscope nfocal comme un Z-stack et post-traité avec ImageJ pour générer un film. Le Z-stack est lu à partir du haut vers le bas. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo.
2. Localisation film supplémentaire et butyrophiline de lipides neutres dans la glande mammaire de la souris. BTN1 (rouge) est détectée par IIF dans la glande mammaire de souris à 10 jours de lactation. Les lipides neutres (CLD et MFG) et l'ADN nucléaire sont de contraste avec bodipy 493/503 (vert) et DAPI (bleu), respectivement. Les images ont été acquises avec un microscope confocal en tant que Z-pile pour chaque canal de couleur et sont post-traités avec ImageJ pour générer un Z-empilement composite qui superpose les trois canaux de couleur. Le composite Z-pile résultante est lue à partir du haut vers le bas.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53179/supvid2.mp4 "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
3. film supplémentaire de localisation de butyrophiline dans la glande mammaire de la souris. BTN1 (rouge) est détectée par IIF dans la glande mammaire de la souris au jour 10 de lactation. Les images ont été acquises avec un microscope confocal comme un Z-stack et post-traité avec ImageJ (projection 3D) pour générer un (axe y) tournant vue spatiale de l'étiquetage BTN1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Film supplémentaire 4. Localisation de butyrophiline et lipides neutres dans la MA de la sourismmary glande. BTN1 (rouge) est détectée par IIF dans la glande mammaire de la souris au jour 10 de lactation. Les lipides neutres (CLD et MFG) et l'ADN nucléaire sont de contraste avec bodipy 493/503 (vert) et DAPI (bleu), respectivement. Les images ont été acquises avec un microscope confocal en tant que Z-pile pour chaque canal de couleur et sont post-traités avec ImageJ pour générer un Z-empilement composite qui superpose les trois canaux de couleur. ImageJ (Projection 3D) a en outre été utilisé pour générer un (axe y) tournant vue spatiale de la Z-stack composite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.
Les auteurs sont reconnaissants à l'installation de noyau d'imagerie INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) et au personnel de l'unité IERP (UE 0907, l'INRA, Jouy-en-Josas) pour les soins et les installations animal. Nous tenons également à remercier IH Mather, MC Neville et S. Tooze de nous fournir antibodie très utile.
| Broches de dissection | |||
| Éthanol | |||
| Ciseaux | |||
| Scalpel et lames | adaptées | ||
| Essuie-tout | |||
| Papier | |||
| Préparation d’échantillons de mouchoirs | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires/Description |
| Saline tamponnée au phosphate (pH7.4) | Sigma | P-3813 | |
| Paraformaldéhyde (PFA, 32 % grade EM, 100 ml) | Microscopie électronique Sciences | 15714-S | équipement de protection individuelle requis AVERTISSEMENT : ce produit vous exposera au gaz formaldéhyde, un produit chimique connu pour causer le cancer |
| composé OCT/Tissu Tek | Sakura | 4583 | |
| Saccharose (D-saccharose) | VWR | 27480.294 | |
| Moules en plastique | Dominique Dutscher | 39910 | |
| Azote | liquide | ||
| Cryostat/support d’échantillon | Leica ; | CM3050S | |
| Lames de rasoir (SEC35) | Thermo Scientific | 152200 | |
| Boîte à | lames | ||
| en verre Superfrost/Superfrost Ultra Plus | Thermo Scientific | 10143560W90/1014356190 | |
| Pinceaux | |||
| IHC | Numéro de catalogue | dela société | Commentaires/Description |
| Super Pap Pen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Marqueur permanent (noir) | |||
| 50 mM NH4Cl dans PBS | Sigma | A-0171 | |
| 0,1 M glycine dans PBS | VWR | 24403.367 | |
| Solution de récupération d’antigène : Tris 100 mM 5 % urée pH9.6 | |||
| Chauffage (jusqu’à 100° ; C) | |||
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| Vectashield (milieu de montage anti-décoloration) sans DAPI/avec DAPI | Vector Laboratories | H-1000/H-1200 | |
| Lamelles en verre 22x50mm (qualité microscopie) | VWR | CORN2980-225 | |
| Vernis | à ongles | ||
| Anticorps | primaires | Commentaires | / Description |
| Caséines anti-souris de lapin (#7781 ; dilution 1:50) | généreusement offert par M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA) | ||
| Anti-cytokératine de souris 8 (CK8, clone 1E8, dilution 1:50) | Biolegend (Covance) | MMS-162P | |
| Anti-cytokératine de souris 14 (CK14, cloneLL002, dilution 1:50) | Thermo Scientific | MS-115-P0/P1 | |
| Anti-butyrophiline pour lapin (dilution 1:300) | généreusement offert par I.H. Mather (Département des sciences animales et aviaires Université du Maryland College Park, États-Unis) | ||
| Anti-Stx6 pour lapin (dilution 1:50) | généreusement offert par S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, Londres, Royaume-Uni) | ||
| Anti-VAMP4 pour lapin (dilution 1:50) | Abcam | ab3348 | |
| Anticorps secondaires | Numéro de catalogue | del’entreprise | Commentaires/Description |
| IgG anti-lapin de chèvre conjugués à la rhodamine (H + L) (dilution 1:300) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-025-003 | |
| Counterstains | Numéro de catalogue | de l’entreprise | Commentaires/Description |
| Bodipy 493/503 | Life Technologies (Sondes moléculaires) | D-3922 | |
| DAPI (4-6-diamidino-2-phénylindole) | LifeTechnologies (sondes moléculaires) | D-1306 | |
| Observation/Capture d’image | Société | Numéro de catalogue | Commentaires/Description |
| Microscope à fluorescence conventionnel | Microscope Leica Leitz DMRB | Filtres standard pour les émissions FITC, Rhodamine; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; & fois ; 63 objectif à immersion dans l’huile (NA 1.3), caméra d’imagerie DP50 (Olympus), Cell&circ ; F software (Olympus) | |
| Microscope à balayage laser (microscopie confocale) | Microscope Zeiss LSM 510 | Plan-Apochromat × ;63 Objectif à immersion dans l’huile (NA 1.4), ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; Logiciel CLSM 510, ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; Installations confocales, Plateforme MIMA2, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2) | |
| Traitement d’images | Société | Numéro de catalogue | Commentaires/Description |
| ImageJ 1.49k logiciel | Logiciel libre |
