Surveillance optique de Living Nerve Terminal Marquer follicule pileux lancéolées Endings du Ex Vivo Souris oreille peau

Terminaisons nerveuses mécanosensorielle sont généralement petits, distribués de manière diffuse et difficile d'accès in situ, car ils sont généralement enterrés profondément dans la peau ou d' autres tissus environnants. Les visualisant, par conséquent, exige habituellement le sectionnement suivi d'un immunomarquage prolongé / période de coloration, ou le retard et les frais d'obtention de lignées de souris avec l' expression génétique des marqueurs fluorescents tels que la protéine fluorescente verte ou jaune (GFP / YFP) ^1. Ici , nous montrons un tissu pratique et une méthode rapide et simple pour accéder à un grand nombre de afférences du follicule pileux pour l' étude, et comment ils peuvent être rapidement étiquetés pour la surveillance optique de la fonction de terminal ^2. Avec la pratique, toute technique de dissection à l'imagerie peut être complété en aussi peu que 2 heures.

Les bornes de lancéolées axones sensoriels qui innervent les follicules pileux chez les mammifères forment des palissades autour de l'épithélium du follicule pileux, chaqueborne sandwich entre glial cell / Schwann traite ^2-4. Le but de ces terminaux est de détecter le déplacement mécanique des poils qu'ils entourent. Ils sont un mélange de terminaisons rapidement et lentement, en adaptant, mais ils produisent de façon prédominante de courtes rafales d'activité en réponse au mouvement des cheveux. En règle générale, la mise à feu arrête très rapidement lorsque le mouvement cesse, même en présence d'un déplacement continu.

Ce modèle de pinna murin pour l'étude des terminaux lancéolées par des méthodes optiques a de nombreuses caractéristiques avantageuses pour l'étude de la structure et la fonction de ces terminaisons. Le pavillon est principalement deux couches de la peau apposés back-to-back, avec seulement une petite quantité de tissu cartilagineux entre les deux. La peau est très fine et facilement disséquée en raison de quantités minimales de faiblement adhésif du tissu conjonctif par rapport à d'autres régions du corps. Les couches de la peau facilement séparés, par conséquent, donnent un bon accès aux follicules et terminaux. L'innervationest facilement accessible et identifiable. Les follicules pileux sont plus faiblement distribués que dans les autres régions de la peau, ce qui facilite l'imagerie ou de petits groupes de follicules. La mince couche dermique sous-jacente donne une bonne accessibilité à des colorants et des médicaments pharmacologiques, est donc idéal pour l'imagerie par microscopie à fluorescence sans autre traitement. L'imagerie des bornes marquées peut être soit de terminaux vivants ou, si l'on utilise un analogue de colorant pouvant être fixé, après la fixation et le traitement ultérieur histologique.

Nous avons utilisé cette préparation pour montrer que la membrane de recyclage se produit dans les terminaisons lancéolées, comme en témoigne l' absorption (endocytose) et la libération (exocytose) d'un colorant styryle pyridinium (FM1-43; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium, le dibromure). Le colorant ne semble cependant pas d'étiqueter de manière significative traite la cellule de Schwann investir ^2. Nous avons également montré que cette absorption de colorant / sortie, et donc la membrane recyclage, est soumise à la modulation glutamatergique par un atypique (phospholipase D-couplé) récepteur métabotropique du glutamate. Les résultats des protocoles de stimulation et d'analyse simples sont illustrés, et les questions d'analyse potentiels communs sont également mis en évidence.

Ces méthodes ont été utilisées dans la recherche rapportée dans les banques, RW et al. ² Les souris ont été humainement euthanasiés par dislocation cervicale. Au Royaume-Uni, cela est juridiquement approuvé l'annexe 1 méthode répertoriée dans les Animaux (Scientific Procedures) Act, 1986 et la directive européenne 2010/63 / UE. Cette loi fédérale est appliquée localement à l'Université d'Aberdeen par le bien-être animal et éthique Conseil d'examen qui ont approuvé toutes les procédures.

1. Oreilles Préparation pour l'étiquetage

1. Préparer une solution saline physiologique standard, par exemple (1956) ⁵ et de Liley sature avec 90% O _2/5% CO ₂ (carbogène). Une solution saline de liley est (mM): NaHCO ₃ (12), KCl (4), KH ₂ PO ₄ (1), du NaCl (138,8), _MgCl2 (1), _CaCl2 (2) et du glucose (11). NOTE: Dans le reste de ce manuscrit, «solution saline» fera référence à une solution saline qui est complètement saturé avec carbogène. Pendant dissection, actualisez la solution saline couvrant la préparation toutes les 15 - 20 min.
2. Humainement euthanasier une souris adulte sans endommager le crâne. NOTE: Nous avons utilisé des souris C57 / BL6J et MF1 mais toute souche de souris peut être utilisée. L'aspect le plus important est de ne pas utiliser de grands adultes (> 25 g). Étiquetage chez des souris plus grandes est moins fiable, étant souvent limité à de petits et dispersés groupes de follicules.
3. Retirez les oreilles externes (pennes) près de la base avec ~ 25 cm ciseaux, juste au-dessus de la ligne de cheveux dense, et plonger dans une solution saline dans un caoutchouc de silicone doublé culture / boîte de Pétri (50 mm est généralement pratique).
4. Positionner la partie antérieure (concave) côté pinna vers le bas et épingler les marges à la silicone à intervalles réguliers avec des épingles fines d'insectes (~ 6 - 8 par oreille, ~ broches de 0,2 mm de diamètre). Actualisez saline toutes les 15 - 20 min, ou utiliser un bain constamment perfusé.
5. décoller délicatement la peau postérieure de la peau antérieure par dissection, accéder initialement à partir de la base de coupe du pavillon surle cartilage central épais et travaillant systématiquement vers les minces marges externes sans cartilage.
   1. Pour ce faire, maintenez le centre de l'arête de coupe de la peau postérieure avec une paire de pas. 3 forceps. Puis, avec les mâchoires fermées, placer les points d'une autre série de pas. 3 pinces à l'écart entre la peau et le cartilage sous-jacent.
   2. travailler doucement les points de la pince fermée d'un côté à l'autre dans l'intervalle, en utilisant la force minimale requise, desserrer soigneusement adhérences tout en enlevant la peau postérieure pour séparer les couches.
6. Avec la peau postérieure enlevé, laisser la peau antérieure en position. Epingler la peau postérieure, côté dermique haut, à côté de la peau antérieure (comme par 1,5, ci-dessus).
7. Ensuite, soigneusement et supprimer complètement le cartilage Pinna qui a été pris en sandwich entre les couches de la peau de la peau antérieure par la même technique de dissection comme dans 1.6. Évitez de faire des trous de perforation avec la pince.
8. Ensuite, fou les deux préparations pinna de la peau délicatement le zeste, plumer et frotter loin la mince couche de tissu conjonctif, ressemblant à la mousse de polystyrène expansé, qui couvre les bases du follicule pileux. REMARQUE: L'obtention de compensation optimale peut prendre un peu de pratique; l'élimination insuffisante des tissus obstrue l'accès, à la fois pour la solution de teinture et pour l'imagerie, tout en raclant trop vigoureusement supprime les réseaux de neurones qui sont à la base des follicules.
9. Actualisez la solution saline.

2. Lancéolées Terminal Étiquetage

NOTE: Le protocole suivant est optimisé pour styryl pyridinium colorant. D'autres, chimiquement semblables, des colorants de pyridinium styryle devraient travailler, peut-être après un certain ajustement de la concentration et la durée d'incubation. Portez des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation des solutions de colorant. Soit acheter mM solution 10 stock colorant directement auprès du fabricant ou de préparer en dissolvant la poudre de colorant dans une solution saline sans glucose. Aliquote (10 pi est généralement commode, mais régler cela pour un grand scaLe expériences) et congelez jusqu'à 6 mois à -20 ° C ou environ 1 an à -80 ° C. Poudre va stocker pendant au moins 2 ans. Éviter le gel répété / cycles de dégel des solutions de colorant; ce dénature rapidement le colorant. Une fois décongelés, conserver à 4 ° C et utiliser dans 1 semaine.

1. Préchauffer un bain d'eau à 30 ° C, avec une plate-forme ~ 3 - 5 mm sous la surface de l'eau.
2. Préparer une solution fraîchement styryl pyridinium de colorant 10 pM (10 pl de 10 mM fraîchement décongelé styryl pyridinium colorant dans 10 ml de sérum physiologique) et équilibrer dans un bain d'eau.
3. Chaque broche de préparation d'un caoutchouc de silicone revêtue de 35 boites de culture mm immergé dans 1 - 2 mm de solution saline (volume typique, ~ 2 ml). Chaque préparation de la peau pinna donnera deux préparations se couper en deux de pointe à la base avec de petits ciseaux (10 - 15 cm de longueur), pour réduire au minimum l'utilisation des animaux.
4. Placez les plats 35 mm contenant les pinna préparations salines couvertes sur la plate-forme immergée dans le 30 ° C au bain-marie. Assurer laprofondeur de l'eau est suffisante pour le réchauffement adéquat, mais ne contamine pas la solution saline dans le plat ouvert.
5. Fine Pin (0,5 - diamètre extérieur de 1 mm) de tube avec coule O ₂ / CO ₂ dans la base de silicone de chaque plat au gaz en continu les préparatifs. Placez également dans le bain d'eau de 100 ml de solution saline sans colorant pour le lavage / plat rafraîchissant. Utilisez un flacon bouché hermétiquement pour maintenir la saturation carbogène et de prévenir la contamination de l'eau.
6. Equilibrer tout à 30 ° C pendant 30 min puis remplacer la solution saline sur les préparations de pinna de 100 ml flacon bouché. Incuber 30 min supplémentaires. NOTE: Ce remplacement compense une solution saline évaporation et les pertes de volume en vrac résultant de gaz en ligne bullage.
7. Videz saline sans colorant dans un bécher de 100 ml de déchets, puis rapidement et soigneusement effacer tout liquide restant autour de la préparation avec du papier absorbant pour réduire au minimum les effets de dilution sur la solution de colorant à ajouter suivant. Prenez soin de ne pas toucher (
8. Incuber préparations Pinna dans 2 - 3 ml de 10 uM styryl pyridinium colorant pendant 40 min à 30 ° C puis revenir à R / T pour le reste de la procédure.
9. Retirer non intériorisé colorant en trois étapes, en utilisant des solutions à R / T. REMARQUE: Ces étapes sont mieux réalisées à la lumière minimale ambiante (stores d'occultation, éclairage rouge / orange de faible intensité) pour commencer l'œil sombre adaptation pour l'imagerie.
   1. Videz la solution de marquage de la vaisselle dans un bécher de déchets et rincer rapidement dans trois changements de solution saline sans colorant en succession rapide. Cela supprime le résidu styryl pyridinium solution de colorant adhérant à la préparation et à tout colorant qui departitions facilement à partir de membranes exposées.
   2. Incuber dans un dernier changement de sérum physiologique sans teinture pendant encore 30 minutes pour la plupart departition colorant restante à partir de membranes de surface, à savoir, un colorant non internalisés par les terminaux.
   3. Retirer le colorant persistant coincé to le feuillet externe des membranes exposées par chélation avec un dérivé sulfoné de b-cyclodextrine (Advasep-7, 1 mM, 5 min - voir le tableau 1). Ainsi, tout colorant restant sera dans les tissus.
10. Placer dans une solution saline sans colorant frais pour l'imagerie et sécher l'extérieur du plat à fond avec du papier de soie.
    NOTE: Les bornes sont maintenant prêts pour l'imagerie. Il est important d'être conscient que les terminaisons lancéolées sont en vie et, par conséquent, libérant lentement le styryle pyridinium colorant endocytose à nouveau. Bien que cela sera plus lente à R / T, il est important de réduire au minimum les retards avant / pendant la formation d'image. Si l'expérience exige l'étiquetage des préparations multiples, maintenir d'abord tous non marqués à 30 ° C. Ils seront viables pendant plusieurs heures. Puis étiquette de manière séquentielle à des intervalles, par marquage de la deuxième préparation (étapes 2.7 - 2.8.3), tandis que l'imagerie de la première.

3. Imaging Étiqueté Lancéolées Endings.

NOTE: L'observateurdoit être adapté à l'obscurité pour les étapes suivantes de formation d'image. L'acuité visuelle accrue cette offre signifie des niveaux de lumière d'excitation inférieure sont nécessaires pour trouver les follicules pour l'imagerie. Ceci est très important pour minimiser la phototoxicité plutôt que de réduire les inconvénients de photoblanchiment. Les radicaux libres générés par l'illumination de pleine intensité peuvent rapidement (en 60 sec) tuer les terminaisons nerveuses (GS Bewick, S. Fadul et WJ Betz, observations non publiées) vivant.

1. Avant l'imagerie, vérifier la préparation sous un stéréomicroscope de dissection et enlever soigneusement tous les débris de surface. On évite ainsi de contaminer l'autofluorescence des images.
   1. Monter le plat sur la scène d'un microscope à épifluorescence verticale avec un jeu de filtres fluorescéine standard (480-488 nm excitation 500-520 nm émission pour styryl pyridinium colorant).
2. Atténuer l'intensité de la lumière d'excitation avec des filtres de densité neutre jusqu'à ce que juste suffisante pour localiser confortablement le terminals.
3. Repérez follicules marqués en observant avec une faible (3.5x - 4x objectif à sec), puis progressivement des objectifs plus élevés (objectifs d'immersion 10x et 20x de l'eau) grossissement.
4. Capture d'images de terminaux lancéolées marqués par objectif 10x sec pour une faible puissance et 20x objectifs d'immersion de l'eau pour un grossissement plus élevé. Réduire le temps de l'intensité et exposition à la lumière (un temps d'intégration de la caméra de 0,5 à 1 sec est suggéré).
5. Capture d'images sur un appareil photo numérique standard et enregistrer des images sur le disque dur de l'ordinateur en utilisant un logiciel propriétaire. REMARQUE: Un exemple typique est représenté sur la figure 1.
6. Image ~ 20 terminaisons lancéolées de chaque préparation. Commencez par le plus de marge de l'arête de coupe à la base de la peau Pinna et le travail le long de cette marge imagerie chaque follicule à son tour. Travailler ensemble en chevauchant légèrement les champs parallèles à l'arête de coupe, en prenant soin de ne pas l'image même follicule deux fois et toutes celles qui sont évidemment endommagé. Noter lare sont généralement trop nombreux terminaux lancéolées à l'image tous avant de-coloration spontanée importante se produit. Ainsi, nous vous suggérons systématiquement échantillonnage de la population en utilisant le protocole suivant.
7. Après avoir terminé la bande marginale, déplacer un champ de largeur vers la base du pavillon, et répéter le processus dans le sens inverse.
8. Image tous les terminaux rencontrés, sauf les occasionnels clairement orientés beaucoup plus obliquement au plan optique et peu probable pour tenir entièrement dans le ROI d'analyse annulaire standard (voir la section 4). Ne pas exclure lancéolées anormalement plus ou moins brillants par rapport aux bornes environnantes, sauf si elles sont évidemment endommagées ou intensité de fond est particulièrement élevé, ce qui indique une lésion tissulaire localisée.
9. Jeter la préparation si plus de 10% de la surface de la peau / terminaux sont endommagés / inutilisable. NOTE: Comme lancéolées Destain avec le temps, l'imagerie complète chaque préparation dans les 20 minutes de la fin du lavage.
10. jef en utilisant plus d'une préparation, d'assurer des comparaisons d'intensité sont valables par les préparatifs de temps correspondant. Pour ce faire, le décalage timings de coloration chaque préparation par ~ 30 min, pour assurer la comparabilité des temps de-tache.
11. Pour surveiller de tache (exocytose), l'image de la même borne à 5 ou 10 minutes d'intervalle. Avec la pratique, il est possible de l'image jusqu'à 3 bornes séparées à chaque point de temps dans une préparation.

4. Analyse Étiqueté Lancéolées Endings.

Remarque: La procédure suivante est une méthode rapide pour analyser l'intensité terminal.

1. Faire une région annulaire d'intérêt (ROI) centrée sur la pointe de l'arbre de cheveux à la base du follicule (Figure 2). Fixer la circonférence intérieure de la ROI annulaire suffisamment large pour éviter la tige pilaire autofluorescence l'une quelconque des follicules à analyser mais encore englober l'ensemble de la fluorescence du terminal. Assurez-vous que la circonférence extérieure est assez grand pour enfermer le plus grand terminal susceptibles d'être rencontrés qui est orientée à proximité de l'axe principal optique / follicule.
2. Faire un retour sur investissement de fond à peu près égale dans la zone à l'anneau cible (carré ou un cercle, typiquement ~ 400 um ²⁾ pour déterminer l'intensité de coloration locale à proximité du terminal en cours d' analyse.
   Remarque: Les tailles de ces deux ROIs sont fixés au début de l'analyse et utilisés pour analyser tous les follicules / terminaux lancéolées ultérieurs à travers tous les préparatifs de toute une expérience. Donc, il est important de définir leurs paramètres avec soin au début.
3. Placez le retour sur investissement de fond assez proche du follicule pour représenter fond local dans les glandes sébacées qui sous-tendent les bornes, pas la peau d'intensité plus faible entre les follicules, mais attention à ne pas inclure toutes les régions terminales.
4. Notez l'intensité moyenne des deux ROIs en utilisant la «mesure» ou «analyser le retour sur investissement» en fonction des logiciels et de transfert des données vers une feuille de calcul.
5. Dans la feuille de calcul, pour chaque follicule individuel soustraire la moyenne locale d'intensité d'arrière-plan de celle de l'anneau pour donner une intensité nette. Cet ajustement pour le fond localisé réduit considérablement entre-follicule variabilité.

Les follicules pileux dans cette préparation de pinna sont facilement visibles sous transillumination sans fluorescence (figure 1A), illustrant la nature ultra-mince de la préparation et la relative facilité d'accès qu'il offre à ces bornes mécanosensoriels. Chacune est caractérisée par la base de l'arbre de cheveux de premier plan perçant le croissant sombre de la glande sébacée. Sous épifluorescence, les bornes lancéolées marqués entourant chaque follicule pileux sont clairement visibles et montrent généralement robuste absorption de colorant styryle spontanée (figure 1B). Cela se produit sans mouvement imposé. Les terminaux lancéolées sont vus pour encercler la tige du cheveu, bien que l'ampleur de l' encerclement est variable 6. Une grande partie de l'étiquetage est punctiformes (taches) plutôt que l'arrangement linéaire que l'on pourrait attendre. Le motif de punctiformes reflète les bornes étant observées dans un plan optique le long de la longueur de la borne. This préparation n'a reçu aucun traitement supplémentaire pour la visualisation après marquage, il est simplement transférée à un étage de microscope et imagé in situ, ce qui illustre encore la simplicité de cette préparation.

Exemple expériences auxquelles cette nouvelle préparation est adaptée sont présentés dans la figure 3. Il peut être utilisé pour étudier à la fois l' endocytose et exocytose dans les terminaux de vie, ainsi que leur modulation. Ainsi, par endocytose, les agonistes des récepteurs du glutamate peuvent augmenter l'intensité de marquage, tout en bloquant les canaux Ca2 + avec des ligands ou des cations tels que Mg 2+, Ni 2+ ou Cd 2+ elle diminue 2. En variante, cette préparation peut également être utilisé pour étudier la cinétique de l' exocytose, comme représenté sur la figure 3C. Tout d'abord, un terminal marqué est vu de coloration spontanément. Toutefois, cette Destain est accéléré par le stimulant l'exocytose, latrotoxine. Plus dequeues des résultats expérimentaux peuvent être vus dans les banques, RW et al. 2.

Figure 1. Robuste styryl Dye Labeling Enregistrée à la Pinna Mouse. (A) Une partie d'une préparation pinna non marquée dans l' illumination du champ lumineux, montrant comment clairement les follicules pileux apparaissent dans les zones défrichées des tissus recouvrant areolar / adipeux. Les sombres, généralement bilobées, formes de croissant sont des glandes sébacées entourant la tige du cheveu central. (B) une zone similaire, à un grossissement légèrement supérieur et imagé avec épifluorescence, montrant les terminaisons lancéolées marquées avec un colorant styryle. Barres d'échelle -. 40 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

"1">
Figure 2. Analyse de styryl Dye Étiquetage Intensité. (A) forme circulaire typique de l' étiquetage des follicules pileux avec un colorant styryle, centré sur l'axe de cheveux (non visible sur cette image). (B) de la région d'intérêt »L'analyse principale (ROI) est définie par un anneau type superposé à la position de la palissade des terminaisons nerveuses lancéolé entourant le follicule. Ce retour sur investissement est maintenue constante en forme et la surface pour une seule expérience pour assurer l'intensité de marquage peut être assez comparé entre les préparations et à travers tous les traitements. L' intensité nette de chaque ROI est calculé en soustrayant l'intensité d'une région de fond carrée ou circulaire adjacente (~ 400 um 2). Encore une fois, cette région de fond carré est maintenue constante dans la forme et la zone tout au long de toute expérience donnée.target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Étiquetage Intensité du follicule pileux Afférent Lanceloate Endings est pas normalement distribué, et peut être utilisé pour examiner les deux Endo et exocytose. Les données typiques de mesures d'intensité styryle de colorants dans les terminaux lancéolées spontanément marqués en utilisant la méthode d'analyse décrite ci - dessus. (A) l' intensité de marquage dans des conditions de contrôle (54 follicules, 4 épis) et mM glutamate 1 (42 follicules, 4 épis). Les valeurs d'intensité des terminaisons individuels sont affichés sous forme de diagrammes grappe de points. Chaque point représente l'intensité d'une palissade terminale autour d'un follicule. Notez que même dans des conditions de contrôle quelques points de données (follicules) sont extrêmement intenses, alors que la plupart sont regroupés à des intensités plus faibles. Le premier point à un intens particulierlité est tracée au centre et les points de données subséquents de la même intensité sont tracées progressivement plus latéralement de chaque côté. Ainsi, la propagation latérale représente la fréquence des follicules de toute intensité de marquage particulier. Les lignes horizontales représentent la médiane intervalle interquartile ± 25%. L'incubation avec 1 mM de glutamate augmente l'intensité moyenne de ~ 50% (*** p <0,001, Mann-Whitney), mais l'étiquetage peut être augmentée de 200 - 300% dans certains terminaux. (B) Les images montrant l' absorption de colorant amélioré glutamate médiée (endocytose). Incubation de la préparation des follicules pileux en glutamate (1 mM) augmente de façon marquée l'absorption de colorant styryle, comme le montre l'augmentation de l'intensité de marquage. Barre d'échelle 20 um. (C) Amélioration de la libération de colorant (exocytose). Après marquage, styryle colorant est spontanément libéré à nouveau, comme l'étiquetage à 0 min est nettement plus lumineux que à 60 min, même après soustraction de fond pour contrôler les photoblanchiment. Cette version est grandement potentiated par latrotoxine, un venin d'araignée constituant veuve noire, ce qui déclenche incontrôlée des vésicules exocytose. Après 60 min de la toxine, l'étiquetage terminal est presque indétectable. Cette réversibilité du marquage colorant styryle soutient l'hypothèse que la fluorescence est due à la borne intériorisation locale lors du recyclage de vésicules synaptiques analogue. Barre d' échelle 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs ont rien à révéler.