Spiral Ganglion Neuron Explantation Culture et électrophysiologie sur multi-électrodes Arrays

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, 360 millions de personnes dans le monde souffrent d’une perte auditive aux conséquences profondes sur la vie professionnelle et privée. Les appareils auditifs peuvent restaurer la fonction sensorielle dans les formes modérées de perte auditive ; cependant, pour les cas les plus graves, l’option de traitement la plus efficace est un dispositif prothétique appelé implant cochléaire (IC). Les IC contiennent un réseau d’électrodes linéaires pouvant contenir jusqu’à 24 électrodes, qui est inséré chirurgicalement dans la rampe tympanique de la cochlée. Les électrodes stimulent directement les neurones du ganglion spiral, formant le nerf auditif ¹.

Avec plus de 300 000 dispositifs implantés dans le monde, les IC sont des implants médicaux très efficaces et se classent parmi les procédures les plus rentables jamais rapportées. Malgré son succès, l’implant cochléaire présente encore des limites telles qu’une résolution en fréquence réduite par rapport à l’audition physiologique. Cela peut entraîner des déficits dans la communication efficace en groupe ou dans des environnements bruyants, et la capacité de déchiffrer des sons très complexes tels que la musique. Cette résolution en fréquence réduite est probablement due à l’écart entre les électrodes CI et les neurones du ganglion spiral, conduisant à la stimulation de grands groupes de neurones. Cet écart est de l’ordre de centaines de micromètres ^2,3. L’élimination de cet écart faciliterait la stimulation de plus petits groupes de neurones par électrode, augmentant ainsi la résolution en fréquence et les performances globales du dispositif ⁴.

Pour étudier l’influence de l’écart entre l’électrode et le neurone et l’effet de différents protocoles de stimulation optimisés, nous avons développé un bioessai in vitro basé sur une caractérisation électrophysiologique non invasive des SGN sur des réseaux multi-électrodes (MEA) ⁵. De plus, les MEA peuvent être facilement modifiés pour faire varier la forme, la taille, le matériau et la rugosité de la surface, afin d’optimiser l’interface neurone-électrode. Ce qui suit est un protocole étape par étape pour obtenir de manière reproductible des enregistrements à partir de cultures de neurones murins du ganglion spiralé et évaluer la dépendance aux paramètres mentionnés ci-dessus.

Les soins et l'expérimentation a été réalisée en conformité avec les directives des autorités locales suisse (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Suisse).

1. Préparer des solutions pour l'expérimentation

1. Préparer la solution de revêtement matrice extracellulaire (ECM) (voir Tableau des Matériaux, point 6): Thaw ECM mélange sur la glace. Diluer le mélange ECM 1:10 dans un milieu de culture de base (sans facteurs neurotrophiques ou de sérum bovin fœtal (FBS)) et de stocker sur la glace.
2. Préparer le milieu de culture (voir Matériel de table, point 1): Préparer un stock de milieu Neurobasal ne contenant pas de FBS ou dérivé du cerveau facteur neurotrophique (BDNF). Supplémenter des milieux frais Neurobasal avec du FBS (10%) et le BDNF (5 ng / ml) juste avant l'addition à la culture cellulaire.
3. Préparer la solution extracellulaire (voir Tableau des Matériaux, point 2).

2. Lavage et stérilisation des AME

(figure 1E). Chaque électrode a une taille de 40 x 40 ^um2 avec un espacement de 200 um de centre à centre. Les électrodes sont constituées de platine. Les électrodes sont connectées à des contacts correspondants d'un circuit constitué d'oxyde d'indium et d'étain. Ce circuit est isolée par une couche de 5 um de SU-8. Voir le tableau Matériel pour plus de détails sur le fournisseur. D'autres dispositions des AME peuvent convenir à ces expériences.

1. Pour les nouveaux AME: Rincez-les en immergeant dans 70% d'éthanol pendant 30 secondes et se laver avec de l'eau distillée pendant 30 sec. Travailler dans une hotte à flux laminaire.
2. Laissez le MEA sécher pendant 30 min dans une hotte à flux laminaire.
3. Mettez chaque MEA dans une boîte de Petri stérile individuel (35 mm x 10 mm) et sceller avec du papier. Les AME peuvent être stockés jusqu'à utilisation.
4. Pour AME occasion: Incuber les AME dans une boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) contenant 1 ml de solut enzymatiqueion (voir tableau des matériaux, point 6) O / N sur un agitateur orbital à température ambiante pour éliminer la matière biologique. Puis continuer comme à l'étape 2.1.
   REMARQUE: Manipulez les AME avec précaution en utilisant une pince à bouts recouverts de caoutchouc.

3. Préparation des AME pour les expériences culturelles

1. Retirer la feuille d'étanchéité et laisser la MEA dans la boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) pour l'ensemble de l'expérience.
2. Enduire les AME avec la solution préparée en 1.1: Utiliser un 200 pointe ul de pipette à froid (stocké à -20 ° C) à pipeter 50 pi de solution de revêtement à chaque MEA, couvrant toute la surface de l'électrode.
3. Laisser meas manteau pendant 30 min à 1 heure à température ambiante.
4. Retirer la solution de revêtement à l'aide d'une pipette. Appliquer 100 ul de milieu de culture supplémenté avec 10% de FBS et 5 ng / ml de BDNF et le laisser à la température ambiante jusqu'à ce que le placage du tissu.
5. Placez 2 boîtes de Pétri contenant les AME enrobés dans une grande boîte de Pétri (94 mm x 16 mm) et ajouter une troisième petite boîte de Pétri contenant 1,5ml de tampon phosphate salin (PBS) pour l'humidification.
   REMARQUE: Ajout d'une petite boîte de Pétri (étape 3.5) contenant du PBS est essentiel pour minimiser considérablement l'évaporation du milieu de culture.

4. Spiral Ganglion Dissection

NOTE: la dissection brute peut se faire en dehors de la hotte à flux laminaire (étape 4.1 à 4.4). Pour des conditions stériles fin de dissection (débit de la hotte laminaire) sont obligatoires (de l'étape 4.5).

1. Euthanasier animaux (vieille souris 5-7 jours) par décapitation sans anesthésie préalable.
2. Stériliser la tête par pulvérisation avec 70% d'éthanol.
3. En tenant la tête, couper la connexion entre la peau et le crâne avec un ciseau pointu / pointu le long de la ligne sagittale.
4. Couper le crâne sagittale et enlever le cerveau en utilisant des ciseaux pointus / contondants.
5. Couper les os temporaux du crâne et de placer ceux dans une boîte de Pétri contenant une solution saline équilibrée de la glace froide stérile Hanks (HBSS).
6. En utilisant une dissectiontion microscope, disséquer la bulle tympanique à l'aide de pinces fines et d'isoler l'oreille interne.
7. Retirer l'os de la cochlée, en utilisant une pince fine.
8. Retirez le ligament spiral et strie vasculaire (SV), ainsi que par la tenue avec une pince la partie basale de la ganglion spiral (SG) et la SV et dérouler lentement le SV de la base -à-apex
9. Isoler l'organe de Corti (OC), le SG et la columelle (Figure 1A - C)
10. Séparer l'OC du SG et modiolus en maintenant avec une pince la partie basale de la SG et le CO et le déroulement lentement le CO de la base à l'apex.
11. Explants latérales Cut (200 à 500 um de diamètre) du ganglion spiral encore attachés à la columelle (figure 1D) à l' aide d' une pince et d' un micro scalpel.

5. Spiral Ganglion Explantation Culture sur les AME

1. Placer deux explants ganglionnaires à côté des électrodes sur la MEA préparée précédemment avec 100 ul de milieu de culture.
2. Placer l'organe de Corti d'environ 5 mm de la surface de l'électrode.
3. Utiliser une pince pour épingler les explants et l'organe de Corti sur la MEA, tout en évitant d'endommager le tissu.
4. Placez les AME avec précaution dans l'incubateur et la culture à 37 ° C et 5% de CO _2. Le lendemain, une inspection visuelle que les explants ont attaché à l'AEM.
   NOTE: Si explants n'a pas joint O / N, ils vont rarement faire au cours des prochains jours. Le CO est placé à côté de la culture pour le soutien trophique / neurotrophique.
5. Ajouter 100 ul de milieu de culture contenant 10% de FBS et du BDNF par jour pendant 5 jours consécutifs.
6. Au jour 6, ajouter 2 ml de milieu de culture contenant 10% de FBS et 5 ng / ml de BDNF et de la culture du tissu pendant une période supplémentaire de 13 jours.

6. électrophysiologiques Recordings à enquêter sur les activités à charge spontanée et l'électrode de stimulation

1. Laver la culture de MEA avec extracellulaire afinrésolu- préparé à l'étape 1.3, à la température ambiante.
2. Sécher les contacts avec un tissu et monter la MEA sur la configuration de la MEA.
   NOTE: Pour garder la culture humide pendant le montage, ajouter une petite goutte de solution extracellulaire à la culture.
3. Ajouter 300 pi de solution extracellulaire et attendre 10 minutes avant l'enregistrement, pour permettre au système de se stabiliser.
4. Enregistrer l'activité spontanée pendant 2 min de toutes les électrodes en appuyant sur la touche d'enregistrement du logiciel / acquérir et identifier des électrodes d'enregistrement.
5. La stimulation de l' électrode MEA: Sélectionnez l'amplitude / durée / forme du stimulus sur le logiciel approprié et appliquer à plusieurs électrodes consécutivement comme décrit ^13. Sélectionnez les électrodes à base de ceux présentant une activité spontanée (comme dans l'étape 6.4). Enregistrement à partir de toutes les électrodes restantes.
6. Pour exclure artefact de stimulation, de stimuler de la même électrode 10 fois. Si la culture répond au moins 8 fois sur 10, on peut considérer commeréponse positive lors de la stimulation de l'électrode induite.
7. Pour identifier le bruit de fond, appliquer tétrodotoxine (TTX) à la cultureat une concentration de 1 uM, pour bloquer les canaux et enregistrement sodiques voltage-dépendants pendant 2 min. Utilisez cette option pour effectuer une détection pic (7.1 et 7.2).

Analyse 7. Données

NOTE: L' analyse des données a été précédemment décrit en détail dans ⁶ et ^5. Pour des détails sur les logiciels utilisés dans cette étude voir tableau des matériaux, point 7.

1. En utilisant le logiciel approprié de détecter l'activité spontanée pour chaque électrode utilisant un détecteur basé sur les écarts-types et un discriminateur ultérieure. Cette procédure est décrite dans ^6. Activité apparaît comme rapides transitoires de tension (<5 ms).
2. Choisissez un seuil qui se traduit par aucune activité lors de l'analyse de la TTX traitée samples.Adapt la valeur seuil pour chaque expérience de discriminer entre les faux positive et détection de faux négatifs.
3. Utilisation d'un logiciel approprié d' observer l'activité neuronale détectée de chaque électrode comme un complot tramé selon des procédures standard (voir Figure 2A - C).
4. Déterminer et afficher l'activité totale du réseau en additionnant tous les événements détectés dans une fenêtre glissante de 10 msec, décalées par pas de 1 ms.
5. Détecter l'activité induite par la stimulation par l'affichage des données brutes en utilisant un logiciel d'analyse approprié. Identifier les pointes simples déconnecté manuellement. Pics simples apparaissent transitoires de tension aussi rapide, survenant après l'artefact de stimulation (tête de flèche sur la figure 2F). Un exemple est représenté sur la figure 2E.
6. En fonction de l'expérience, l' analyse du nombre d'électrodes ayant répondu, le seuil nécessaire pour obtenir une réponse, le nombre de potentiels d'action par des électrodes et d' autres paramètres d'intérêt ^5.

8. Tissue Fixation et Immunohistochemistry

NOTE: Le processus de coloration va détruire la MEA. Voir le tableau Matériel (point 4) pour les réactifs.

1. Directement après l'enregistrement laver les cultures avec 37 ° C chaud PBS trois fois. Jeter le PBS et on applique paraformaldehyde à 4% (PFA) (dans du PBS), préchauffé à 37 ° C pendant 10 min.
   ATTENTION: PFA est toxique. Travailler dans une hotte chimique avec une protection appropriée et une solution de défausse selon les directives.
2. Laver les cultures trois fois avec du PBS et on bloque avec 2% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS (0,01% de Triton-X100) pendant 2 heures.
3. Ajouter le premier anticorps (anti-BIII tubuline, anticorps TUJ) dilué dans du PBS (2% de BSA et 0,01% de Triton-X100) et laisser O / N à 4 ° C. Laver la culture à trois reprises avec du PBS.
   NOTE: A partir de maintenant garder l'échantillon dans l'obscurité aussi souvent que possible pour réduire au minimum le blanchiment de l'anticorps marqué par fluorescence secondaire.
4. Ajouter l'anticorps secondaire dilué dans du PBS (BSA 2% d'uned 0,01% de Triton-X100) et incuber pendant 2 heures à 1 à la température ambiante. Pour colorer les noyaux ajouter 1: 10,000 DAPI (1 mg / ml de bouillon) pendant 10 min.
5. Laver trois fois avec PBS et monter les échantillons en arrière pour fines lamelles (24 x 50 mm ²⁾ en utilisant un milieu de montage (voir tableau des matériaux, point 4). L'image en utilisant un microscope à fluorescence avec 5X et 20X grossissement.

La figure 1 résume la procédure d'isolement des tissus, la préparation et la culture sur la MEA. Nous montrons les étapes successives de la dissection des tissus pour isoler le ganglion spiral (SG) de l'épithélium sensoriel de l'organe de Corti (OC) et strie vasculaire (SV) et annexé ligament spirale (Figure 1 A - C). Des explants de ganglion spiral (3-4 en nombre) sont découpées avec des micro-ciseaux du ganglion comme cela est schématiquement illustré sur la figure 1D et placé sur la MEA (figure 1E), sur la zone occupée d'électrode (2,2 mm 2). Le CO est placé à proximité, à l'extérieur de la surface de l'électrode. La croissance de la culture peut être suivie dans le temps (figure 1G). Un schéma du protocole est illustré à la figure 1F. l'activité électrophysiologique peut être détectée au bout de 6 jours de culture, qui augmentent avec le temps de culture prolongée. We recommand l' évaluation de 18 cultures de jour qui produisent un nombre significativement plus élevés d'électrodes d'enregistrement par rapport à des points de temps antérieurs 5.

Figure 1. Préparation de la culture cellulaire. (A) fraîchement disséquée souris oreille interne. Blanc ligne pointillée indique l'emplacement de la cochlée, noir ligne pointillée indique la région vestibulaire. (B) l' oreille interne de souris après le retrait de la paroi osseuse cochléaire. virages cochléaires sont indiqués par des lignes en pointillés blancs. (C) Le ganglion spiral (SG) et modiolus, l'organe de Corti (OC) et la strie vasculaire (SV) et Ligament spirale sont présentés après dissection. (D) Schéma du SG et OC dissection et préparation SG explant {figure adaptée de 5 avec l' approbation de l'éditeur}. (E) Illustration du réseau d'électrodes multiples utilisés dans cette étude. recodageles électrodes sont organisés dans une grille rectangulaire dans le centre , et occupent une surface de 2,2 mm 2. électrodes 4 au sol et des contacts latéraux sont illustrés. (F) Schéma du protocole de culture. Les enregistrements sont effectués au jour 18. (G) des images représentatives (images de champ lumineux) et les systèmes de explants SG sur MEA surveillé dans la culture au jour 1, 6 et 18. Les barres d'échelle = 400 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.

L'activité spontanée peut être détectée sur MEA et montré comme un complot tramé où chaque ligne de la parcelle représente un pic détecté. Un exemple représentatif montrant l' activité spontanée détectée à partir de plusieurs électrodes (différentes couleurs sur les graphiques) est représenté (figure 2A, 2B et 2C).

(figure 2D), 5 électrodes répondant (traces rouges) et des électrodes non-réponse (traces bleues) est représentée sur la figure 2E. Pour ces expériences, une électrode a été utilisée pour la stimulation et toutes les autres électrodes pour l'enregistrement. Simple action potentiels sont apparus 1 msec après l'artefact de stimulation (tête de flèche noire). La MEA peut être immunocolorée à la fin de la procédure afin d'évaluer la couverture des processus neuronaux sur la zone de l'électrode. L'électrode indiquée en vert sur la figure 2F a été utilisé pour la stimulation, et les électrodes indiquées en rouge ont été utilisés pour enregistrer les réponses (Figure 2E).

Figure 2. Des enregistrements de données sur MEA. (A </ Strong>) Des traces d'enregistrements originaux des électrodes six des 63 présentant une activité spontanée. Plot (B) Raster des six électrodes de la figure 2A après la détection de pic. Chaque barre représente un potentiel d'action. (C) parcelle Raster y compris toutes les électrodes (comme dans A et B) L' activité est enregistrée à partir de 63 électrodes (chaînes numériques 0-63) pendant 2 min. (D) une stimulation biphasique , avec une durée totale de 80 microsecondes et une amplitude de 80 pA a été utilisée pour la stimulation de la culture d'une électrode (E58 sur la figure 2F). (E) Exemple représentatif des traces de données brutes obtenues après stimulation de l' électrode 58 montrant des potentiels d'action (traces rouges) ou sans réponses (traces bleues) après stimulation (noir tête de flèche). (F) la culture sur ganglionnaires MEA immunocolorées pour le marqueur neuronal TUJ (vert) à la fin de l'expérience pour visualiser neuro la couverture finale de la zone d'électrode {figure adaptée de 5 avec l' approbation de l'éditeur}. Electrode 58 utilisée pour la stimulation est indiquée en vert, les électrodes ont répondu sont indiquées en rouge. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Enfin, la configuration de la MEA permet d'étudier une éventuelle modification de la surface de l'électrode qui peut augmenter la sensibilité d'enregistrement. Deux électrodes de MEA disponibles dans le commerce ont été utilisés dans cette étude avec deux surfaces de platine différentes: gris platine (gris Pt), constitué d'un 150 nm couche de Pt d'épaisseur (impédance: 400 kQ / 1 KHz), et noir de platine, (noir, Pt), obtenus par dépôt électrochimique de Pt à la fin du processus de micro-fabrication (impédance: 20 kQ / 1 kHz). Voir le tableau des matériaux (point 6) pour plus de détails.

Figure 3. Comparaison de Grey vs électrodes Noir Pt. Deux types d'électrodes (gris et noir Pt) ont été comparés côte à côte avec 12 cultures des AME indépendants, 6 sur chaque type de MEA. (A) Le nombre total de reélectrodes correspondan- par expérience est montré. (B) de seuil Amplitude pour obtenir une réponse, mesurée à l' aide de 30-35 paires d'électrodes indépendantes dans 6 expériences des AME indépendants est montré. Les données sont présentées comme de moyen de SD. (Test t de Student p <0,001) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.