Isolation de F₁-ATPase de la protiste parasite Trypanosoma brucei

Les type F ATP synthases sont membranaires tournantes complexes multiprotéiques que la translocation de protons couple à travers les membranes transduction de l’énergie des bactéries, des mitochondries et chloroplastes avec la formation d’ATP. Les détails moléculaires du mécanisme de rotation de la synthèse d’ATP sont connus principalement en raison des études structurales de purifiée bactérienne et mitochondrial ATP synthases et leurs subcomplexes¹. F-type ATP synthase est organisé dans les fractions membranaires intrinsèques et extrinsèques à la membrane. La partie membranaire-extrinsèque, appelée F₁-ATPase, contient trois sites catalytiques, où la phosphorylation de l’adénosine diphosphate (ADP) à ATP ou la réaction inverse se produit. F₁-ATPase peut être libéré expérimentalement la portion membranaires intrinsèques tout en conservant sa capacité à hydrolyser, mais pas synthétiser, ATP. Le secteur de membrane-bondissent, dénommé F_o, intervient dans la translocation de la protéine, qui entraîne la rotation de la partie centrale de l’enzyme. Les secteurs de_o F et de F₁ sont reliés par des tiges centrales et périphériques.

La première tente de purifier le F₁-ATPase de la levure de bière et de la date de mitochondries de coeur de boeuf vers les années 1960. Ces protocoles utilisés extraites des mitochondries, qui ont été perturbées par la sonication, fractionnée par précipitation au sulfate d’ammonium ou de protamine, suivie par chromatographie facultatif étapes et traitement thermique^{2,3,4 ,5,6}. La purification a été grandement améliorée et simplifiée par l’utilisation du chloroforme, qui libère facilement le F₁-ATPase de la membrane mitochondriale des fragments⁷. L’extraction de chloroforme a ensuite été utilisée pour extraire des F₁- ATPases de divers animaux, végétaux et des sources bactériennes (p. ex., foie de rat⁸, maïs⁹, Arum maculatum¹⁰et Escherichia coli ¹¹). Outre la purification du chloroforme-sortie F₁-ATPase par chromatographie d’affinité ou exclusion stérique (SEC) a produit une protéine pure hautement complexe, qui convenait pour la détermination de la structure à haute résolution par cristallographie aux rayons x, comme documenté par les structures de F₁-ATPase de coeur bovine^12,13 et¹⁴de la Saccharomyces cerevisiae. F₁-ATPase structures ont été également déterminées d’organismes qui sont difficiles à cultiver et, par conséquent, la quantité de la matière biologique initiale était limitée. Dans ce cas, le F₁-ATPase sous-unités ont été artificiellement exprimées et assemblées dans le complexe chez e. coli, et l’ensemble hétérologue enzyme a été purifiée par affinité Chromatographie via une sous-unité étiquetée. Cette approche a conduit à la détermination de F₁-structures de l’ATPase de deux espèces de bactéries thermophiles, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ et thermarum Caldalkalibacillus^{16, 17}. Toutefois, cette méthode est plutôt impropre à eucaryotes F₁- ATPases puisqu’elle s’appuie sur l’appareil protheosynthetic procaryote, transformation post-traductionnelle et assemblage complexe.

L’extraction axée sur le chloroforme a été précédemment utilisée pour isoler F₁- ATPases de digène unicellulaires parasites Trypanosoma cruzi¹⁸ et T. brucei¹⁹, importants pathogènes chez les mammifères d’Amérique et Les trypanosomiases africaines, respectivement et de monogénique insecte parasite Crithidia fasciculata²⁰. Ces purifications conduit seulement à une simple description de la F₁- ATPases, puisqu’aucune demande en aval ont été utilisées pour caractériser complètement la composition, structure et propriétés enzymatiques du complexe. Cet article décrit une méthode optimisée pour F₁-purification de l’ATPase de l’étape de cycle de vie insectes cultivées de T. brucei. La méthode est élaborée selon les protocoles établis pour l’isolement de bovins et la levure F₁- ATPases^21,22. La procédure donne très pure et homogène enzyme appropriée pour in vitro enzymatiques et inhibiteur des dosages, protéomiques détaillées caractérisation par spectrométrie de masse²³et de détermination de structure²⁴. Le protocole de purification et de la connaissance de la F₁-structure de l’ATPase au niveau atomique ouvre une possibilité pour la conception d’écrans pour identifier les inhibiteurs de petites molécules et aider au développement de nouveaux médicaments contre les trypanosomiases africaines. En outre, le protocole peut être adapté pour purifier F₁-ATPase provenant d’autres organismes.

1. tampons et Solutions

1. Préparer les solutions énumérées ci-dessous. Une solution contenant toutes les mémoires tampons pour chromatographie en phase liquide. Ajouter juste avant l’utilisation des inhibiteurs de ADP, benzamidine et protéase.
   1. Préparer un tampon tampon A: 50 mM Tris avec l’acide chlorhydrique (Tris-HCl) pH 8,0, 0,25 M de sucrose, benzamidine 5 mM, 5 mM, inhibiteurs d’acide (ACA) et protéase aminocaproïque (10 µM amastatine 50 µM bestatine, 50 µM pepstatine, 50 µM leupeptine et 50 µM diprotin A).
   2. Préparer le tampon B: 50 millimètres Tris-HCl pH 8,0, 0,25 M de sucrose, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 4 mM, benzamidine 5 mM, 5 mM ACA, 1 mM ADP et inhibiteurs de la protéase (10 µM amastatine 50 µM bestatine, 50 µM pepstatine, 50 µM leupeptine et 50 µM diprotin A).
   3. Préparer le tampon Q-colonne : 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO₄, benzamidine 5 mM, 5 mM ACA et 1 mM ADP.
   4. Préparer le tampon d’élution Q-colonne : tampon Q-colonne avec 1 M NaCl.
   5. Préparer le tampon SEC : 20 millimètres Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
   6. Préparer le chloroforme imprégnée de 2 M Tris-HCl pH 8,5. Mélange de chloroforme avec 2 M Tris-HCl pH 8,5 à environ 1:1 ratio dans un flacon à bouchon vissé, agiter, laisser les phases organiques et aqueuses séparées et mesurer le pH de la couche aqueuse supérieure avec une bande de papier indicateur de pH. Conserver à température ambiante. Juste avant utilisation, agiter à nouveau et laisser les phases distinctes. Utiliser la couche inférieure de chloroforme.
      Attention : Le chloroforme est volatile et irritant pour les yeux et la peau. Travailler sous une hotte. Utiliser des lunettes de sécurité lors de la secouant.

2. préparation des particules sub-mitochondriale

1. Remettre en suspension les vésicules mitochondriales (mitoplasts) isolées par lyse hypotonique²⁵ de 1 x 10¹¹ à 2 x 10¹¹ cellules de procycliques T. brucei dans 5 mL de tampon glacee A. garder l’échantillon réfrigéré jusqu'à l’étape 3.2.
2. Déterminer la concentration de protéines dans la suspension par le bicinchoninic acide (BCA) protéine test²⁶ selon les instructions du fabricant.
   1. Utiliser une série de dilutions de l’albumine sérique bovine (BSA) dans de l’eau ultrapure pour construire la courbe d’étalonnage. Diluer une petite quantité d’échantillon de 20 à 100 fois avec de l’eau ultrapure à s’intégrer dans les normes de la gamme de BSA.
   2. Calculer la quantité de protéines totales dans l’échantillon et abaisser la concentration de protéine à 16 mg/mL en diluant il avec tampon supplémentaire A.
3. Fragment de mitoplasts en vésicules inversées et de morceaux de membrane par sonication de la suspension 7 x 15 s avec une énergie totale de 70 à 100 J par impulsion avec un microtip de 3,9 mm de diamètre. Si l’homogénéisateur ultrasonique n’affiche pas la production d’énergie, démarrer l’optimisation à 50 % de la puissance maximale. Incuber l’échantillon sur la glace pendant 30 s entre les impulsions. Après la sonication, la suspension devient légèrement plus foncée.
4. Sédiments de la membrane des fragments par ultracentrifugation à 54 000 x g pendant 16 h ou à 98 000 x g pendant 5 h à 4 ° C. Éliminer le surnageant et procéder à l’extraction de chloroforme, ou flash-gel le sédiment dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C.

3. sortie du F₁-ATPase de la Membrane par le chloroforme

1. Resuspendre le culot des membranes mitochondriales dans tampon B à l’aide d’un petit homogénisateur Dounce. Calculer le volume de tampon B basé sur la quantité totale de mémoire tampon utilisée en formule étapes 2.1 et 2.2 en utilisant ce qui suit : volume (tampon B) = volume (tampons A) x 12/21. Transférer la suspension dans un tube conique 15 ou 50 mL.
2. Retirer l’échantillon de glace et, par la suite, garder l’échantillon et toutes les solutions pour être utilisé à température ambiante.
3. Ajouter chloroforme imprégnée de 2 M Tris-HCl pH 8,5 ; le volume du chloroforme à ajouter est égale à la moitié du volume de la suspension. Bien refermer le bouchon. Agiter vigoureusement pendant exactement 20 s. il centrifuger immédiatement à 8 400 g pendant 5 min à température ambiante.
4. Transférer la phase aqueuse nuageuse supérieure à 1,6 mL microtubes. Ajouter des inhibiteurs de la protéase (10 µM amastatine, 50 µM bestatine, 50 µM pepstatine, 50 µM leupeptine et 50 µM diprotin A) pour remplacer les inhibiteurs éliminés par le traitement de chloroforme. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 30 min à température ambiante. Transférer le surnageant pour microtubes fraîches et répétez la centrifugation pour enlever toute matière insoluble.

4. échange d’anions par chromatographie

1. Équilibrer la colonne d’échangeurs (Q) 5 mL anion attachée à un système de chromatographie liquide rapide-protéine avec le tampon de Q-colonne à un débit de 5 mL/min jusqu'à ce que l’absorbance à 280 nm et la conductivité stabilisent (environ 50 mL de tampon).
2. Charger le surnageant à l’étape 3.3 sur la colonne équilibrée à un débit de 1 mL/min. Attendez jusqu'à ce que l’absorbance à 280 nm se stabilise à l’arrière-plan. Appliquer un dégradé linéaire de 25 mL de la mémoire tampon d’élution Q-colonne de 0 % à 100 % à un débit de 0,5 mL/min. frais virés fractions de 1 mL.
3. Dosage des fractions individuelles correspondant au pic majeur d’élution pour activité hydrolytique de l’ATP par l’ATPase Pullman dosage² à pH 8,0. Utiliser 10 µL de chaque fraction par 1 mL du mélange réactionnel. Mettre en commun les fractions qui présentent une activité ATPasique. Éventuellement, séparer de 10 µL de chaque fraction sur gel de polyacrylamide électrophorèse SDS phosphate (SDS-PAGE) et tacher le gel par le bleu de Coomassie pour visualiser chaque F₁-sous-unités ATPase et protéines contaminantes.
4. Concentré de l’échantillon groupé par ultrafiltration membranaire en utilisant une colonne avec un filtre MWCO PES 100 000 à 200-500 µL. passer à SEC ou au magasin de l’échantillon pendant une nuit à température ambiante.

5. exclusion stérique

1. Equilibrer la colonne SEC attachée à un système de chromatographie en phase liquide avec au moins 48 mL (deux volumes de colonne) du tampon SEC à un débit de 0,5 mL/min.
2. Déposer l’échantillon sur la colonne et exécutez-le chromatographie d’un débit de 0,25 mL/min. fractions de 0,25 mL virées.
3. Exécutez 10 µL des fractions qui correspondent aux sommets de la trace d’absorbance UV_280nm sur SDS-PAGE et leur tache de bleu de Coomassie. Le premier pic majeur contient le F₁-ATPase. Doser les fractions correspondant à ce sommet pour la sensibilité hydrolytique de l’activité et azoture ATP par le dosage de l’ATPase de Pullman. Déterminer la concentration de protéine par le dosage de la BCA.
4. Garder les purifiés F₁-ATPase à température ambiante et l’utiliser au bout de 3 jours après purification pour applications en aval. Vous pouvez également concentrer l’échantillon en utilisant une colonne avec un filtre de 100 000 MWCO PES à > 1,5 mg / mL, précipité il en le mélangeant avec saturée de sulfate d’ammonium ajusté à pH 8,0 (1. 2 x le volume) et conserver à 4 ° C.

Une purification typique (Figure 1) commence par des vésicules mitochondriales (mitoplasts) isolés sur le gradient de Percoll du mi-prophase lysé 1 x 1011 à 2 x 1011 procycliques de cellules de T. brucei 25 cultivés dans la norme riche en glucose moyen SDM-7927. Les mitoplasts sont fragmentées par sonication, filée, et le surnageant contenant de matrice est ignoré. Les membranes mitochondriales sont traités avec du chloroforme pour libérer le F1-ATPase. Après centrifugation, la phase organique et interphase précipité sont ignorées. La phase aqueuse est fractionnée par chromatographie échangeuse d’ions sur le Quaternaire d’ammonium, un échangeur d’anions forts (Figure 2 a). Les fractions qui correspondent à l’élution majeure de pointe et contiennent le F1-ATPase sont mis en commun et concentrées. Ce matériau sert comme entrée pour SEC, ce qui élimine les impuretés résiduelles. Le contaminant majeur est dihydrolipoyl déshydrogénase, qui élue de la colonne SEC comme un pic discrète, marqué par la barre verte sombre Figure2 b. La F1-ATPase élue dans le premier pic dominant, en grande partie symétrique (Figure 2 b).

L’état d’avancement de la purification est suivie de l’analyse de protéine BCA (ou un autre dosage de protéines communes), SDS-PAGE et le suivi de l’activité ATPasique. La vitesse d’hydrolyse de l’ATP est mesurée par l’ATP Pullman régénérant dosage2, basé sur la diminution de l’absorbance du NADH dans la réaction de couplage. L’azoture de sodium, un inhibiteur établi F1-ATPase, est utilisée à une concentration de 2 mM pour déterminer la proportion de la F1-ATPase-hydrolyse de l’ATP. En règle générale, le matériel d’entrée contient environ 150-300 mg de protéines mitochondriales, selon le nombre de cellules utilisées comme source de vésicules mitochondriales. La proportion d’azide sensible de l’activité ATPase totale est d’environ 30 à 40 % à ce stade. Après l’extraction de chloroforme, plus de 90 % de l’activité ATPasique de l’échantillon est contribue à la F1-ATPase. Les purifiés F1- ATPase est pratiquement entièrement sensible au traitement azoture (l’ATPase résiduelle minimale activité peut être attribuée à l’autolyse de fond ATP) et représente environ 1 % de la masse des protéines d’entrée, avec un rendement approximatif de 1 - 1,5 mg F1-ATPase par 1 x 1011 éléments (tableau 1). Un patron de bandes typiques après la séparation de la purifiée F1-ATPase sur gel SDS-PAGE, suivie de coloration au bleu de Coomassie est illustré à la Figure 2. Les protéines ont été identifiées en masse de peptide empreintes et caractérisé en détail par divers spectrométrie de masse des approches23. Sporadiques faibles bandes visibles au-dessus de la bande de la sous-unité β représentent subcomplexes de la tête de3 α3β (dimères et oligomères de sous-unités α - et β-) et sont dépourvues de tout contaminant détectables par les techniques de spectrométrie de masse sensible. Les purifiés F1-ATPase peut être conservée pendant plusieurs jours dans le tampon SEC à température ambiante. Par ailleurs, le F1-ATPase concentrée à ≥ 2 mg/mL peut être précipité par un volume égal de saturés sulfate d’ammonium dans le tampon SEC, dont le pH est ajusté à 8.0 et stockés à 4 ° C. Pour au moins six mois après les précipitations, l’enzyme active avec aucune dégradation évidente de toute sous-unité peut être obtenue par redissolution le matériel précipité dans la mémoire tampon SEC ou une solution similaire. Cependant, plus d’un mois de stockage ne convient pas de cristallisation, tel que déterminé empiriquement.

Figure 1 : Schéma de la procédure de purification. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Purification en deux étapes du chloroforme-sortie F1-ATPase par chromatographie liquide à. (A) profil d’élution de chromatographie échangeuse d’anions (panneau du haut) et certaines fractions séparées sur le gel de Tris-glycine SDS-PAGE 10-20 % teinté avec un colorant bleu de Coomassie (panneau inférieur). Trace de bleu : absorbance UV à 280 nm ; trace rouge : concentration de NaCl dans la mémoire tampon d’élution. Entrée : le F1-ATPase libéré par le chloroforme ; FT : intermédiaire. (B) profil d’élution des s (panneau du haut) et des fractions sélectionnées séparés sur gel SDS-PAGE teinté avec un colorant bleu de Coomassie (panneau inférieur). Entrée : mis en commun les fractions de chromatographie échangeuse d’anion contenant F1-ATPase. Les barres de couleur dans les groupes A et B marquent les fractions dans les profils d’élution qui ont été analysés par SDS-PAGE et les voies correspondantes dans le gel respectif. (C) identité des protéines individuelles de l’isolé F1-ATPase tels qu’identifiés par spectrométrie de masse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Exemple de la progression typique et le rendement de la F1-purification de l’ATPase des mitochondries isolées de 1 x 1011 cellules de T. brucei procycliques.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.