Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval

Ce travail illustre la dissection des régions du cerveau congelées pour l’extraction de l’acide ou des protéines nucléiques de haute qualité à l’aide d’une référence, comme l’Allen Mouse Brain Atlas¹, comme guide. Dans cette technique, les cerveaux sont surgelés et stockés à -80 oC pour la section et la dissection ultérieures tout en étant maintenus dans un état gelé. Ce processus permet au chercheur de récolter un grand nombre de cerveaux en une seule séance et de les disséquer plus tard pour une collecte précise de multiples régions du cerveau.

La collecte précise des régions d’intérêt du cerveau (ROIs) est souvent nécessaire lorsqu’il répond à des questions liées à l’expression des gènes et des protéines. Tandis que la pharmacologie, l’électrophysiologie et l’optogénétique peuvent être employées sur le type sauvage ou les rongeurs génétiquement modifiés pour aider à élucider les changements moléculaires qui sous-tendent les comportements observés^2,,3,^4,la mesure des changements induits dans les transcriptomes et les protéomes est souvent employée pour soutenir ces résultats.^, Des techniques telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse (RT-qPCR), le ballonnement occidental, le RNAseq⁵, le MAPSeq⁶ et le HPLC⁷ sont robustes et relativement faibles en coût, ce qui permet à de nombreux laboratoires d’étudier les changements moléculaires induits dans les petites régions du cerveau^2,,4,5,6.

Il existe plusieurs façons d’extraire et de purifier l’acide nuléique ou des protéines des régions du cerveau^8,9,10,11,12. De nombreux laboratoires récoltent les régions du cerveau en refroidissant et en coupant les cerveaux sur la glace au moment de la récolte^9,13. Bien que cette approche puisse entraîner de l’acide nucléique de haute qualité et des protéines, elle est quelque peu limitée dans le temps, car la dégradation dans le microenvironnement du tissu peut avoir lieu à ces températures. Cela peut être particulièrement vrai lorsque vous tentez de disséquer un grand nombre d’animaux ou d’IRM en une seule séance. Garder les échantillons congelés aide à maintenir les molécules cibles labiles tout en donnant au chercheur le temps de comparer soigneusement les repères des deux côtés de chaque section dans l’effort de recueillir des échantillons relativement purs. La capture au laser est une autre façon de recueillir des tissus pour l’analyse de l’ARN ou des protéines dans les zones cérébrales¹⁰. Cette procédure est supérieure à la dissection mécanique dans ce ROIs de forme très petite et irrégulièrement peut être identifiée et isolée. Cependant, la capture au laser est limitée par l’utilisation d’équipements et de réactifs coûteux, prend beaucoup de temps et peut également être plus sensible à la dégradation de l’échantillon.

La dissection de micropunch sur les tissus congelés n’est pas nouvelle. Les premiers papiers de Miklos Palkovits et d’autres décrivent les techniques de base en détail^14,15. Cette présentation suit en grande partie le travail initial, avec quelques améliorations pour faciliter l’efficacité et réduire les dépenses de l’équipement nécessaire. Par exemple, les sections cérébrales sont faites dans un bloc cérébral gelé plutôt que sur un cryostat. Cela produit des sections plus épaisses qui réduisent le nombre de sections nécessaires pour recueillir des échantillons de retour sur investissement. Cette méthode disséque également des échantillons sur une plaque de verre congelée qui repose sur de la glace sèche dans une boîte isolée. Cela produit une étape de sous-gel au banc sur lequel travailler. Les sections disséquées de cette façon sont facilement manipulatibles, ce qui permet au chercheur de comparer les deux côtés de chaque section avec une référence afin de limiter la contamination des régions en dehors du retour sur investissement souhaité.

Les avantages de ce protocole sont que 1) le cerveau est maintenu dans un état gelé tout au long du processus, qui aide à préserver les protéines et l’acide nucléique et donne au chercheur le temps de récolter soigneusement les IA, et 2) les réactifs requis sont peu coûteux et se trouvent dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire. Dans ce processus, les cerveaux entiers sont sectionnés à 0,5-1,0 mm dans une matrice de cerveau et placés sur une plaque de verre congelée qui est continuellement refroidie avec de la glace sèche. Les repères trouvés dans l’Atlas du cerveau Allen¹ ou d’autres atlas cérébraux^16,17 sont utilisés pour identifier les régions d’intérêt, qui sont ensuite disséquées à l’aide d’un poinçon froid ou d’un scalpel. Parce que le tissu n’est jamais décongelé, les régions récoltées de cette manière fournissent l’ARN et les protéines de haute qualité pour les analyses en aval.

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traités d’une manière éthique et humaine, comme l’ont indiqué le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de l’Indiana et les lignes directrices des National Institutes of Health (NIH).

REMARQUE : Tous les outils et surfaces doivent être lavés avec un solvant approprié pour enlever les nucléases¹⁸ avant de commencer tout travail.

1. Stockage des cerveaux

1. Retirez rapidement le cerveau des souris à papier sauvage CD1 adultes euthanasiés pesant environ 30 g à l’aide d’une approche conventionnelle¹³ et gèlez le flash pendant 60 secondes dans l’azote liquide ou l’isopentane pré-réfrigéré avec de la glace sèche.
2. Conserver les cerveaux congelés à -80 oC dans du papier d’aluminium ou des tubes coniques jusqu’à leur utilisation.

2. Préparation de la matrice du cerveau

1. Vingt-quatre heures avant de disséquer les tissus, placez une matrice propre du cerveau (voir tableau des matériaux)sur une pile d’emballages de congélation décongelés. Sandwich les côtés de la matrice entre deux emballages de congélation en veillant à laisser environ 0,5 cm entre le bas des fentes de rasoir et le dessus des paquets de gel (figure 1A). Déposer le papier d’aluminium sur les extrémités pour faciliter le refroidissement.
   REMARQUE : Lors de l’achat d’une matrice de cerveau, achetez-en une qui est assez grande pour envelopper le volume entier du cerveau pour être disséqué.
2. Placer la boîte contenant la matrice du cerveau et les emballages de congélation dans un congélateur de -20 oC avec le dessus entrouverte pendant la nuit.

3. Mise en place d’une plaque de verre congelée

REMARQUE : Le but de cette configuration est de préparer une surface gelée sur laquelle disséquer les sections cérébrales.

1. Placer la glace dans une boîte isolée jusqu’à environ 5 cm du haut. Placez ensuite une couche de glace sèche de 2,5 cm sur le dessus de la glace et recouvrez de bâches en plastique noir pour aider à visualiser l’échantillon(figure 1B, figure 1C).
2. Placer une plaque de verre (devrait juste tenir dans l’ouverture de la boîte) sur le dessus du plastique et placer la glace sèche sur le dessus de la plaque dans les coins éloignés(figure 1C).
3. Prenez la matrice du cerveau congelée du congélateur et insérez le cerveau pour être coupé cortex-côté vers le haut. Laissez-le équilibrer à la température dans la boîte pendant 10 min. Gardez le couvercle sur la boîte pendant ce temps.
4. Ajuster la position du cerveau dans la matrice avec des forceps froids de sorte que le sinus sagittal et le sinus transversal s’alignent avec les rainures perpendiculaires du bloc (figure 1D). Cela permettra d’assurer des sections symétriques pour une dissection plus facile. Touchez les pointes des forceps pour sécher brièvement la glace pour refroidir avant d’ajuster le cerveau.
5. Une fois que le cerveau est en position, placez une lame de rasoir réfrigérée près de son centre et appuyez sur la lame d’environ 1 mm dans le tissu. Ajouter les lames réfrigérées aux extrémités rostrales et caudales pour aider à maintenir le cerveau en place (figure 2A et figure 2B).
6. À partir de l’extrémité rostrale, ajouter les lames une à la fois, les placer dans les fentes et les presser doucement vers le bas dans le tissu d’environ 1 mm (figure 2B). Continuer à ajouter des lames à intervalles de 1 mm en travaillant vers l’extrémité caudale.
7. Assurez-vous que le cerveau ne se déplace pas pendant cette période. Alignez les lames horizontalement et verticalement(figure 2B). Afin de couper des sections en largeurs de 0,5 mm, des lames microtomes de profil bas (voir tableau des matériaux) peuvent être utilisées. Placez-les entre les plus grandes lames de rasoir(figure 2C).
8. Une fois que les lames sont en place, appuyez sur le groupe avec les doigts, la paume ou une autre surface plane(figure 2C, figure 2D). Rock le groupe de lames lentement d’un côté à l’autre pour les déplacer à travers le tissu.
   REMARQUE : Cela peut prendre un certain temps (1 à 2 min) et nécessite de la patience. Il devrait y avoir une résistance aux lames qui se déplacent à travers le tissu. L’entrée facile signifie que le cerveau décongeler et le bloc doit être refroidi avec de la glace sèche.
9. Lorsque toutes les lames ont atteint le fond des fentes, saisissez chaque côté du groupe de lames et ne marchez pas sur la matrice en se balançant d’avant en arrière.
   REMARQUE : Faites preuve de prudence pour éviter de se couper sur les bords tranchants des lames.
10. Une fois que le groupe est libre, placez la pile, côté rostral vers le haut, sur la plaque de verre(figure 2E). Placer la glace sèche à côté et/ou sur le dessus de la pile pour congeler davantage les échantillons pour faciliter la séparation.
11. Placez la pile avec des bords pointus vers le bas sur la plaque de verre et séparer les lames en déplaçant la pile entre les pouces et les doigts. Les lames doivent se séparer les unes des autres avec des sections attachées.
12. Alignez les sections sur la plaque de verre du rostral au caudal(figure 2F).
13. Séparer le tissu des lames en fléchissant les lames entre les doigts, ou en se séparant d’un deuxième rasoir froid(figures 2G,2H,2I).

4. Sections de dissection

1. Ouvrez l’Atlas du cerveau Allen Mouse ou une autre référence et trouvez les repères nécessaires pour identifier les régions d’intérêt. Parmi les points de repère évidents, mentionnons la commissaire antérieure, le corpus callosum, les ventricules latéraux et l’hippocampe(figure 3).
2. Retourner la section à couper avec des forceps réfrigérés et assurez-vous que la région sur le point d’être recueillie est cohérente tout au long de la section. Pendant la récolte, consultez souvent l’atlas de référence pour vous assurer que le bon retour sur investissement est obtenu.
   REMARQUE : Une loupe ou un microscope disséquant est souvent utile dans ce processus. Un bon éclairage est également essentiel. Des lampes LED à faible puissance ou une lampe fraîche (voir tableau des matériaux)peuvent être utilisées à cette fin.
3. Avec un scalpel propre ou un poinçon, couper dans la section(figure 4). Préchill chaque outil avant de couper en le touchant brièvement à la glace sèche. Poussez la lame doucement mais fermement dans le tissu, en la berçant d’avant en arrière pour faire la coupe. Ne poussez pas trop fort ou le tissu se fracturera.
   REMARQUE : Les outils se réchaufferont avec le temps. Les lames légèrement réchauffées peuvent être utiles pour faire des coupes propres et peuvent limiter la fracturation, mais attention à éviter le dégel des tissus. Refroidir périodiquement les outils sur la glace sèche.
4. Une fois qu’un retour sur investissement est récolté, placez-le dans des tubes étiquetés et précillés de 1,5 mL. Conserver les tissus récoltés à -80 oC jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires.
5. Traiter les tissus congelés recueillis de cette manière en ajoutant le tampon RIPA froid (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS et cocktail inhibiteur des protéines (voir tableau des matériaux))pour l’extraction des protéines, ou un solvant contenant du guanidinium (voir tableau des matériaux) pour l’extraction de l’ARN à l’échantillon congelé et immédiatement homogénéiser à l’aide d’un dounce en verre ou d’homogéniste mécanique (voir tableau des matériaux). De cette façon, des inhibiteurs de la protéase et de la nucléase sont en place à mesure que l’échantillon se réchauffe pour protéger les protéines et les acides nucléiques contre la dégradation.

Afin de valider cette méthode, le cortex préfrontal médial a été recueilli à partir de souris mâles CD1 adultes et l’ARN et la protéine ont été extraits et caractérisés. L’ARN a été analysé par électrophoresis capillaire. L’ARN dégradé affiche une perte dans l’intensité des bandes ribosomal 28S et 18S et montre également des produits de dégradation comme un frottis entre 25 et 200 nucléotides(figure 5A, échantillon 1). L’ARN de haute qualité montre des bandes ribosomal distinctes avec peu ou pas de signal dans la région de poids moléculaire inférieur(figure 5A, échantillon 2). Les numéros d’intégrité de l’ARN (RIN) sont également générés dans cette analyse. Les RRIN au-dessus de 7 indiquent l’ARN19de bonne qualité. L’ARN isolé à partir d’échantillons utilisant la méthode de dissection congelée affichent une bande ribosomal forte et des valeurs élevées de RIN se comparant très favorablement avec l’ARN préparé à partir de tissus fraîchement récoltés(figure 5B).

Un avantage de cette méthode est qu’un grand nombre de cerveaux peuvent être rapidement récoltés et stockés en une seule séance pour être soigneusement disséqués à une date ultérieure. Les ROI peuvent également être stockés sans que les tissus soient décongelés. Grâce à cette méthode, un chercheur peut recueillir une vaste collection diversifiée d’IDR à partir desquelles de l’acide ou des protéines nucléiques de haute qualité peuvent être obtenus. Pour confirmer ce point, l’ARN a été extrait du MPFC disséqué qui avait été stocké pendant plusieurs semaines (cerveaux récoltés avaient été stockés pendant plusieurs mois). Tous les échantillons ont produit de l’ARN de haute qualité avec un baguage ribosomal distinct et des RIN supérieurs à 8(figure 5C).

L’analyse occidentale de tache a été employée pour confirmer l’intégrité de protéine du mPFC disséqué congelé tel qu’indiqué précédemment20. Les taches occidentales affichent un signal réduit de cibles de poids moléculaire élevé lorsque les protéines sont dégradées. Les produits de dégradation apparaissent également comme un frottis à des poids moléculaires inférieurs dans la colonne. Pour cette analyse, la protéine a été recueillie, transférée à la nitrocellulose, et sondée avec des anticorps contre une cible de poids moléculaire élevé, KCC2, et la protéine de poids moléculaire inférieur, actin (figure 5D). Dans tous les cas, les bandes étaient nettes et distinctes, sans produits de ventilation discernables pour KCC2 ou actin. Ces expériences confirment que la dissection des ROI utilisant cette méthode permet l’extraction d’ARN et de protéines de haute qualité.

Figure 1 : Préparation des surfaces de travail gelées. (A) Un bloc de cerveau est placé sur une pile de paquets de gel dans une boîte isolée et est ensuite pris en sandwich entre deux packs de gel supplémentaires. Le papier d’aluminium est emballé à chaque extrémité du bloc pour faciliter le refroidissement pendant la section. La boîte est ensuite refroidie toute la nuit à -20 oC. (B) Une plaque en verre est assortie pour la taille avec l’ouverture d’une boîte isolée. Une boîte d’expédition peut être utilisée à cette fin. De la glace est ajoutée à la boîte jusqu’à ce qu’elle soit à environ 5 cm du haut. La boîte est ensuite congelée toute la nuit à -20 oC. (B, C) Juste avant de recueillir des tissus, une couche uniforme de glace sèche est placée sur la glace à une profondeur d’environ 2,5 cm. Une feuille de plastique noir (pour faciliter la visualisation) est placée sur la glace sèche suivie de la plaque de verre. La glace sèche est placée dans les coins éloignés, ce qui refroidit l’air juste au-dessus de la plaque. Les outils peuvent être refroidis en les posant sur l’assiette, ou en les touchant brièvement à la glace sèche. (D) Pour assurer des sections symétriques, le cerveau doit être placé avec des forceps froids de sorte que le sinus sagittal et le sinus transversal s’alignent avec les rainures perpendiculaires du bloc (flèches blanches). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Section du cerveau à l’aide d’un bloc cérébral. (A) L’orientation du cerveau est ancrée par des sièges conventionnels lames de rasoir à bord unique dans le cortex à une profondeur d’environ 1 mm. Placer un au milieu et un à chaque extrémité aide à maintenir le cerveau en position. (B) Ajouter les lames une à la fois jusqu’à ce que toutes les fentes soient remplies. (C) Les lames à profil bas peuvent être insérées entre les lames conventionnelles lorsque des sections de 0,5 mm sont désirées (flèche rouge). (C, D) Le groupe de lames est poussé dans le tissu congelé avec une pression descendante modérée, en utilisant soit un instrument plat ou la paume ou les doigts de la main. Les lames peuvent être lentement secouées d’avant en arrière pour aider à les déplacer à travers le tissu. (E) Les sections sont enlevées en saisissant les côtés des lames de rasoir et en utilisant un mouvement à bascule et une pression ascendante ferme (Attention : attention à éviter les extrémités pointues des lames). Soulevez le groupe hors du bloc et placez-le côté antérieur vers le haut sur la plaque de verre congelée. Placer la glace sèche à côté des lames pour refroidir complètement les sections avant de vous séparer. (F) Séparer les lames et exposer les sections dans l’ordre. (G, H) Les sections peuvent être retirées des lames en fléchissant légèrement la lame avec les doigts dans la direction des flèches et en poussant la section avec une deuxième lame froide. (I) Certaines sections peuvent nécessiter l’enlèvement en chauffant légèrement la lame de rasoir entre les doigts et les pouces, puis en coupant rapidement la section gelée avec une deuxième lame froide. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Déterminer les IPP à l’aide de repères et de l’Atlas du cerveau d’Allen Mouse. Dans cet exemple, des sections cérébrales congelées sont à gauche avec des plaques correspondantes de l’Atlas du cerveau Allan Mouse sur la droite. Les ROI (contours pointillés rouges) sont identifiés en comparant les repères visibles (formes noires) à l’Atlas du cerveau Allen Mouse. Les repères incluent : fa et cc, corpus callosum, aco, commissaire antérieur, VL, ventricule latéral, V3, troisième venticule. Exemple ROIs: Pl/Il, cortex prélimbique et infralimbic, ACB, noyau accumbens, MOs, cortex moteur, CP, caudoputamen, HPF, hippocampe/dentate gyrus. Images de l’atlas coronal sur le bon crédit: Allen Institute. Les images proviennent des plaques 40, 44, 55 et 71 (de haut en bas) et ont été obtenues à partir de https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Disséquer les ROI. (A) Les sections sont manipulées à l’aide de forceps qui sont réfrigérés périodiquement sur de la glace sèche. Les deux côtés de chaque section doivent être comparés aux images d’atlas correspondantes avant la dissection. (B) ROIs sont retirés des sections du cerveau avec scalpel froid ou (C) poinçon biopsie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Analyse de l’ARN et des protéines à l’aide de la méthode de dissection du cerveau congelée. (A) Exemple d’ARN de mauvaise qualité par rapport à la bonne qualité. La séparation électrophorétique de l’échantillon 1 affiche l’ARN dégradé avec les bandes faibles 28S et 18S et les produits de dégradation entre 25 et 200 nucléotides (nt). L’échantillon 2 montre l’ARN de bonne qualité avec des bandes 28S et 18S fortes et peu de signal à faible poids moléculaire. Les nombres d’intégrité de l’ARN reflètent cette différence avec l’échantillon 1, le RIN et l’échantillon 2, le RIN et 8,6. (B) Comparaison de l’ARN extrait du cortex préfrontal médial congelé par rapport au cortex préfrontal médial fraîchement disséqué des souris. Les échantillons congelés ont été conservés à -80 oC pendant plusieurs mois avant la dissection. Des échantillons frais ont été traités immédiatement après la récolte. Les valeurs de RIN provenant d’échantillons prélevés à l’aide des deux méthodes sont élevées, les bandes 18S et 28S fortes indiquant que l’acide nucléique a été préservé. (C, D) mPFC a été disséqué des cerveaux congelés et l’ARN ou la protéine a été extrait. (C) l’analyse de l’ARN montre que l’ARN de bonne qualité a été obtenu pour les douze échantillons avec des RIN élevés et peu de produit de dégradation observé. (D) L’analyse de tache occidentale a été faite sur la protéine totale et a été sondée pour la présence du canal d’ion KCC2 de poids moléculaire élevé (bandes rouges, MW - 130 kDa). La bande KCC2 est clairement visible sans produits de dégradation de poids moléculaire inférieur observés. Le gène d’entretien ménager, Actin (bandes vertes, MW et 42 kDa) est également montré. les échantillons de mPFC de 12 cerveaux sont étiquetés 1-12. La BANQUE représente le contrôle du cerveau entier. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.