Enquêter sur la dégradation des barrières intestinales chez les organoïdes vivants

L’intégrité de la barrière épithéliale est maintenue par le complexe de jonction apical (AJC), qui se composent de jonction serrée (TJ) et de jonction d’adhérence (AJ) protéines¹. La structure polarisée de l’AJC est cruciale pour sa fonction in vivo. La dysrégulation de l’AJC est présente dans diverses maladies et est soupçonnée d’être un déclencheur important de la pathogénie inflammatoire de l’intestin. La perte de la fonction de barrière intestinale représente l’événement initiatique de la maladie. La translocation suivante des bactéries commensales et des réponses inflammatoires sont les conséquences douloureuses².

Divers modèles in vitro et in vivo ont été développés pour étudier la réglementation de l’AJC. L’essai Transwell est basé sur des monocounts cellulaires bidimensionnels (2D) qui ont été dérivés de lignées cellulaires tumorales. Ces systèmes sont bons à évaluer par des méthodes optiques et biochimiques et permettent l’analyse de nombreux échantillons en même temps, mais manquent de nombreuses caractéristiques des cellules primaires et les processus de différenciation présents in vivo. Il est également possible d’étudier l’intégrité de la barrière dans les modèles animaux. Dans les expériences terminales, les effets de traitements spécifiques in vivo sur la perméabilité de l’intestin entier peuvent être quantifiés. Cependant, ces modèles nécessitent un grand nombre d’animaux, et ils ne permettent pas une visualisation détaillée des processus moléculaires sous-jacents. De nos jours, des modèles in vitro 3D améliorés sont disponibles qui récapitulent étroitement les processus de différenciation cellulaire, la polarisation cellulaire, et représentent la structure crypt-villus de l’intestin³. L’application d’organoïdes intestinaux 3D pour des analyses fonctionnelles nécessite l’adaptation des méthodes disponibles à partir de modèles 2D. Ici, nous décrivons un modèle pour étudier l’intégrité de barrière intestinale dans les petits organoïdes intestinaux vivants de souris. L’essai a été établi pour étudier l’effet de l’IFN-sur l’intégrité de barrière et les protéines de jonction serrées respectives⁸.

Contrairement à la technique appliquée par Leslie⁴, Zietek⁵, ou Pearce⁶, qui mesure la fluorescence après avoir enlevé le jaune lucifer (LY) du milieu, notre approche permet de quantifier l’absorption luminale du fluorophore au fil du temps. Par conséquent, le résultat représente une absorption dynamique cinétique et notre essai permet l’application de stimuli ou d’inhibiteurs supplémentaires au cours de l’expérience. Le fait que les deux essais mesurent l’absorption du côté basolateral extérieur à la surface apicale intérieure est en contraste évident avec la situation in vivo. Dans un modèle décrit par Hill et coll.⁷, ce sujet a été exploré. Sur microinjection du fluorophore dans le lumen de l’organoïde, la fluorescence a été quantifiée. La direction de la diffusion représente la direction présente in vivo. L’effort technique de microinjection réduit clairement le débit de cette méthode. Contrairement au modèle décrit ici, la méthode de microinjection permet la mesure des effets qui nécessitent une activation biologique sur la surface épithéliale apicale.

Le modèle d’intégrité de barrière organoïde présenté ici est basé sur la microscopie cellulaire vivante et permet l’analyse des changements dynamiques dans le règlement de l’AJC au fil du temps. La configuration peut être appliquée pour tester l’impact pharmacologique des substances induisant et inhibant l’intégrité de la barrière intestinale. En outre, les modèles à base d’organoïdes aident à réduire le nombre d’animaux utilisés pour les études pharmacologiques.

Toutes les étapes ont été franchies conformément à toutes les lignes directrices pertinentes en matière de réglementation et de soins aux animaux en établissement.

1. Plating des organoïdes

1. Isoler les organoïdes comme décrit précédemment³. La procédure est brièvement décrite ci-dessous.
   1. Recueillir les intestins grêles de souris.
   2. Ouvrez les intestins grêles longitudinally et retirez les pointes de villi en grattant le tissu intestinal interne avec un coverlip.
   3. Couper le tissu intestinal en petits morceaux à l’aide de ciseaux.
   4. Laver les morceaux 5x dans le salin à phosphate froid (PBS) en piper les morceaux 10x de haut en bas avec une pipette de 25 mL.
   5. Incuber les morceaux de tissu dans la solution froide 2 mM EDTA sur la glace pendant 30 min sur une plate-forme horizontale de secousses. Laisser les morceaux de tissu se sédimenter.
   6. Remplacez la solution EDTA par un tampon PBS une fois que les morceaux de tissu se déposent au fond. Jetez le supernatant et ajoutez 20 ml de PBS.
   7. Relâchez les cryptes intestinales du tissu en pipenant vigoureusement 10x de haut en bas avec une pipette de 10 ml.
   8. Recueillir le supernatant dans les tubes de centrifugation et l’inspecter par microscopie de contraste de phase. Pour ce faire, ajoutez une goutte de supernatant à une plaque de culture cellulaire de 96 puits. Gardez les tubes de centrifugation sur la glace.
   9. Répétez les étapes 1.1.6-1.1.8 jusqu’à ce que le nombre de cryptes intestinales dans le supernatant collecté diminue.
   10. Passer les fractions contenant le plus de cryptes à travers une passoire cellulaire de 70 m.
   11. Centrifuge la suspension de crypte à 300 x g,4 oC pour 5 min.
   12. Jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans PBS froid afin de laver les cryptes. Répétez ensuite l’étape de centrifugation telle que décrite dans 1.1.11.
   13. Résuspendez la pastille dans un total de 25 ll par puits d’un mélange de 1:1 de solution de matrice cellulaire et de milieu de culture organoïde trouble et plaquez les organoïdes dans une 48 plaques de culture cellulaire de puits.
   14. Incuber les organoïdes à 37 oC, 5% de CO₂^, pendant 20 min pour permettre à la solution de matrice cellulaire de se solidifier.
   15. Couvrir les organoïdes de 300 lil de milieu organoïde murin par puits.
   16. Culture les organoïdes à 37 oC, 5% de CO₂, en changeant le milieu tous les 2-3 jours.
   17. Utilisez les organoïdes pour des expériences après 7 jours de culture.
2. Préparer les organoïdes pour la mesure de l’intégrité de la barrière.
   1. Précarcez tous les tubes de centrifugation qui seront utilisés pour stocker les organoïdes pendant le processus de placage avec l’albumine de sérum bovin (BSA) en ajoutant assez d’une solution BSA de 0,1% dans PBS pour couvrir toutes les surfaces en plastique. Retirez ensuite la solution BSA et conservez les tubes de centrifugation sur la glace.
   2. Décongeler la solution de matrice cellulaire et le milieu de la culture organoïde sur la glace.
3. Pour séparer les organoïdes, retirez soigneusement le milieu de la culture et réutilisez les organoïdes d’un puits d’une plaque de 48 puits dans 1 ml de PBS froid. Dissoudre la matrice cellulaire par tuyauterie vigoureuse. Gardez toujours la suspension organoïde dans les tubes de centrifugation précoatés avec BSA et toujours garder sur la glace.
   REMARQUE: La densité, la taille et la position des organoïdes dans la glissière de coverlip chambré sont influencées par le rapport de fractionnement, la concentration de solution de matrice cellulaire, et la manipulation de la suspension de matrice organoïde-cellule. Il est recommandé de pratiquer la manipulation de la solution de matrice cellulaire à l’avance. Habituellement, huit couvertures en verre bien chambrés conviennent à l’essai. Les organoïdes dérivés d’un puits d’une plaque de puits confluent de 48 peuvent être divisés en deux puits d’un housse bien chambré (40 l de la matrice organoïde-cellule granule par puits).
4. Centrifuge la suspension organoïde à 300 x g à 4 oC pendant 5 min.
5. Jetez soigneusement le supernatant et réutilisez la boulette avec 1 ml de PBS froid.
6. Centrifuge la suspension organoïde à 300 x g,4 oC pendant 5 min.
7. Jetez complètement le supernatant et réutilisez les organoïdes dérivés d’un puits d’une plaque de 48 puits en 40 ll de milieu froid. Fragmentez les grandes structures organoïdes en canalisation de la suspension organoïde 5x à travers une pointe de pipette de 10 l pour recueillir des structures d’une taille de 40 à 60 m pour l’ensemencement.
   REMARQUE: Utilisez la pointe de 10 L sur une pointe de pipette de 100 L pour la fragmentation des structures organoïdes, et pratiquez l’étape 1.7 à l’avance pour assurer des résultats cohérents. Contrôler la taille des organoïdes par microscopie de contraste de phase dans le tube de centrifugation. Assurez-vous qu’il n’y a plus d’organoïdes multibranchés présents et que les fragments d’organoïdes mesurent environ 40 à 60 m de long.
8. Une fois que les organoïdes ont obtenu la taille désirée, mélangez-les avec 40 L de la solution de matrice cellulaire (solution moyenne : matrice cellulaire ' 1:1).
   REMARQUE: Le rapport de solution de matrice moyenne/cellule doit être maintenu constant pour obtenir des résultats cohérents. La dilution de la solution de matrice cellulaire réduit la rigidité du blob organoïde et affecte ses propriétés de diffusion. Utilisez des pointes de tuyauterie précolées (-20 oC) pour toutes les suspensions contenant la solution de matrice cellulaire.
9. Placez 40 l de la suspension de la solution de matrice organoïde-cellule au centre de chaque puits d’un coverlip bien chambré de 8.
10. Conserver la lame sur une banquise pendant 5 min. Ceci préserve le liquide de suspension organoïde de matrice cellulaire et augmente la concentration d’organoïdes à la surface de coverlip par gravité.
11. Incuber pendant 20 min à 37 oC et 5% de CO₂ pour permettre la polymérisation du blob de matrice organoïde-cellule.
12. Ajouter 150 L de milieu de culture organoïde par puits et incuber pendant 24 h à 37 oC et 5% de CO₂ avant de procéder au traitement expérimental.
    1. Utilisez cette période pour traiter les organoïdes et moduler leur intégrité de barrière selon l’hypothèse scientifique correspondante. Pour le contrôle positif, traiter les organoïdes pendant 48 h avec IFN-md afin d’étudier la dégradation et la perméabilité serrées associées à l’IFN-IN. Stimulez le contrôle positif avec 10 U/mL (10 ng/mL) recombinants murine IFN-. Laissez les organoïdes d’un bien non traité.
13. Organoïdes de culture à 37 oC et 5% de CO₂ pour un maximum de 48 h.

2. OrganoïdePerméabilité Assay

1. Porter la chambre d’incubation du microscope à 37 oC au moins 2 h avant de commencer l’expérience pour réduire la dérive thermique tout en imagerie des organoïdes.
2. Préparer une solution de 100 mM de LY dans PBS. Conserver sur de la glace protégée de la lumière.
3. Préparer une solution de 200 mM d’EGTA dans PBS. Rangez-le sur la glace.
4. Transférer le housse chambré, y compris les organoïdes dans la chambre d’incubation d’un microscope confocal inversé et activer l’incubation co₂ (5%). Assurez-vous que le housse chambré est étroitement verrouillé dans le stade du microscope.
5. En utilisant les organoïdes dans un ainsi qu’une référence, ajuster les paramètres d’imagerie du microscope. Ajouter LY (3 l de 100 mM LY dans 150 ll de milieu) pour obtenir un volume final de 1 mM LY en 300 lL de milieu. Incuber sur le microscope pendant 1 h et ajuster l’accent pour l’imagerie des lumen des organoïdes. Définissez l’énergie laser requise pour l’excitation LY (488 nm) et la sensibilité de détection respective de l’instrument et essayez d’imager la fluorescence LY à 30-40% de la plage dynamique disponible de l’instrument utilisé.
   REMARQUE: Ajuster l’énergie d’excitation laser et l’efficacité de détection sur les organoïdes non traités 70 min après l’ajout de LY. Assurez-vous que l’énergie d’excitation est assez élevée pour obtenir une image bien exposée. Pour éviter la saturation de la fluorescence LY dans les images microscopiques, il est recommandé d’ajuster ces paramètres après la diffusion LY atteint un état stable.
6. Définissez la position des organoïdes par contraste différentiel (DIC) imagerie vivante. Essayez d’imager les organoïdes de diamètres comparables (80 à 30 m) et concentrez-vous sur la tranche centrale des organoïdes pour imaginer leurs lumen. Définissez environ 10 organoïdes par puits et essayez d’imaginer uniquement les organoïdes près de la surface de coverlip avec une structure sphérique.
   REMARQUE: Le nombre d’organoïdes qui peuvent être photographiés par course dépend de la vitesse du microscope. Il est recommandé d’imager les organoïdes dans un intervalle de 5 minutes. Sur un microscope à balayage laser régulier, 40 positions au total sont un point de départ raisonnable.
7. Enregistrez le DIC et la fluorescence LY de chaque position pour documenter la forme et l’autofluorescence de l’organoïde avant d’ajouter le LY aux puits, utilisés pour l’analyse d’intégrité de barrière.
8. N’imagez pas les organoïdes qui affichent une grande autofluorescence. Ceci est dû à l’accumulation de cellules mortes dans le lumen de l’organoïde, et les résultats des organoïdes autofluorescents sont difficiles à analyser par la suite.
9. Diluer 3 L de la solution LY préparée (100 mM LY en 150 ll de milieu) et ajouter ceci soigneusement à chaque puits sans toucher le coverlip chambré. La concentration recommandée de LY par puits est de 1 mM. Le volume final par puits doit être de 300 ll.
10. Vérifiez rapidement l’orientation des positions définies et corrigez si nécessaire.
    REMARQUE: LY diffuse rapidement à travers la matrice cellulaire. Par conséquent, l’imagerie confocale doit être commencée dans les 3 minutes après l’ajout du fluorophore.
11. Commencez une imagerie en time-lapse au microscope. Prenez une image de fluorescence de chaque position toutes les 5 minutes pour un total de 70 min.
    REMARQUE: Les organoïdes ont été photographiés dans des intervalles de 5 minutes pour visualiser l’absorption LY au fil du temps. Pour mesurer la dégradation de la barrière intestinale, il suffit d’enregistrer la fluorescence avant et 60 min après l’ajout de LY et une fois de plus 10 min après l’ajout de l’EGTA.
12. Ajouter 3 L de la solution EGTA préparée par puits sans toucher le coverlip chambré. La concentration recommandée dans le housse chambré de l’EGTA est de 2 mM. Le volume total par puits devrait être de 300 ll.
13. Commencez un deuxième time-lapse. Enregistrez à nouveau la fluorescence des organoïdes définis avec un intervalle de 5 min pour un total de 30 min.
14. Jetez tout selon les règles de sécurité locales.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

3. Analyse des données

1. N’analysez que les résultats des organoïdes qui ont pris LY après l’ajout EGTA.
2. Les résultats peuvent être quantifiés avec Fiji ImageJ.
3. Ouvrez l’ensemble de données dans ImageJ en cliquant sur Le fichier ( Ouvrez et sélectionnez les données d’image. Dans les options d’importation BIO-Formats suivantes, dialoguez sélectionnez Pile Vue avec : Hyperstack.
4. Ouvrez le gestionnaire de la région d’intérêt (ROI) en cliquant sur Analyze ( Outils GESTIONNAIRE de ROI.
5. Dessinez un retour sur investissement ovale en cliquant sur le bouton de sélection ovale dans la barre de menu ImageJ. Dessinez une sélection contenant le lumen intérieur de l’organoïde. Ensuite, appuyez sur Ajouter dans le gestionnaire de retour sur investissement.
6. Répétez les étapes pour trois zones représentatives en dehors de l’organoïde.
7. Cliquez sur Analyser la barre du menu et sélectionner les mesures définies. Activez uniquement la valeur grise moyenne et désactiver toute autre mesure. Ensuite, cliquez sur OK.
8. Assurez-vous que tous les ROI sont sélectionnés dans le gestionnaire de retour sur investissement. Dans le gestionnaire du roi, cliquez sur Plus de Multi mesure. Dans l’option dialoguer sélectionnez Mesure toutes [...] tranches et une rangée par tranche. Ensuite, cliquez sur OK.
9. Sélectionnez toutes les valeurs de la fenêtre Résultats et copiez-les dans une application de feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.
   REMARQUE: Si la position de l’organoïde s’est déplacée pendant l’imagerie en time-lapse, le retour sur investissement doit être ajusté en conséquence. Pour ce faire, sélectionnez le bon retour sur investissement dans le gestionnaire du roi d’investissement et déplacez-le à la nouvelle position. Cliquez ensuite sur mise à jour dans le gestionnaire du retour sur investissement. Effectuez la mesure pour chaque point de temps individuellement en cliquant sur Mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement, puis passez au point d’heure suivant dans la fenêtre d’image à l’aide de la barre sur le fond. Recueillir toutes les mesures dans une feuille de calcul. La forme individuelle et le mouvement des organoïdes pendant la période d’imagerie nécessitent l’analyse des données d’une manière manuelle.
10. Calculez la valeur d’intensité moyenne des trois OID à l’extérieur de l’organoïde pour chaque point de temps.
11. Divisez l’intensité du retour sur investissement à l’intérieur du lumen de l’organoïde par l’intensité moyenne du retour sur investissement à l’extérieur et par l’intensité moyenne à l’intérieur de l’organoïde.
12. Afin de calculer l’augmentation relative de la fluorescence organoïde luminale, divisez la fluorescence relative (voir étape 3.11) à chaque point de temps illustré par la fluorescence relative minimale.
    REMARQUE: Utilisez la fluorescence relative minimale, parce que parfois la diffusion du fluorophore peut être lente au début de l’expérience.

Pour valider l’application de petits organoïdes de souris intestinales 3D comme modèle pour quantifier l’effet des composés régulant l’intégrité de barrière intestinale, nous avons appliqué l’IFN-. Pour ce faire, nous avons isolé et cultivé des organoïdes dérivés de type sauvage sensible à l’IFN et des8souris à élimination directe IFN-2, qui ne répondent pas à l’IFN-8 . Lors d’un traitement de 48 h avec IFN-ou PBS (contrôle), tous les organoïdes ont été exposés à LY et photographiés par la microscopie de cellules vivantes de disque de rotation confocale dans des intervalles de 5 min pendant une période de 70 min. L’intégrité fonctionnelle de la barrière intestinale dans ce modèle a eu comme conséquence l’exclusion de LY du lumen de l’organoïde tandis que l’accumulation intraluminale de LY a signifié la destruction du TJ. Les images microscopiques représentatives de fluorescence après 70 min d’incubation avec LY démontrent clairement que la fluorescence intraluminale de LY n’était visible que chez les organoïdes d’animaux sauvages traités avec l’IFN-. Dans les contrôles non formulés (PBS) ni dans les organoïdes dérivés des animaux assommants (IFN-R2- 'IEC, figure 1), aucune fluorescence intraluminale de LY n’était présente après 70 min.

L’ajout d’EGTA provoque une dégradation non spécifique de l’intégrité de la barrière intestinale en séquestrant les cofacteurs de TJ. Ce contrôle a toujours été utilisé à la fin de l’expérience pour démontrer la capacité de l’organoïde respectif à prendre LY (figure 1). Si aucune fluorescence intraluminale de LY n’a été détectée sur le traitement d’EGTA, l’organoïde a été exclu de l’expérience.

Pour l’évaluation quantitative des résultats microscopiques, la fluorescence de LY a été mesurée dans le lumen de l’organoïde et à l’extérieur de l’organoïde. Les valeurs d’intensité relative ont été calculées (fluorescence à l’intérieur/fluorescence à l’extérieur et à l’intérieur) et sont affichées pour chaque point de temps illustré. Il est recommandé d’éviter l’imagerie des organoïdes de différentes tailles. Nous avons choisi de nous concentrer sur les organoïdes d’un diamètre de 80 à 30 m(figure 2). Un schéma du protocole avec des images représentatives est montré dans la figure 3. Certains problèmes majeurs et les techniques de dépannage sont montrés et discutés à la figure 4.

Figure 1 : L’intégrité de la barrière intestinale peut être analysée chez les organoïdes de souris. Les organoïdes intestinaux de l’IFN-R2WT et de l’IFN-R2-IEC ont été cultivés en présence de l’IFN-Ô pour 48 h ou laissés non traités. Pour étudier l’intégrité de la barrière intestinale, LY (457 Da) a été ajouté et des images fluorescentes confocales ont été capturées dans des intervalles de 5 minutes pour un total de 70 min. Images représentatives au point de temps 0 min, 70 min, et après l’ajout de l’EGTA sont montrés (vert - Jaune Lucifer; Barre d’échelle de 20 m). Ce chiffre a été modifié à partir de Bardenbacher et al.8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Le petit modèle intestinal d’intégrité de barrière organoïde fournit des résultats quantitatifs. (A) La fluorescence a été déterminée à l’intérieur et à l’extérieur de l’organoïde. Les valeurs d’intensité relative ont été calculées (à l’intérieur/fluorescence à l’extérieur et à l’intérieur) par rapport à l’intensité relative initiale et SEM et sont indiquées pour chaque point de temps. (B) Répartition de taille des organoïdes analysés. Pour réduire l’écart standard et les erreurs dues aux changements dans le rapport surface-volume, nous n’avons analysé les organoïdes qu’avec un diamètre de 80 à 30 m. Les valeurs moyennes des diamètres organoïdes respectifs sont montrées - SD (IFN-R2WT, n - 20; IFN-R2-IEC, n . Les valeurs moyennes de diamètre ne différaient pas significativement entre les différents groupes (ANOVA à sens unique). (C) La perméabilité des organoïdes a été déterminée 70 min après l’ajout de LY. Il a été défini en divisant les intensités intraluminales de fluorescence après 70 min par les intensités relatives minimales de fluorescence mesurées pendant la période d’observation. Chaque barre représente des valeurs moyennes et SD, mesurées en 10 organoïdes dérivés de deux expériences indépendantes (IFN-R2WT, n ' 20; IFN-R2-IEC, n . L’IFN-MD n’a considérablement augmenté l’absorption d’LY que dans les organoïdesWT IFN-R2. p-value 'lt;0.001 dans le t-test de l’étudiant. Ce chiffre a été modifié à partir de Bardenbacher et al.8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Protocole schématique avec images représentatives. (A) Description schématique des principales étapes du protocole. (B) Images représentatives des principales étapes du protocole. (B1) Image de microscopie DIC d’une tranche centrale par un organoïde approprié qui a été choisi pour l’analyse de perméabilité. La ligne pointillée représente une largeur de 89 m . (B2) Image de microscopie de fluorescence du même organoïde dans (B1) avant d’ajouter LY. L’image montre l’autofluorescence de l’organoïde. (B3) Un organoïde 70 min après l’ajout de LY. L’organoïde représenté ne montre aucune absorption de LY et donc une fonction de barrière intacte. Les lignes pointillées montrent les ROIs pour une analyse plus approfondie. Les lumen intérieurs de l’organoïde et trois zones représentatives autour de l’organoïde sont marqués. (B4) Un organoïde après l’ajout de l’EGTA. L’organoïde est utilisable pour une analyse plus approfondie, car il montre l’absorption LY après le traitement EGTA. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Dépannage de problèmes courants. (A) Table avec des problèmes et des solutions communs. (B) Images exemplaires. (B1) Image DIC d’un grand organoïde multibranché qui n’est pas adapté à cet essai. (B2). L’image confocale d’un organoïde affichant l’autofluorescence élevée avant que LY ait été ajoutée au milieu. L’organoïde a été exclu de la quantification. (B3) L’image confocale d’un organoïde affichant l’autofluorescence basse avant LY a été ajoutée au milieu. La fluorescence a été quantifiée dans ce cas. (B4) Organoïde ne montrant aucune absorption de LY du milieu 30 min après ajout de l’EGTA et donc exclu de la quantification. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.