Ce protocole décrit une approche efficace d’hybridation in situ pour détecter les niveaux d’expression de l’ARNm et les modèles spatiaux des gènes cibles dans le liquide coélomique sipunculus nudus.
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Article de méthode
Hybridation in situ pour Sipunculus nudus Coelomic Fluid
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’hybridation in situ (ISH) est une technique très informative pour présenter des modèles de distribution cellulaire de gènes spécifiques (p. ex. l’ARNm et l’ARN) dans les tissus. Le ver sipunculide Sipunculus nudus est une ressource de pêche cruciale car il a des valeurs nutritionnelles et médicinales élevées. Actuellement, la recherche sur la biologie moléculaire de Sipunculus nudus n’en est encore qu’à ses balbutiements. Le but de cet article est de développer une méthode sensible pour localiser l’ARNm spécifique dans sipunculus nudus liquide coélomique. Le protocole comprend des étapes détaillées de l’ISH, y compris l’antisense étiqueté digoxigenin et la préparation des riboprobes sens, la collecte de liquide coélomique et la préparation de section, l’hybridation spécifique de riboprobe, l’incubation d’anticorps, la coloration et les traitements de post-coloration. Les résultats représentatifs obtenus à partir d’une expérience réussie utilisant cette méthode sont démontrés. Le protocole devrait également s’appliquer à d’autres espèces de Sipuncula.
Introduction
ISH, à l’aide d’une sonde d’acide nucléique étiquetée pour détecter la séquence spécifique d’ADN ou d’ARN d’intérêt, est une méthode utile pour décrire le modèle d’expression spatiale des gènes cibles dans les tissus morphologiquement conservés1,2,3. Normalement, la séquence cible est générée par la réaction en chaîne de polymérase (PCR), puis utilisée comme modèle pour synthétiser la sonde antisense/sens de l’ARN étiquetée avec de l’uridine-5'-triphosphate digoxigenin. Les échantillons sont fixes et perméabilisés avant l’incubation avec des riboprobe. Après avoir lavé l’excè....
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Protocole
La procédure animale a été approuvée par le Comité de soins et de bien-être des animaux de l’Université huaqiao.
1. Préparation de Riboprobe
- Conception d’apprêt
- Ouvrez le programme Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copiez la séquence dmrt1 (GenBank : MK182259) dans la fenêtre de séquence.
- Définir la longueur de l’apprêt (23-25 bp), la température de fonte (55-60 oC) et le contenu G/C (40-60%). Cliquez sur Pick Primers.
REMARQUE : La taille minimale requise pour la sonde ARN est d’environ 500 bp. Les sondes plus longues ont normalement une spécificité plus élevée....
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Résultats
Un résumé des étapes de l’ISH est illustré dans la figure 1. Les riboprobes de sens et correspondants pour dmrt1 ont été synthétisés des produits de PCR amplifiés des cDNA fluides coelomic. L’authenticité des produits PCR a été vérifiée par séquençage direct. Riboprobes ont été synthétisés à l’aide de polymérases T7 ARN selon les protocoles du fabricant et un rapport précédent4 avec quelques modifications mineures. Les signaux représentatifs de l’ISH sont ind.......
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Discussion
Des études antérieures ont montré que l’ISH est adapté pour détecter plusieurs ARN cibles16,17,18. Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode ISH haute résolution pour détecter l’ARNm dans le fluide coélomique et mettre l’accent sur les conditions d’hybridation optimisées dans sipunculus nudus. Les signaux évidents de dmrt1 que nous avons observés ont démontré l’application réussie de ce protocole dans la.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ces travaux ont été soutenus par le Young Scientists Fund de la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), la Natural Science Foundation of Fujian Province, China (2016J011161), les Fonds de recherche scientifique de l’Université Huaqiao (15BS306) et le Fonds novateur de post-études en recherche scientifique de l’Université Huaqiao.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigénine-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT phosphatase alcaline kit de développement de couleur | Beyotime | C3206 | |
| Sérum bovin Albumine | Sigma | B2064 | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | 5415R | |
| Acide citrique | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Acide citrique trisodique | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Lamelles | Beyotime | FCGF60 | |
| Formamide désionisé | Amresco | 12/7/1975 | |
| Pyrocarbonate de diéthyle, DEPC | Sigma | D5758 | Substance nocive |
| Digoxigénine (DIG) Marquage de l’ARN Mélange Roche | 11277073910 | ||
| DNase I, | Invitrogen | RNase 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Imagerie sur gel d’électrophorèse | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Kits d’extraction de gel | Omega | D2500 | |
| Appareil d’électrophorèse sur gel | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycérol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Héparine | Sigma | 01/08/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Acide maléique | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Méthanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Substance nocive |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | de |
| paraffine | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldéhyde, PFA | Sigma | 158127 | Substance nocive |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Lames de microscope traitées à la poly-D-lysine | Liusheng | VER_A01 | |
| Protéinase K | Sigma | ||
| Eau sans RNase | HyClone | SH30538. 02 | |
| Inhibiteur de RNase | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sérum de mouton | Beyotime | C0265 | |
| Pot de coloration pour lames | Beyotime | FG010 | |
| Boîte de rangement pour lames | Beyotime | FBX011 | |
| Petits ciseaux autoclaves | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotomètres | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| ARN polymérases T7 | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymérase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| ARNt | Roche | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Bain-marie | Zhengzhou Grande Muraille Scientifique Industriel | HH-S2 |
Références
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
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Réimpressions et autorisations
