Établissement d’un modèle de cornée Porcine Ex Vivo pour l’étude des traitements médicamenteux contre la kératite bactérienne

Les infections cornéeennes sont d’importantes causes de cécité et se produisent dans des proportions épidémiques dans les pays à revenu faible ou intermédiaire. L’étiologie de la maladie varie d’une région à l’autre, mais les bactéries représentent une grande majorité de ces cas. Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène important qui provoque une maladie rapidement progressive. Dans de nombreux cas, les patients sont laissés avec des cicatrices stromales, astigmatisme irrégulier, nécessitent une greffe ou dans le pire des cas, perdre^{un œil 1,2}.

La kératite bactérienne causée par P. aeruginosa est une infection oculaire difficile à traiter en particulier en raison de l’émergence croissante de souches résistantes aux antimicrobiens de P. aeruginosa. Au cours de la dernière décennie, il est devenu évident que l’essai et le développement de nouveaux traitements pour les infections cornéeennes, en général, et ceux causés par Pseudomonas sp., en particulier, sont essentiels pour lutter contre la tendance actuelle de la résistance^{aux antibiotiques 3}.

Pour tester l’efficacité de nouveaux traitements pour les infections cornéeennes, les méthodes microbiologiques in vitro conventionnelles sont un substitut pauvre en raison de la différence de physiologie bactérienne pendant la culture de laboratoire et pendant les infections in vivo ainsi que dues au manque de l’interface^{hôte 4,5}. Les modèles animaux in vivo, cependant, sont coûteux, prennent beaucoup de temps, ne peuvent fournir qu’un petit nombre de répliques et soulever des préoccupations au sujet du bien-être des animaux.

Dans cet article, nous démontrons un modèle organotypique simple et reproductible ex vivo porcine de kératite qui peut être employé pour tester divers traitements pour des infections aiguës et chroniques. Nous avons utilisé P. aeruginosa pour cette expérience, mais le modèle fonctionne également bien avec d’autres bactéries, et des organismes tels que les champignons et la levure qui causent la kératite.

Les lapins de laboratoire albinos ont été sacrifiés en laboratoire pour d’autres travaux expérimentaux prévus dans le cadre de protocoles approuvés par le siège social. Les yeux n’étaient pas nécessaires pour une utilisation expérimentale dans ces études de sorte qu’ils ont été utilisés pour ce protocole.

1. Stérilisation

1. ÉTAPE CRITIQUE : Désinfectez tous les forceps et ciseaux en trempant pendant 1 h dans la solution 5% (v/v) de Distel dans de l’eau distillée, nettoyez à l’aide d’une brosse, rincez à l’eau du robinet et stérilisez au four à 185 °C pour un minimum de 2 h.
2. Stériliser toutes les autres verreries et réadageurs en clavant automatiquement à 121 °C pendant 15 minutes ou préparer les réadageurs selon les instructions du fabricant. Effectuer les procédures suivantes dans un cabinet de sécurité en microbiologie de classe II.

2. Collecte d’échantillons

1. Collection d’yeux de porcin
   1. De grands truies blanches de landrace, une croix avec un sanglier de Hampshire a été employée. Les animaux ont été assommés par un courant électrique et les yeux ont été enucleated 2 h plus tard dans l’abattoir.
   2. ÉTAPE CRITIQUE : Une fois édulés, transférez les yeux au laboratoire dans une solution saline tamponnée stérile de phosphate (PBS) pour les empêcher de sécher et de les traiter immédiatement à l’arrivée.
2. Collection d’yeux de lapin
   1. Exciser les cornées et les envoyer au laboratoire en PBS stérile.

3. Préparation du bouton cornéosclérical

1. Utilisez des forceps stériles pour tenir le tissu entourant le globe oculaire et le transférer dans une boîte de Pétri. Retirez la conjonctive et le tissu musculaire autour du globe oculaire sur une boîte de Petri à l’aide de la lame de scalpel no 15 et des forceps.
2. Soulevez doucement le globe oculaire tout en tenant le nerf optique avec des forceps et transférez-le dans un bocal de 0,5 L rempli de PBS stérile.
3. Une fois que tous les yeux sont dégagés des tissus environnants, déplacez-les à l’aide de forceps stériles vers un autre pot de 0,5 L rempli d’iode povidone de 3 % (v/v) en PBS et laissez-le pendant 1 min.
4. Transférez les globes oculaires dans un autre bocal de 0,5 L avec du PBS stérile.
5. Utilisez des forceps pour maintenir l’œil immobile sur une boîte de Pétri et faire une coupe près de la cornée avec une lame de scalpel no 10A.
6. ÉTAPE CRITIQUE : Tenez le bord de la coupe et utilisez des ciseaux pour exciser la cornée en laissant environ 3 mm de sclère entourant la cornée. Assurez-vous que l’extrémité pointue des ciseaux ne perce pas l’iris ou le tissu choroïde et se trouve dans l’espace supra-choroïdien.
7. Tenez le bouton cornéoscleral avec des forceps et utilisez une autre paire de forceps pointus pour séparer doucement le tissu uvéal.
8. Soulevez le bouton cornéosclérical du globe restant et rincez-le brièvement dans la solution d’iode de povidone de 1,5% (v/v) dans PBS dans une plaque de puits de 12.
9. Placez le bouton cornéosclérical dans une autre plaque de 12 puits remplie de PBS stérile.
10. Après avoir traité tous les yeux(maximum recommandé 40 yeux dansun lot), placez chaque bouton cornéoscleral à une boîte de Petri individuelle (diamètre de 34 mm) côté épithélial vers le haut et versez dans 3 mL de culture moyenne préchauffée à 37 °C.
    NOTE: La composition du milieu de culture est la suivante: Dulbecco modifié Eagle’s medium (DMEM): Ham [1:1] complété par 5 μg◊mL^-1 insuline et 10 ng◊mL^-1 facteur de croissance épidermique (EGF), 10% (v/ v) sérum fœtal de veau (FCS), 100 U-mL^-1 pénicilline, 100 U◊mL^-1 streptomycine et 2,5 μg◊mL^-1 amphotericine B. Comme une étape facultative, le milieu peut être complété avec 50 g◊L^-1 dextran pour empêcher le gonflement de la cornée excisée pendant les étapes d’incubation supplémentaires.
11. Incuber à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée.

4. Entretien des boutons cornéoscléraux

1. Après 24 heures, utiliser la technique aseptique pour enlever les médias et remplacer par 3 mL de médias de culture frais préchauffés contenant des antibiotiques. Gardez les boutons cornéoscléraux dans les médias avec des antibiotiques pendant 48 h pour désinfecter les cornées. Incuber à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée.
2. ÉTAPE CRITIQUE : Après 48 heures, retirez les supports et rincez les cornées avec 2 mL de PBS. Ensuite, gardez les boutons cornéoscléraux dans les médias exempts d’antibiotiques pendant au moins deux ou idéalement trois jours avant l’infection expérimentale, pour éliminer les antibiotiques résiduels du tissu.
3. Incuber à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée. Changez de média au moins une fois de plus au cours de ces trois jours. Jetez les cornées si une turbidité se développe dans le milieu sans antibiotiques.

5. Préparation d’un inoculum

1. Verser 10 mL de bouillon LB dans un flacon conique de 50 mL à l’avec un bouchon en mousse.
2. Transférer une colonie de souche P. aeruginosa PAO1 ou filtrer PA14 à partir d’une plaque d’agar fraîche et incuber à 37 °C pendant 3-4 h jusqu’à ce que la bactérie soit en phase médiane.
3. Transférer la culture des bactéries dans un tube de 50 mL et une centrifugeuse à 3 000 x g pendant 5 min. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans PBS.
4. Répétez l’étape 5.3 deux fois de plus pour laver les cellules. Suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans PBS et ajuster la densité optique à 600 nm à environ 0,6 en utilisant PBS stérile comme un blanc.

6. Infecter le bouton cornéosclérical

1. Retirer les supports de la boîte de Pétri et rincer les cornées deux fois avec 1 mL de PBS stérile.
2. Presser doucement les forceps tout en tenant la cornée entre les deux. Utilisez un scalpel 10A pour faire quatre coupes – deux verticales, deux horizontales – dans la section centrale du bouton cornéoscleral à travers la couche épithéliale au stroma sous-jacent.
3. Placez un moule en verre stérile dans une plaque de 6 puits avec la partie large vers le haut et placez la cornée au milieu du moule en verre, côté épithélium orienté vers le bas. Faire la coupe en plein centre de la partie inférieure du moule en verre.
4. ÉTAPE CRITIQUE : Versez 1 mL de 1% (w/v) agar à faible point de fusion dissous dans DMEM pour remplir complètement le moule en verre de cornée.
5. Laissez l’agar se fixer, puis inverser le moule en verre de sorte que l’épithélium cornéen est orienté vers le haut.
6. Pipette 15 μL de la culture bactérienne avec OD_600nm = 0,6 (pour P. aeruginosa cela équivaut à environ 1 x 10^{7 unités} de formation de colonie (CFU) en 15 μL) directement dans une zone coupée, puis ajouter 85 μL de PBS au sommet pour garder l’épithélium cornéen humide. Diluer la culture bactérienne restante et la plaque sur l’agar pour compter les unités formant des colonies pour l’inoculum.
7. Ajouter 1 mL de DMEM sans antibiotiques au fond de chaque puits avec le moule en verre. Incuber la plaque de 6 puits avec les boutons cornéoscléraux infectés dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂ jusqu’à 24 h.
8. Installez la cornée de contrôle non infectée à côté de chaque expérience. Pour mettre en place un contrôle non infecté, remplacez les 15 μL de culture bactérienne à l’étape 6.6 par des PBS stériles.

7. Homogénéisation de la cornée pour récolter les bactéries

1. Jeter le milieu DMEM du fond de la plaque de 6 puits et ajouter 1 mL de PBS stérile pour rincer le fond du puits.
2. Retirez doucement le PBS en pipetage sans toucher la partie centrale du bouton cornéosclérical. Retirez l’anneau de verre à l’aide de forceps stériles et placez-le dans le Distel à 5 %.
3. Rincez doucement le dessus du bouton cornéosclérical avec 1 mL de PBS deux fois [facultatif].
4. Tenez le bord du bouton cornéoscleral avec de fines pointes et détachez-le de l’agar en dessous.
5. Transférer la cornée dans un tube de 50 mL rempli de glace froide de 1 à 2 mL de PBS.
6. Utilisez un homogénéiseur fine pointe pour sheer le dessus de la cornée infectée. Le tissu n’a pas besoin d’être complètement liquidé. L’homogénéisant aide à détacher les bactéries de l’épithélium cornéen et de la zone coupée.
7. Vortex la cornée dans PBS pendant quelques secondes pour mélanger le contenu.
8. Ajouter 20 μL de l’homogénéité à 180 μL de PBS et effectuer des dilutions en série dans une plaque de 96 puits.
9. Diluer périodiquement la suspension à 10^-4 et 10^-5 dilution et pipette 10 μL de l’homogénéité diluée avec des bactéries sur une plaque d’agar sanguin. Incuber la plaque pendant 8 heures et compter le nombre de CFU. Lors de l’essai de l’effet des antimicrobiens, le facteur de dilution approprié doit être arrivé expérimentalement.

La conception des moules en verre sont une idée innovante et originale, dont l’utilisation nous a permis de mettre en place le modèle d’une manière cohérente avec un minimum / pas de problèmes avec la contamination. Les moules ont été préparés par un souffleur de verre à l’Université de Sheffield sur la base d’une conception (Figure 1A). La configuration expérimentale maintient la forme convexe de la cornée et maintient les bactéries sur le dessus de l’épithélium où l’infection a lieu (Figure 1B).

Les cornées porcines gonflent habituellement après quelques jours à moyen. C’est normal et nous avons constaté qu’il n’y avait pas de différence significative entre les cornées avec et sans ajout de dextran, qui est habituellement ajouté pour prévenir l’enflure de la cornée (Figure 1H). Les cornées sont généralement blessées pour aider les bactéries à pénétrer l’épithélium. Bien qu’il n’y ait pas eu de différence significative dans le progrès de l’infection entre les cornées blessées (coupées) et non blessées (non coupées), nous avons remarqué plus de variations entre les répliques dans les cornées non coupées (figure 1C). Laver les cornées deux fois avec PBS élimine l’excès de bactéries qui ne se sont pas attachés à l’épithélium. Il y avait une différence significative dans cfu entre les cornées porcines lavées et non lavées infectées par P. aeruginosa PAO1 pendant 24 heures (Figure 1D). Il n’y avait aucune différence significative dans les dénombrements de cfu entre les cornées de porcine et de lapin infectées par PA14 et PAO1(figure 1E,1F). Les résultats pour les deux modèles étaient reproductibles. Après 24 heures, la cornée infectée par l’une ou l’autre souche Pseudomonas développe toujours l’opacité et la zone coupée devient plus visible et ouverte par rapport à la cornée non infectée (Figure 1G).

Figure 1: Ex vivo cornée infectée par Pseudomonas aeruginosa. (A) Image schématique d’un moule en verre utilisé pour maintenir la forme de la cornée et faciliter l’introduction de bactéries et de traitements. L’épaisseur des moules en verre est de 1,5 mm et est la même que l’épaisseur des tubes à essai en verre borosilicate. (B) Image schématique de la mise en place expérimentale. (C) Tester l’effet de la blessure sur le décompte final de l’UNIVERSITÉ après homogénéisation. Les cornées non coupées (n = 16) et coupées (n = 28) ont été infectées par P. aeruginosa PAO1 et P. aeruginosa PA14 pendant 24 heures. Les cornées ont été lavées avec 1 mL de PBS avant homogénéisation. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. (D) Tester l’effet du lavage des cornées avec 2 x 1 mL de PBS (n = 6) et ne pas laver (n = 6) sur le décompte final de la CFU après l’infection par P. aeruginosa PAO1 pendant 24 heures. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. (E) Compte final de CFU dans les cornées porcines infectées par P. aeruginosa PAO1 et P. aeruginosa PA14 pendant 24 heures (n = 10). Les cornées ont été lavées et coupées. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. (F) Compte final de CFU dans les cornées de lapin infectées par P. aeruginosa PAO1 et P. aeruginosa PA14 pendant 24 heures (n = 6). Les cornées ont été lavées et coupées. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. (G) Photos de cornées porcines ex vivo infectées par P. aeruginosa PAO1 pendant 24 heures. Le contrôle a été blessé, mais aucune bactérie n’a été ajoutée. Les cornées infectées ont été blessées et 107 CFU ont été ajoutés au côté coupé. Aucun CFU n’a été récupéré de la cornée de contrôle. (H) Le CFU final s’est rétabli après 24 heures d’infection par P. aeruginosa PAO1 des cornées traitées par dextran (n = 2) et celles sans dextran (n = 9). Les cornées ont été lavées et coupées. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.