Application de thérapie de phage pour contrecarrer l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique

Résumé

Présenté ici est un protocole pour l’infection de Pseudomonas aeruginosa et l’application de thérapie de phage dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique (CF).

Résumé

La résistance aux antimicrobiens, une conséquence majeure de l’incertitude diagnostique et de la surprescription antimicrobienne, est une cause de plus en plus reconnue d’infections graves, de complications et de mortalité dans le monde entier, avec un impact énorme sur notre société et sur le système de santé. En particulier, les patients dont le système immunitaire est affaibli ou qui souffrent de pathologies préexistantes et chroniques, comme la fibrose kystique (FK), sont soumis à des traitements antibiotiques fréquents pour contrôler les infections par l’apparition et la diffusion d’isolats multirésistants. Par conséquent, il est urgent de s’attaquer aux thérapies alternatives pour contrer les infections bactériennes. L’utilisation de bactériophages, ennemis naturels des bactéries, peut être une solution possible. Le protocole détaillé dans ce travail décrit l’application de la thérapie de phage contre l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de zebrafish de CF. Les embryons de poisson zèbre ont été infectés par P. aeruginosa pour démontrer que la thérapie par phage est efficace contre les infections à P. aeruginosa, car elle réduit la létalité, la charge bactérienne et la réponse immunitaire pro-inflammatoire chez les embryons atteints de FK.

Introduction

La thérapie par phages, l’utilisation des ennemis naturels des bactéries pour combattre les infections bactériennes, suscite un regain d’intérêt à mesure que la résistance bactérienne aux antibiotiques se^{généralise 1,2}. Cette thérapie, utilisée depuis des décennies en Europe de l’Est, pourrait être considérée comme un traitement complémentaire aux antibiotiques dans le traitement des infections pulmonaires chez les patients atteints de FK et une alternative thérapeutique possible pour les patients infectés par des bactéries qui sont résistantes à tous les antibiotiques^{actuellement utilisés 2<....}

Protocole

Le poisson zèbre adulte (Danio rerio) de la souche AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) est maintenu selon les directives internationales (directive européenne 2010/63/UE) et nationales (décret italien du^{4 mars} 2014, n° 26) sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les conditions normales sont fixées dans l’installation de pêche avec un cycle sombre de 14 h/10 h et une température de l’eau du réservoir à 28 °C.

1. Préparation de solutions et d’outils

1. Préparer une solution 50x stock et 1x solutions de travail pour le milieu embryonnaire E3 pour la culture d’embryons de poisson zèbr....

Résultats

Les résultats et les chiffres présentés ici sont renvoyés aux embryons de FK générés par l’injection de cftr morpholinos tel que décrit^{précédemment 10} et à l’étape 5. Pour valider le phénotype de CF, la position altérée des organes internes tels que le coeur, le foie, et le pancréas comme^{précédemment décrit 17} (figure 1) ont été considérées. Des résultats similaires ont été obtenus dans le cas des embryons wt tels que rapportés dans no.......

Discussion

Dans ce manuscrit, nous avons décrit le protocole pour effectuer l’infection de P. aeruginosa (PAO1) dans les embryons de poisson zèbre et comment appliquer la thérapie de phage avec un cocktail de phages précédemment identifiés comme capables d’infecter PAO1 pour le résoudre. L’utilisation de bactériophages comme alternative aux traitements antibiotiques est de plus en plus intéressante depuis quelques années. Cela est principalement dû à la diffusion d’infections bactériennes multirésistantes (DMR), qui consti.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bacto Agar	BD	214010
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	10043-52-4
CsCl	Sigma-Aldrich	289329
Phospate de Dulbecco solution saline tamponnée PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate	Sigma-Aldrich	886-86-2	nom commun tricaïne
Micromanipulateur Femtojet	Eppendorf	5247
Fleming/brown P-97	Sutter Instrument Company	P-97
LE-Agarose	Sigma-Aldrich	11685660001
Agarose à bas point de fusion	Sigma-Aldrich	CAS 9012-36-6
Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Bleu	de méthyleSigma-Aldrich	28983-56-4
Aiguilles de micro-injection			de Harvard
N-Phénylthiourée >=98 %	Aldrich-P7629	103-85-5
Oligo Morpholino	Gene Outils		conçus par le chercheur
PEG6000	Calbiochem	528877
Phenol Red Solution	Sigma-Aldrich	CAS 143-74-B
Chlorure	de potassium Sigma-Aldrich	7447-40-7
Pronase	Sigma-Aldrich	9036-06-0
Chlorure de sodium réactif ACS, &ge ; 99.0 %	Sigma-Aldrich	S9888
Stéréomicroscope	Leica	S9I
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tryptone	Oxoid	LP0042B
Extrait de levure	Oxoid	LP0021B
Z-MOLDS Microinjection	Word Instruments de

Appareil précision