Summary
هنا نقدم طريقة بسيطة وفعالة لعزل الخلايا الجرثومية الحية الميوتيك وما بعد الومياء من الخصيات الماوس الكبار. باستخدام السمية الخلوية المنخفضة ، وصبغة ملزمة الحمض النووي ذات الحماس البنفسجي وفرز الخلايا المنشطة بالفلور ، يمكن للمرء عزل مجموعات الخلايا المنوية الغنية للغاية للعديد من تطبيقات المصب.
Abstract
عزل الحيوانات المنوية meiotic ضروري للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة في meiosis والحيوانات المنوية. على الرغم من وجود بروتوكولات عزل الخلايا المنشأة باستخدام Hoechst 33342 تلطيخ في تركيبة مع فرز الخلايا المنشطة بالفلور، فإنه يتطلب فرز الخلايا مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. هنا وصف بروتوكول عزل الخلية باستخدام وصمة عار فيوليت DyeCycle (DCV)، وهو منخفض صبغة الحمض النووي ربط السامة للخلايا هيكليا مماثلة لHoechst 33342. يمكن أن يكون DCV متحمسًا من قبل كل من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة البنفسجية ، مما يحسن مرونة اختيار المعدات ، بما في ذلك فرز الخلايا غير المجهزة بالليزر فوق البنفسجي. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن يعزل ثلاثة من الخلايا الحية الفرعية في الطور الطوري meiotic الأول، بما في ذلك اللبتوتين / zygotene، pachytene، وseetocytes diplotene، فضلا عن الحيوانات المنوية جولة ما بعد الميوتيك. كما أننا نتصف بروتوكولًا لإعداد التعليق أحادي الخلية من الخصيص الماوس. عموما، يتطلب الإجراء وقتا قصيرا لإكمال (4-5 ساعات اعتمادا على عدد الخلايا اللازمة)، مما يسهل العديد من التطبيقات المصب.
Introduction
Spermatogenesis هي عملية معقدة حيث عدد قليل من الخلايا الجذعية spermatogonial الحفاظ على الإنتاج المستمر لعدد كبير من الحيوانات المنوية في جميع أنحاء حياة الكبار1,2. أثناء تكوين الحيوانات المنوية، chromatin الحيوية إعادة عرض يحدث عندما تخضع الخلايا المنوية meiosis لإنتاج الحيوانات المنوية haploid3,4,5. عزل الحيوانات المنوية meiotic ضروري للتحقيق الجزيئي، وقد أنشئت عدة طرق مختلفة لعزل الحيوانات المنوية meiotic، بما في ذلك الفصل القائم على الترسيب6،7 وفرز الخلايا المفلورة المنشطة (FACS)8،9،10،11،12،13،14،16،17. ومع ذلك، هذه الطرق لها قيود فنية. في حين أن فصل الترسب القائم على العائدين على عدد كبير من الخلايا5,6,7, فمن كثيفة العمالة. الأسلوب القائم على FACS المنشأة يستخدم Hoechst 33342 (Ho342) لفصل الحيوانات المنوية meiotic على أساس محتوى الحمض النووي وخصائص نثر الضوء ويتطلب FACS فرز الخلايا مجهزة الأشعة فوق البنفسجية (UV) ليزر8،9،10،11. تتطلب الطرق القائمة على FACS البديلة خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي أعرب عن البروتينات الفلورية، وتزامن من الحيوانات المنوية12، أو تثبيت الخلايا ووضع العلامات الأجسام المضادة التي لا تتوافق مع عزل الخلايا الحية13. في حين أن هناك طريقة بديلة أخرى باستخدام صبغة ربط الحمض النووي القابلة للنفاذ الخلوية ، فإن صبغة DyeCycle Greenstain 14،15،16،17، يوصى بهذه الطريقة لعزل الخلايا المنوية من الخصية. لذلك، هناك حاجة ماسة لتطوير طريقة عزل بسيطة وقوية لـ الحيوانات المنوية النيوية الحية التي يمكن تطبيقها على أي سلالة فأرة من أي عمر ويمكن تنفيذها باستخدام أي فارز خلية FACS.
هنا نحن وصف مثل بروتوكول عزل الخلايا التي طال السعي باستخدام وصمة عار DyeCycle البنفسجي (DCV). DCV هو السمية الخلوية المنخفضة، خلية نفاذية صبغة ملزمة الحمض النووي مماثلة هيكليا لHo342 ولكن مع طيف الإثارة تحولت نحو نطاق البنفسجي18. وبالإضافة إلى ذلك، فإن DCV لديها طيف أوسع من الانبعاثات مقارنة بـ DCG. وهكذا، يمكن أن يكون متحمس من قبل كل من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة الليزر البنفسجية، مما يحسن مرونة المعدات، مما يسمح باستخدام فارز خلية FACS غير مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. يستخدم بروتوكول DCV المعروض هنا فصل ثنائي الأبعاد مع الأزرق DCV و DCV الأحمر، يحاكي ميزة بروتوكول Ho342. مع هذه الميزة، لدينا بروتوكول DCV يسمح لنا لعزل الخلايا الجرثومية المخصب للغاية من الخصية الكبار. نحن نقدم بروتوكول البوابات مفصلة لعزل الخلايا المنوية الحية من الخصيتين الماوس الكبار من فأر واحد (من اثنين من الخصيتين). كما أننا نتصف بروتوكولاً فعالاً وسريعاً لإعداد التعليق أحادي الخلية من الخصيص الماوس التي يمكن استخدامها لعزل الخلية هذه. يتطلب الإجراء وقتًا قصيرًا لإكماله (إعداد تعليق خلية واحدة - ساعة واحدة ، تلطيخ صبغ - 30 دقيقة ، وفرز الخلايا - 2-3 ساعات: المجموع - 4-5 ساعات اعتمادًا على عدد الخلايا اللازمة ؛ الشكل 1). بعد عزل الخلية، يمكن إكمال مجموعة واسعة من التطبيقات المصب بما في ذلك RNA-seq، ATAC-seq، ChIP-seq، والخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (البروتوكول رقم 110). IACUC2018-0040) في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال.
1. معدات والكواشف الإعداد لإعداد تعليق خلية الخصية
- إعداد كل مخزون انزيم في 1x هانكس 'حل الملح المتوازن (HBSS) وتخزينها في -20 درجة مئوية(الجدول 1).
ملاحظة: الإعداد في أي وقت قبل التجربة. - قبل يوم واحد من التجربة: أنابيب جمع المعطف (1.5 مل أنابيب) مع مصل الأبقار الجنين (FBS) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في يوم التجربة: تعيين حمام الماء إلى 37 درجة مئوية.
- قبل الدافئة Dulbecco معدلة النسر المتوسط (DMEM) في 37 درجة مئوية وإعداد 2 مل من 1x فصل العازلة لكل عينة الحق قبل الاستخدام(الجدول 1)في 15 مل أنبوب الطرد المركزي.
ملاحظة: يتم إعداد 2 مل انفصال مؤقت لخصيتين. للحصول على وصفة عازلة الانفصام، يرجى الرجوع إلى الجدول 1.
2. تشريح الحيوان وإعداد تعليق خلية الخصية
- التضحية فأر ذكر يبلغ من العمر 8 أسابيع عن طريق ترك في غرفة ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- إزالة كل من الخصيتين ووضعها على طبق بيتري 60 ملم يحتوي على 2 مل من الجليد الباردة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
- إزالة tunica albuginea من الخصيات. تفريق قليلا الأنابيب seminiferous عن طريق فصل بلطف مع ملقط.
- نقل الأنابيب seminiferous إلى طبق بيتري 100 مم مع قطرة جديدة من الجليد البارد PBS وفك الأنابيب seminiferous بلطف مع ملقط. كرر هذا الغسيل 3 مرات لإزالة الخلايا الخلالية قدر الإمكان.
- احتضان تينول شبه منجلة غير متشابكة في أنبوب 15 مل تحتوي على 2 مل من العازلة تفكك في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- بلطف ماصة الأنابيب 20 مرات باستخدام ميكروبيبت 1000 ميكرولتر.
- احتضان لمدة 6 دقائق. كرر الأنابيب لطيف 20 مرات.
- احتضان لمدة 3 دقائق. كرر الأنابيب لطيف 10 مرات حتى لا تبقى قطع مرئية.
- إضافة 10 مل من المخزن المؤقت FACS إلى التعليق. جهاز طرد مركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من الفائق.
- كرر الخطوة 2.9 مرتين لإزالة الحيوانات المنوية والحطام أكبر قدر ممكن.
3. تلطيخ الخلية
- Resuspend بيليه الخلية مع 3 مل من العازلة FACS(الجدول 1)وتصفية تعليق الخلية من خلال 70 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون في أنبوب 50 مل.
ملاحظة: العائد المتوقع للخلية هو حوالي 100 مليون خلية لكل خصيتين (من ماوس B6 من نوع البرية 8 أسابيع). - عد عدد الخلية وتقسيم 10٪ من الخلايا إلى أنبوب جديد كتحكم سلبي غير ملوث وترك على الجليد.
- أضف 6 ميكرولتر من وصمة DCV (التركيز الأصلي هو 5 mM) إلى تعليق الخلية المتبقية وخلط جيدا. التركيز النهائي هو 10 ميكرومتر، والقدرة حوالي 100 مليون خلية.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام. يهز بلطف تعليق الخلية كل 10 دقيقة.
- بعد الحضانة، دون خطوة غسل، إضافة مباشرة 5 ميكرولتر من DNase الأول (تركيز المخزون هو 10 ملغ /مل) إلى تعليق الخلية وتصفية الخلايا في أنبوب FACS 5 مل من خلال 35 ميكرومتر غطاء شبكة النايلون. إبقاء العينات على الجليد حتى الفرز.
4. تدفق البوابات الوُقَل والتجريبية
- قم بتجهيز فارز خلية FACS. ضمان أن فارز الخلية FACS مجهز بصريات الإثارة: البنفسجي (405 نانومتر) ليزر؛ البصريات الكشف: مزيج من مرشح 450/50 bandpass [نفس مجموعة مرشح من 4′, 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) للكشف DCV-الأزرق] و 665/30 bandpass [نفس مجموعة مرشح من Allophycocyanin (APC) للكشف DCV الأحمر]. هنا نستخدم سوني SH800S فرز الخلايا كمثال.
- إنشاء تجربة جديدة وإعداد المؤامرات العمل التالية عرض المعلمات لتكون الأمثل: انقر فوق "كثافة جديدة" على " أدواتورقة العمل" شريط القوائم لإنشاء مبعثر إلى الأمام - منطقة (FSC-A) مقابل التشتت الخلفي – منطقة (BSC-A) مؤامرة كثافة على مقياس خطي. انقر فوق "الرسم البياني الجديد" لإنشاء رسم مدرج مدرجي أزرق DCV على مقياس لوغاريتمي.
- دوامة لفترة وجيزة التحكم السلبي غير المقعة (من الخطوة 3.2) وتحميل العينة.
- انقر فوق "ابدأ" و "سجل" لبدء معالجة العينة غير المطّع. بينما يتم تشغيل العينة، انقر فوق"كشف وإعدادات العتبة"لتحسين FSC والفولطية BSC عن طريق ضبط كل من أنبوب المضاعفة الضوئية (PMT) الفولتية صعودا أو أسفل لوضع الخلايا غير الملطخة على مقياس مؤامرة FSC / BSC.
- ضبط الجهد PMT صعودا وهبوطا على "FL1: DAPI" بينما يتم تشغيل العينة لتحديد موقع السكان DCV السلبية في العقد الأول من مؤامرة DCV-الأزرق الرسم البياني اللوغاريتمي(الشكل 2A). بعد الانتهاء من تعديل الجهد PMT، انقر فوق "إيقاف" لتفريغ العينة غير المطهية.
- دوامة العينة (من الخطوة 3.5) و قم بتحميل العينة.
- انقر فوق "الأنبوب التالي" لإنشاء ورقة عمل جديدة للعينة DCV الملطخة؛ وانقر على "ابدأ" و "سجل" للحصول على عينة DCV الملطخة ، سجل ≥ 1 × 106 الأحداث. إضافة المؤامرات العمل التالية: انقر فوق "كثافة جديدة" على " أدواتورقة العمل" شريط القوائم لإنشاء FSC-H (ارتفاع) مقابل FSC-W (عرض) رسم كثافة على مقياس خطي; انقر فوق "كثافة جديدة" لإنشاء DCV - الأزرق مقابل مؤامرة DCV الحمراء كثافة على مقياس خطي. بعد تسجيل ≥ 1 × 106 الأحداث ، انقر فوق "إيقاف" وتفريغ العينة.
- على FSC-A مقابل BSC-A مؤامرة كثافة، انقر فوق "مضلع" على "أدوات المؤامرة" شريط القوائم لرسم بوابة كبيرة "الخلايا" لتشمل معظم الخلايا واستبعاد الحطام الصغير (الشكل 2B). تطبيق البوابة "الخلايا" لFSC - H مقابل FSC - W مؤامرة كثافة. انقر فوق "مستطيل" لرسم "خلايا واحدة" بوابة لاستبعاد الخلايا غير الفردية (الشكل 2C).
- تطبيق "خلايا واحدة" بوابة لDCV- الأزرق مقابل DCV-أحمر مؤامرة كثافة وضبط مقياس لالتقاط ملف تعريف موسع كما هو مبين في الشكل 2D. انقر فوق "مضلع" على "أدوات المؤامرة" شريط القوائم لرسم "DCV" بوابة لاستبعاد الخلايا غير المطّطى والسكان الجانب(الشكل 2D).
- تطبيق "DCV" بوابة لDCV الأزرق الرسم البياني مؤامرة على مقياس خطي. تشير القمم الرئيسية الثلاث إلى محتوى الحمض النووي المختلف: 1C و 2C و 4C(الشكل 2E).
- انقر فوق "كثافة جديدة" لإنشاء DCV-blue vs. DCV-أحمر مؤامرة الكثافة على مقياس خطي وتطبيق "DCV" بوابة لأداء العودة الغسور من الشكل 2E لتحديد موقع السكان 1C و 4C (الشكل 2F). انقر فوق"القطع الناقص"لرسم بوابة على السكان 1C، الذي هو داخل منطقة مكثفة (بوابة 1C). انقر فوق "مضلع" لرسم بوابة على السكان 4C الذي هو منحنى مستمر (بوابة 4C).
- انقر فوق "كثافة جديدة" لإنشاء DCV-الأزرق مقابل مؤامرة DCV-أحمر كثافة على مقياس خطي وتطبيق بوابة "4C"; ضبط مقياس للتكبير وانقر فوق"مضلع"لرسم بوابة "4C_1" لاختيار أكثر دقة(الشكل 2G).
- انقر فوق "كثافة جديدة" لإنشاء FSC -A مقابل مؤامرة كثافة BSC-A على مقياس خطي وتطبيق بوابة "4C_1"؛ سيكون هناك ثلاثة من السكان المخصب مفصولة الحجم المقابلة لللبيتوتين (L) / zygotene (Z)، pachytene (ف) وdiplotene (D) الحيوانات المنوية. انقر فوق "المضلع" أو "القطع الناقص" لرسم 3 بوابات: "L / Z" ، "P" و "D" على أساس حجم متزايد (الشكل 2H).
- انقر فوق "جديد نقطة مؤامرة" لإنشاء DCV- الأزرق مقابل DCV-أحمر لون نقطة مؤامرة على مقياس خطي لتطبيق البوابة وضمان السكان الثلاثة في ترتيب مستمر داخل بوابة "4C_1" ( الشكل2I).
- وبالمثل، بالنسبة للسكان 1C، انقر فوق"كثافة جديدة"لإنشاء جديد FSC-A مقابل مؤامرة كثافة BSC-A على مقياس خطي وتطبيق بوابة "1C"، حدد الحجم الموحد للخلايا كما نقية جولة الحيوانات المنوية السكان، وانقر فوق"القطع الناقص"لرسم "RS" بوابة (الشكل 2J).
5. فرز الخلايا الجرثومية الذكور الفرعية
- إعداد 1.5 مل أنابيب تحتوي على 500 ميكرولتر 50٪ FBS لجمع الخلايا وتحميل أنبوب جمع في جامع وانقر فوق "جمع تحميل".
- انقر فوق "الأنبوب التالي" ، "ابدأ"، " سجل" و " فرزابدأ". لاستخدام نظام ثنائي الاتجاه الذي يسمح اثنين من السكان من الفائدة ليتم فرزها في نفس الوقت في جهاز جمع، اتبع تركيبات pairwise: leptotene (L) / zygotene (Z) وpachytene (ف) الحيوانات المنوية على أساس L / Z وP البوابات الخلفية؛ الحيوانات المنوية جولة (RS) وdiplotene (د) الحيوانات المنوية على أساس RS وD البوابات الخلفية.
- أثناء تشغيل العينة، ضبط معدل التدفق إلى أحداث 3000 ~ / s للحصول على الفرز الأكثر كفاءة.
6. تحليل النقاء من الخلايا فرزها
- جمع ≥ 10،000 خلية / كل مجموعة سكانية. إجراء مناعة الخلية لتأكيد المرحلة الفرعية.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص بعناية من الفائقة، والحفاظ على حوالي 110 ميكرولتر من السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
- اتخاذ قطرة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لمراقبة تحت المجهر وتقييم نظرة عامة على مورفولوجيا الخلية وعدد.
- تطبيق 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل من الشرائح غرفة عينة (انظر جدول المواد)،وتحميل الغرف إلى Cytospin.
- تدور العينات في 30 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. رسم دائرة حول الخلية مع قلم مبيد للماء. الشرائح الجافة على مقاعد البدلاء مختبر لبضع دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إسقاط 50 μL من برنامج تلفزيوني في دائرة الشريحة والاستفادة من الخروج.
- إضافة محلول الأجسام المضادة الأولية (تمييع الأجسام المضادة الأولية مع مصل حمار 5٪ في PBS مع 0.02٪ بوليسوربات 20) في دائرة الشريحة واحتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: للحكم على الفئات الفرعية من الحيوانات المنوية meiotic، تم الكشف عن SYCP3، وهو علامة على محاور كروموسوم ميوتيك، وγH2AX، وهو علامة على استجابة الضرر الحمض النووي. (بالنسبة لتركيز العمل للأجسام المضادة، يرجى الرجوع إلى جدول المواد). - انقر فوق حل الأجسام المضادة الأساسية من الشرائح.
- إسقاط 50 μL من برنامج تلفزيوني في دائرة الشريحة والاستفادة من الخروج. كرر مرة واحدة.
- إضافة حل الأجسام المضادة الثانوية (تمييع الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ Polysorbate 20) في دائرة الشريحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام.
- إسقاط 50 μL من برنامج تلفزيوني في دائرة الشريحة والاستفادة من الخروج. كرر مرة واحدة.
- إضافة 50 ميكرولتر من DAPI (تركيز المخزون هو 0.1 ميكروغرام / مل) وصمة عار لمدة 5 دقائق والاستفادة من قبالة.
- إضافة 1-2 قطرات من تصاعد وسائل الإعلام على الشرائح. قم بتغطية الوسائط المتصاعدة بعناية بزجاج غطاء واضغط بلطف على زجاج الغطاء لإزالة المزيد من الوسائط المتصاعدة وفقاعات الهواء. الشرائح جاهزة للتقييم المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر نتيجة تمثيلية لبروتوكول الفرز هذا في الشكل 3. يبلغ إجمالي وقت الفرز لخصيتين (فأرة واحدة) عادة حوالي 3 ساعات، وهو ما يعتمد على تركيز تعليق الخلية وسرعة الفرز. بعد الفرز، يتم تأكيد نقاء الحيوانات المنوية عن طريق الكبت المناعي من SYCP3 و γH2AX (الشكل 3A). نقاء ممثل فرز L / Z، P، D spermatocyte الكسور حوالي 80.4٪، 90.6٪، و 87.6٪، على التوالي(الشكل 3C). لقد حددنا المراحل الفرعية على أساس المعايير التي نشرناها سابقا19. باختصار ، في مرحلة اللبتوتين والزيدوتين ، يكون المشبك بين الكروموسومات المتماثلة غير مكتمل ، وهو ما تشير إليه خيوط رقيقة من تلطيخ SYCP3. ويلاحظ نطاقات واسعة γH2AX في جميع أنحاء الكروماتين النووية بسبب مضاعفة الحمض النووي المبرمجة فواصل حبلا. في مرحلة pachytene، الكروموسومات المتجانسة قد متشابك تماما، ويتراكم على وجه التحديد γH2AX على الكروموسومات الجنس. في مرحلة diplotene ، الكروموسومات المتجانسة تخضع تدريجيا desynapsis. يتم تأكيد نقاء RS بواسطة نواة تلطيخ مع DCV (الشكل 3B). RS يمكن الحكم بدقة مع تلطيخ الحمض النووي: chromocenter DAPI مكثفة فريدة من نوعها محاطة euchromatin; أو الجمع مع علامات محددة، مثل Sp56 التي يتم التعبير عنها داخل الحبيبية acrosomal النامية من الحيوانات المنوية والهيستون البديل H1T التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في نواة بعد مرحلة منتصف pachytene(الشكل 3B).
RS النقاء حوالي 90.1٪ بعد الفرز (الشكل 3C). حجم العينة من تحليل النقاء أكثر من 1000 خلية لكل تجربة؛ يتم متوسط نقاء السكان L / P وD من 6 تجارب مستقلة؛ متوسط نقاء السكان P و RS من 3 تجارب مستقلة. إن صلاحية هذه الخلايا المعزولة عادة ما تكون أكثر من 95٪(الشكل S1). ويقدر إجمالي العائد من كل كسر من فأرة البالغين واحد والمدرجة في الشكل 3C، الذي يوفر خلايا كافية لتحليلات المصب المختلفة. في الآونة الأخيرة، لقد استخدمنا هذا البروتوكول لعزل الحيوانات المنوية من نوع البرية من نوع لChIP-seq تحليل20،21.
| الكاشف | العنصر | تركيز المخزون | حجم |
| (قاعدة HBSS) | |||
| المخزن المؤقت للتفكك | DMEM | - | 2 مل |
| (قاعدة DMEM) | FBS | - | 40 ميكرولتر |
| هيالورونيداز | 100 ملغ / مل | 30 ميكرولتر | |
| DNase I | 10 ملغ / مل | 50 ميكرولتر | |
| كولاجيناز من النوع الأول | 100 ملغ / مل | 40 ميكرولتر | |
| كولاجيناز المؤتلف | 14000 وحدة / مل | 100 ميكرولتر | |
| مخزن FACS المؤقت | برنامج تلفزيوني | - | 980 مل |
| (قاعدة PBS) | FBS | - | 20 مل |
الجدول 1: وصفة الكاشف. يجب أن يتم تحضير المخزن المؤقت للتفكك قبل الاستخدام مباشرة. قبل ابر DMEM قبل البدء في تشريح. ويمكن إعداد مخزون الإنزيم في أي وقت قبل التجربة وتخزينها في -20 درجة مئوية. يحتاج المخزن المؤقت FACS إلى أن يتم تصفيتها من فراغ وتخزينها عند 4 درجات مئوية؛ ما قبل الدفء إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
الشكل 1: سير عمل عزل الخلايا المنوية المورين على الفرز القائم على DCV. توضح هذه الصورة الإجراء العام ، من تفكك الأنسجة إلى فرز FACS ، إلى حصاد الخلايا المنوية المعزولة في غضون يوم واحد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل FACS لخلايا الخصية البالغة القائمة على الفلورية DCV وتشتت الضوء. (أ) اكتسبت خلايا غير مُطَمَّقة في العقد الأول من مؤامرة رسم بياني DCV-أزرق (الجانب الأيسر من الشريط الأحمر). (ب) (C) الحطام والخلية غير الفردية التي تستبعدها تناثر الضوء. (د)الخلايا غير المقعوعة واستبعاد السكان الجانب على أساس الفلوري فلورنسي DCV. (E) تحديد محتوى الحمض النووي المستندة إلى الفلورية DCV-Blue. تتوافق الذروة اليسرى (الخضراء) والذروة اليمنى (الوردية) مع 1C و 4C. (F) الغات على 1C و 4C الخصية على أساس DCV-blue/DCV-fluorescence الأحمر. (G) البوابات الدقيقة على 4C الخصية. (H) العودة الغات من بوابة 4C من مؤامرة DCV على مؤامرة FSC / BSC. استناداً إلى المناطق التي تتداخل فيها الحد الأدنى على مؤامرة FSC/BSC، يتم إنشاء البوابات L/Z و P و D لإثراء مجموعات الحيوانات المنوية الخاصة بها. (I) لون نقطة مؤامرة تظهر L / Z، P، وD السكان في ترتيب مستمر داخل بوابة 4C. (J) العودة الغات من بوابة 1C من مؤامرة DCV على مؤامرة FSC / BSC. تم إنشاء بوابة RS لإثراء السكان المنويين المستديرة بحجم موحد ، مما أدى إلى نقاء أكبر للسكان أثناء الفرز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور النتائج التمثيلية وإحصاءات الخلايا المنوية التي تم الحصول عليها من الفرز. (أ)توصيف المناعةfluorescence من الحيوانات المنوية فرزها. اللوحة العلوية: DCV تلطيخ تظهر نمط نواة من الحيوانات المنوية الحية الحق بعد الفرز; L/Z (اللبتوتين/الزيغوتين)، P (pachytene)، وD (diplotene). اللوحة السفلية: تأكيد المراحل الفرعية الميوائية لكل مجموعة سكانية عن طريق الكبت المناعي لـ SYCP3 (الأخضر) و γH2AX (أحمر). (B) ممثل DCV صورة تظهر نمط نواة RS. أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر (الألواح العلوية)، و 10 ميكرومتر (الألواح المكبرة السفلية). اللوحات اليمنى: تأكيد مناعية من الحيوانات المنوية المستديرة الملطخة بـ Sp56 و H1T. (C)تم تأكيد نقاء L/Z، P، وD بواسطة المناعة، وكان حجم العينة أكثر من 1000 خلية لكل تجربة مستقلة، في المجموع 6 تجارب مستقلة. تم تأكيد نقاء RS من خلال تلطيخ النواة مع ما مجموعه 3 تجارب مستقلة. كان إجمالي عدد الخلايا من تعليق الخلية الخصية من فأر WT B6 الذي يبلغ عمره 8 أسابيع حوالي 100 مليون خلية قبل الفرز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل S1: صلاحية الحيوانات المنوية المعزولة. صورة تمثيلية يظهر الخلية صلاحية من الحيوانات المنوية pachytene معزولة (الأحمر: PI; الأزرق: DCV). تعذر دمج PI مع DCV أثناء الفرز. ومع ذلك ، تحت المجهر ، كانت إشارة DCV الحمراء منخفضة للغاية ؛ لذلك، تم تمييز الخلايا الميتة إيجابية PI بسهولة من الخلايا الحية الأخرى. القدرة على البقاء عادة ما تكون أكثر من 95٪. قضبان مقياس: 10 μm. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل S2: التفكك غير الكامل أو الحطام يزعج الغواة. يحتوي السكان (دائرة حمراء) على حطام وبوليمر من الحيوانات المنوية (المشار إليها بواسطة السهم). أكبر عدد السكان سوف عبر مع السكان B (دائرة صفراء) وتلويث في نهاية المطاف السكان 4C. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم بروتوكول عملي وبسيط لعزل السكان الفرعية من الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية من فأر ذكر بالغ واحد. ولضمان إمكانية استنساخ هذا البروتوكول، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى الاهتمام. قبل هضم الإنزيم ، تهدف خطوة الغسيل إلى إزالة الخلايا الخلالية؛ بعد الهضم، وهذه الخطوة يساعد على إزالة الحيوانات المنوية والحطام. الغسيل / الطرد المركزي 3 مرات مهم. في وصفة العازلة تفكك لدينا, مزيج من عدة إنزيمات مختلفة يسهل تفكك الخصيات في تعليق خلية واحدة دون تلف الخلايا المفرطة. يساعد الخفقان بلطف لتجنب التسبب في فقاعات الهواء أيضًا على حماية سلامة الخلايا. يرجى التحقق من تعليق الخلية تحت المجهر بعد الانفصال للتأكد من أن التعليق يحقق مستوى خلية واحدة. سوف التفكك غير كاملة أو تلوث الحطام من الهضم المفرط تؤثر على نقاء الخلايا فرزها; كما هو مبين في الشكل S2، فإن السكان المستقيمين يحتوي على حطام و tetramer من الحيوانات المنوية. يتطلب تلطيخ DCV حضانة في الظلام وعدم غسل بعد ذلك.
لاستكشاف الصعوبات المحتملة على الغاء والعودة الغات من المنشآت الفرعية spermatocyte، كخيار للتحسين، نوصي باستخدام متزامنة نوع الماوس البرية للمساعدة في تحديد موقع مرحلة معينة من spermatocytes22،23،24. ومن الجدير بالذكر أيضا أن بعض سلالات الماوس بالضربة القاضية مع spermatogenesis اعتقال الأنماط الظاهرية قد يكون لها ملامح DCV غير مألوف لأنها في عداد المفقودين بعض السكان الفرعية. ويوصى بشدة التحكم في النمط البري السليم في هذه الحالة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الفئران البالغة من أي عمر. ومع ذلك، يمكن أن يكون عمر الماوس التجريبي عاملاً مربكاً بسبب النسبة المتغيرة للخلايا الجرثومية.
على مر السنين، تم تطوير العديد من البروتوكولات لتنقية الخلايا الجرثومية. باعتبارها واحدة من الأساليب الأكثر شعبية ، STA-PUT السرعة الترسب يفصل الخلايا الجرثومية من قبل معامل BSA و يوفر العائد الجيد من الخلايا الجرثومية سليمة6،7. ومع ذلك، STA-PUT لا يتطلب فقط الأجهزة الخاصة التي قد لا تكون متاحة بسهولة لكثير من المختبرات ولكن أيضا مضيعة للوقت وكثيفة العمالة لإجراء في غرفة باردة في 4 درجة مئوية. على عكس STA-PUT، وهي مناسبة لفصل واسع النطاق، يمكن أن توفر هذه الطريقة المستندة إلى FACS نقاءً عاليًا وكسرًا دقيقًا لتجربة صغيرة. فرز واسع النطاق باستخدام بروتوكول لدينا هو ممكن ولكن إطالة وقت الفرز بشكل كبير وقد يعرض للخطر الخلية. لذلك، STA-PUT لا يزال خياراً عملياً عند الحاجة إلى عدد كبير من الخلايا5,25,26.
بالمقارنة مع الأسلوب السابق FACS على أساس Ho342 صبغ تلطيخ8،9،10،11، يستخدم بروتوكول لدينا DCV ، والتي لديها طيف أوسع ويمكن تطبيقها على معظم الفرز FACS الحالية مجهزة بالأشعة فوق البنفسجية أو 405 نانومتر ليزر البنفسجي18. على الرغم من أن هناك بروتوكول آخر باستخدام DCG14،15،16،17، فإن الفرق بين بروتوكولنا وبروتوكول DCG هو أن بروتوكول DCV يستخدم فصل ثنائي الأبعاد مع DCV الأزرق و DCV الأحمر ، مما يحاكي ميزة بروتوكول Ho342. مع هذه الميزة، لدينا بروتوكول DCV يسمح لنا لعزل الخلايا الجرثومية المخصب للغاية من الخصية الكبار. لا يستخدم بروتوكول DCG الفصل ثنائي الأبعاد ويوصى به لعزل الخلايا الجرثومية عن الفئران الصغيرة. يمكن أن يكون للفصل ثنائي الأبعاد دقة أفضل لفصل المراحل الفرعية من الحيوانات المنوية. ومع ذلك، فإن طريقتنا لا تزال غير قادرة على عزل اللبيتوتين وzygotene spermatocytes بشكل منفصل، فضلا عن أنواع الخلايا "2C" بما في ذلك spermatogonia، ما قبل اللبثات المنوية، والحيوانات المنوية الثانوية.
منذ طيف الانبعاثات واسعة من البقعة DCV يسبب تسرب إلى قنوات أخرى، ومعظم صبغات قابلية الخلية مثل PI و 7AAD لا يمكن الجمع بين بسبب إشارات إيجابية كاذبة. قد تكون الأصباغ الأخرى لقابلية البقاء في الخلية مع الانبعاثات في قنوات الأشعة تحت الحمراء البعيدة أو القريبة من صلاحية تستحق المحاولة في المستقبل. ولكن في تجربتنا، تظهر الخلايا فرز عادة ≥ 95٪ قابلية البقاء بعد 2 ساعة من FACS الفرز (الشكل S1)، وهو ما يكفي لتحليل المصب.
يمكن استخدام الخلايا المفرزة التي تم الحصول عليها من إجراءنا في تجارب مختلفة للمصب، بما في ذلك تحليل تسلسل الجيل التالي (RNA-seq، ATAC-seq، و ChIP-seq). ويمكن أيضا الخلايا التي تم الحصول عليها هنا يمكن استخدامها على المدى القصير الثقافة27. في الختام، ونحن نقدم بروتوكول بسيط ولكن فعالة بما في ذلك إجراء إعداد تعليق خلية واحدة لمدة ساعة واحدة واستراتيجية مفصلة لغايات البوابات على أساس DCV تلطيخ صبغ، وهو مناسبة لعزل الخلايا المنوية على نطاق صغير ويمكن اعتمادها بسرعة من قبل العديد من المحققين، حتى تدفق مبتدئين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح متنافسة.
Acknowledgments
ونشكر أعضاء مختبرات "مامكاوا" و"يوشيدا" و"مايزاوا" على مساعدتهم؛ كاتي غيرهارت لتحرير المخطوطة؛ ماري آن هاندل لتقاسم الأجسام المضادة H1T, مركز مستشفى سينسيناتي للأطفال الطبي (CCHMC) البحوث تدفق Cytometry الأساسية لتقاسم معدات FACS بدعم من NIH S10OD023410; منحة في المعونة للبحوث العلمية (KAKENHI؛ 17K07424) إلى T.N.; زمالة ما بعد الدكتوراه في مؤسسة لالور؛ AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) إلى S.Y.; منحة مشروع الأبحاث من قبل قسم خدمات البحوث بجامعة أزابو، وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) - برنامج مدعوم لمشروع العلامات التجارية للبحوث الجامعية الخاصة (2016-2019)، منحة في المعونة لأنشطة البحوث الناشئة (19K21196)، مؤسسة تاكيدا للعلوم (2019)، ومنحة حوافز مؤسسة يوهارا التذكارية للأبحاث (2018) إلى S.M. المعهد الوطني للصحة R01 GM122776 إلى S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R.
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
