Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative articulaire qui implique une inflammation progressive et irréversible et la destruction de la matrice extracellulaire du cartilage articulaire¹. Bien que diverses formes d’arthrite aient de nombreux traitements^2,3,4, ceux-ci sont limités par leurs effets secondaires et leur efficacité limitée. Les techniques d’ingénierie tissulaire utilisant l’implantation de chondrocytes autologues sont couramment appliquées pour le traitement régénératif du cartilage blessé dans les lésions cartilagineuses précoces^{de l’arthrose 4}. Les thérapies cellulaires sont limitées principalement en raison du nombre limité de chondrocytes phénotypiquement stables ou de chondroprogenitors capables de réparer efficacement le cartilage³. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir la progression de la maladie et régénérer les grandes lésions cartilagineuses est d’une importance capitale.

Les vésicules extracellulaires (VE) ont été suggérées comme traitement de l’arthrose par différents auteurs^5,6. Les VE sont des corps membraneux sécrétés par la majorité des types de cellules, sont impliqués dans la signalisation intercellulaire et il a été démontré qu’ils exercent les effets thérapeutiques des cellules souches^7,8,9, en raison desquels ils ont récemment suscité un intérêt pour la médecine régénérative¹⁰. Les VE dérivés de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont les principaux VE thérapeutiques étudiés pour l’arthrose, bien que d’autres cellules liées aux articulations aient été utilisées comme sources de VE, par exemple, les chondroprogeniteurs ou les cellules immunitaires^11,12.

Les concentrés de plaquettes, tels que les lysats plaquettaires (PL), sont utilisés pour améliorer la cicatrisation des plaies dans différentes blessures, telles que les ulcères cornéens^13,14,15 ou dans la régénération du tissu tendineux¹⁶, en raison de l’hypothèse que le composant EV des concentrés plaquettaires peut être responsable de ces effets¹⁷ . Certaines études liées aux maladies articulaires utilisent des VE d’origine plaquettaire (PL-VE) comme traitement pour améliorer les conditions arthrosiques. Les PL-EV améliorent la prolifération des chondrocytes et la migration cellulaire en activant la voie Wnt/β-caténine^18,favorisant l’expression de marqueurs chondrogènes dans les chondrocytes arthrosiques^19,ou montrant des niveaux plus élevés de protéines chondrogènes et moins d’anomalies tissulaires chez les lapins arthrosiques traités par PL-VE^18.

Les VE contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques qui sont libérés dans la cellule cible, établissant une communication de cellule à cellule, qui est la principale caractéristique liée à leurs applications thérapeutiques²⁰. Les effets des véhicules électriques dépendent de leurs cellules d’atteinte et du rejet ultérieur de la cargaison. Cet effet peut être confirmé indirectement par des changements causés dans les cellules, tels que l’activité métabolique ou la modification de l’expression des gènes. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de visualiser comment les VE atteignent les cellules pour exercer leur fonction. Ainsi, cet article présente une méthode pour étiqueter ces VE dérivés de PL à utiliser comme traitement pour les explants de cartilage OA induits par l’inflammation. La microscopie confocale a été utilisée pour surveiller l’absorption et la progression de la VE vers les chondrocytes présents dans les explants en un laps de temps de 5 h.

NOTE: Les explants de cartilage ont été obtenus auprès de la biobanque IdISBa (IB 1995/12 BIO) conformément aux directives institutionnelles après approbation éthique du projet par le CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Préparation des colonnes

1. Équilibrez les colonnes en suivant les instructions du fabricant ou comme suit :
   1. Retirez le capuchon de colonne et équilibrez la colonne. Retirez le tampon de stockage par élution.
   2. Lavez la colonne 3 fois avec 2,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lors de chaque lavage, attendez que la colonne absorbe tout le volume.
      REMARQUE: Ne laissez pas la colonne sécher.
   3. Couvrir la colonne avec le bouchon après le dernier lavage et jusqu’à la préparation de l’échantillon.

2. Étiquetage des véhicules électriques

REMARQUE: Ce protocole d’étiquetage EV utilise un échantillon PL-EV précédemment isolé par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec des conditions précédemment^décrites21,²². Cependant, tout échantillon EV provenant de n’importe quelle source peut être utilisé avec ce protocole.

1. Concentrez l’échantillon EV et le contrôle (PBS) à l’aide d’un tube de concentration.
   1. Placez les échantillons dans un tube de concentration de 15 mL ou 500 μL, selon le volume de départ de l’échantillon EV de départ. Centrifugez les tubes selon les instructions du fabricant jusqu’à l’obtention d’un échantillon presque sec.
      REMARQUE: L’échantillon de contrôle est nécessaire pour vérifier tout fond de colorant. Bien que cette méthode ne nécessite aucun volume initial spécifique, il faut considérer qu’environ 10% des particules seront perdues lors des étapes de purification.
2. Remettre en suspension les échantillons concentrés avec le diluant C. Remettre en suspension les échantillons EV avec 200 μL et le groupe témoin avec 100 μL et les transférer dans de nouveaux tubes centrifuges de 1,5 mL.
3. Séparer l’échantillon EV en deux aliquotes de 100 μL. Marquez-en un avec un colorant et utilisez-le comme traitement (PKH-PL-EV); laissez l’autre non marqué, mais traitez-le (NTA-PL-EV) comme l’échantillon de VE et utilisez-le pour quantifier la concentration de VE par NTA.
4. Préparer 2x solution de colorant, résultant en une solution de PKH26 de 8 μM dans le diluant C.
5. Mélanger 1 μL de 1 mM de liant PKH26 par 125 μL de diluant C dans l’échantillon. Préparez un volume à ajouter aux échantillons dans un rapport de 1:1.
6. Ajouter 2x solution de colorant à PKH-PL-EV et contrôler les échantillons dans un rapport de 1:1 pour obtenir une concentration de colorant de 1x et une concentration de PKH26 de 4 μM. Ajoutez le même volume de PBS à l’échantillon NTA-PL-EV. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
7. Ajouter la solution d’albumine-PBS sérique bovine à 5 % aux échantillons dans un rapport de 1:1 et s’assurer que le volume final est d’environ 400 μL.
   REMARQUE: Cette étape permet d’éliminer les interactions de colorant non spécifiques ou de colorant non lié.
8. Procédez à la séparation des VÉHICULES étiquetés du colorant non lié et des interactions non spécifiques du colorant avec la colonne.

3. Isolation des véhicules électriques étiquetés

1. Retirez le bouchon de la colonne, ajoutez 400 μL de l’échantillon (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV ou témoin) et jetez tout liquide élué.
2. Attendez que l’exemple entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 μL de PBS et jeter tout le liquide élué.
3. Attendez que le PBS entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 μL de PBS et recueillir une fraction de 600 μL dans un 1,5. Tube de centrifugeuse mL (VE ou contrôle).
   REMARQUE: Ces étapes sont nécessaires pour éliminer l’excès de colorant des échantillons. Une autre séparation par colonne est nécessaire pour obtenir des VÉHICULES plus purs. Ainsi, les étapes suivantes doivent être effectuées dans une nouvelle colonne équilibrée (étape 4.1.) ou dans la même colonne après une étape de lavage initiale (étape 4.2).
4. Préparez la colonne pour une nouvelle étape de séparation des VE afin d’obtenir des VE plus purs. S’il s’agit d’une nouvelle colonne, répétez les étapes 2.1. et 2.2. S’il s’agit de la même colonne, lavez la colonne avec 2,5 mL d’isopropanol à 20 %, puis répétez les étapes 2.1 et 2.2.
5. Ajouter 600 μL de VÉHICULES électriques préalablement élués obtenus à l’étape 2.5 à la colonne et jeter le volume élué. Attendez que le liquide pénètre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.
6. Ajouter 400 μL de PBS et jeter tout le volume élué. Attendez que le liquide pénètre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.
7. Ajouter 600 μL de PBS et recueillir une fraction de 600 μL dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Utilisez les véhicules électriques et les échantillons de contrôle pour d’autres analyses ou stockez-les pendant la nuit à 4 oC.
8. Stockez les colonnes utilisées pour une utilisation ultérieure.
   1. Laver la colonne avec 25 mL d’isopropanol à 20 % et jeter le volume élué. Lavez la colonne 3 fois avec 2,5 mL de PBS.
   2. Ajoutez la mémoire tampon de stockage supprimée à l’étape 1.1.1 et attendez que la mémoire tampon entre dans la colonne. Couvrir la colonne avec le bouchon et conserver à 4 oC jusqu’à utilisation ultérieure.

4. Quantification des VE

1. Préparer les dilutions 1:1 000 de l’échantillon NTA-PL-EV et de l’échantillon PL-EV initial comme décrit dans les deux étapes suivantes.
   1. Préparer 1 mL de NTA-PL-EV dilué à 1:10 et 1 mL de PL-EV initial dilué à 1:10 avec du PBS filtré à travers un filtre de 0,2 μm.
   2. Préparer 1 mL d’une dilution à 1:100 des échantillons dilués précédents avec du PBS filtré à travers un filtre de 0,2 μm.
2. Injecter l’échantillon NTA-PL-EV dilué au 1:1 000 ou l’échantillon PL-EV initial à l’aide d’une seringue stérile dans la pompe NTA. Suivez les instructions et les recommandations du fabricant pour la détermination de la concentration des particules et de la distribution granulométrique.
   REMARQUE: Comme la concentration de VE dépend du volume de démarrage de l’échantillon, il peut être nécessaire de lire les dilutions intermédiaires et de faire des ajustements pour obtenir une détermination correcte de la NTA.

5. Ve électriques utilisés comme traitement de l’arthrose induite par l’inflammation

1. Lavez le cartilage deux fois avec du PBS et excisez-le à l’aide d’un poinçon de biopsie de 3 mm de diamètre dans des conditions stériles.
   REMARQUE: Effectuez la procédure des étapes 5.1 à 5.6 dans une culture cellulaire.
2. Placer les explantes dans des plaques de culture de 96 puits avec un milieu DMEM-F12 complété par 1% de pénicilline-streptomycine à 37 oC, 5% de CO₂et 80% d’humidité.
   1. Pour établir un modèle d’arthrose induite par l’inflammation, complétez le milieu de culture cellulaire avec 10 ng / mL d’oncostatine M et 2 ng / mL de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα).
3. Traiter les explants avec 1 × 10⁹ particules/puits de VE marqués (PKH-PL-EV) ou contrôler dans un milieu de culture cellulaire complété par de l’oncostatine M et du TNFα.
   REMARQUE: Mesurer le volume de l’échantillon contenant 1 × 10⁹ particules / puits et utiliser le même volume pour le contrôle.
4. Retirez le milieu des plaques de culture cellulaire à 96 puits contenant des explants de cartilage. Ajouter 200 μL du milieu de culture cellulaire décrit à l’étape 5.3 à chaque puits.
   REMARQUE: Si les plaques de 96 puits ont été en contact avec du sérum bovin fœtal (FBS), lavez chaque puits trois fois avec 200 μL de PBS pour retirer tout VE du FBS.
5. Arrêtez le test in vitro à différents moments: 0, 1, 2, 3, 4 et 5 h.
6. Lavez deux fois les puits de culture cellulaire contenant les explantations cartilagineuses avec 200 μL de PBS.
7. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans le tissu pour le fixer pendant 3 h à 4 oC.
   REMARQUE : Les étapes impliquant des PFA doivent être effectuées dans une hotte aspirante conformément aux recommandations de la fiche de données de sécurité.
8. Retirer le PFA, ajouter 100 μL de PBS, conserver le tissu fixe à 4 °C et traiter les échantillons dans les 48 h.

6. Préparation et visualisation de la microscopie

REMARQUE: Cette procédure histologique consiste en des étapes de déshydratation, d’incorporation de paraffine et de réhydratation. Ces étapes peuvent réduire la fluorescence globale des colorants (une limitation mentionnée dans la fiche technique du PKH26). Par conséquent, d’autres procédures, telles que le sectionnement congelé, peuvent être plus appropriées pour la visualisation EV par microscopie confocale.

1. Incorporez les tissus fixes dans des blocs de paraffine. Coupez le tissu en sections de 6 μm d’épaisseur.
2. Déparaffiniser les sections tissulaires.
   REMARQUE: Toutes les étapes utilisant du xylène doivent être effectuées dans une hotte.
   1. Immerger les coupes de tissus dans du xylène pendant 30 min, 100% d’éthanol pendant 2 min, 96% d’éthanol pendant 2 min, 75% d’éthanol pendant 1 min, et enfin dans de l’eau distillée pendant 30 s.
3. Perméabiliser les coupes tissulaires.
   1. Préparer une solution de citrate de sodium à 0,1 % de Triton-0,1 % pour perméabiliser le tissu. Ajouter une goutte de 20 μL à chaque section de tissu et incuber pendant 10 min à température ambiante. Lavez chaque section deux fois avec 20 μL de PBS.
4. Sur une lame microscopique, ajouter une goutte de milieu de montage contenant du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) avec un milieu de montage aqueux pour préserver la fluorescence. Couvrez la lame contenant 3 coupes de tissu de l’étape 6.3.1.
5. Incuber les toboggans pendant la nuit à température ambiante, à l’abri de la lumière.
6. Conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à la microscopie confocale.

Une vue d’ensemble schématique de l’étiquetage des véhicules électriques et de la surveillance de l’absorption est illustrée à la figure 1. La concentration de particules et la taille des VE détectées par la NTA dans le tableau 1 montrent que la concentration de VE diminue au cours du processus en raison de l’étape de purification effectuée deux fois après l’étiquetage avec la colonne. Cependant, la quantité obtenue se situe dans la plage optimale du nombre de particules à utiliser pour le traitement. Cette concentration de particules est utilisée pour calculer le volume de PKH-PL-EV et le contrôle qui sont utilisés pour traiter les explants de cartilage arthrosique.

Une fois que les explants cartilagineux sont traités avec des VE ou le groupe témoin, ils sont fixés pour différentes périodes: 0, 1, 2, 3, 4 et 5 h. Chaque groupe est ensuite paraffinisé, tranché et préparé pour la microscopie confocale avec un support de montage contenant du DAPI. Des images représentatives pour chaque groupe à chaque point temporel sont présentées à la figure 2, montrant comment les VE pénètrent dans le tissu jusqu’à ce qu’ils atteignent les chondrocytes et y pénètrent au fil du temps.

Comme le montre la figure 2,les VE marqués sont déjà localisés autour des chondrocytes (représentés en bleu avec coloration DAPI) après 1 h d’incubation (en rouge avec le colorant PKH26). Un certain fond dû aux restes de colorant peut être observé pour le groupe témoin, qui n’a pas de VE mais qui est traité selon le même protocole que l’échantillon EV. Ces résultats confirment le succès du protocole d’étiquetage des VE, qui peut être utilisé pour surveiller leur migration à travers les tissus dans des essais in vitro, comme indiqué ici, et dans des expériences in vivo.

Figure 1: Vue d’ensemble schématique du protocole d’étiquetage et de surveillance de l’adoption des VÉHICULES. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate; EV = vésicule extracellulaire; RT = température ambiante; BSA = albumine sérique bovine; NTA = analyse de suivi des nanoparticules; OA = arthrose; TNFα = facteur de nécrose tumorale-alpha; PL = lysat plaquettaire; PFA = paraformaldéhyde; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Images représentatives de l’absorption des VE à différents moments. Images confocales représentatives prises après 0, 1, 2, 3, 4 et 5 h d’explantations de cartilage arthrosique incubées avec des VE marqués PKH ou avec un groupe témoin. Les images ont été prises à 400x. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : OA = arthrose; PL = lysat plaquettaire; EV = vésicule extracellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Caractérisation par analyse de suivi des nanoparticules. Abréviations : OA = arthrose; PL = lysat plaquettaire; EV = vésicule extracellulaire; NTA = analyse de suivi des nanoparticules.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.