Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les vésicules extracellulaires dérivées du lysat plaquettaire afin de surveiller leur migration et leur absorption dans les explants cartilagineux utilisés comme modèle pour l’arthrose.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont utilisées dans différentes études pour prouver leur potentiel en tant que traitement sans cellules en raison de leur cargaison dérivée de leur source cellulaire, comme le lysat plaquettaire (PL). Lorsqu’ils sont utilisés comme traitement, on s’attend à ce que les VE pénètrent dans les cellules cibles et y répondent. Dans cette recherche, les VE dérivés de PL ont été étudiés comme traitement sans cellules pour l’arthrose (OA). Ainsi, une méthode a été mise en place pour étiqueter les VE et tester leur absorption sur les explants cartilagineux. Les VE dérivés de PL sont marqués avec le colorant lipophile PKH26, lavés deux fois à travers une colonne, puis testés dans un modèle d’arthrose in vitro induit par l’inflammation pendant 5 h après quantification des particules par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Toutes les heures, les explants de cartilage sont fixés, paraffinés, coupés en sections de 6 μm pour être montés sur des lames et observés au microscope confocal. Cela permet de vérifier si les VE pénètrent dans les cellules cibles (chondrocytes) pendant cette période et d’analyser leur effet direct.

Introduction

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative articulaire qui implique une inflammation progressive et irréversible et la destruction de la matrice extracellulaire du cartilage articulaire¹. Bien que diverses formes d’arthrite aient de nombreux traitements^2,3,4, ceux-ci sont limités par leurs effets secondaires et leur efficacité limitée. Les techniques d’ingénierie tissulaire utilisant l’implantation de chondrocytes autologues sont couramment appliquées pour le traitement régénératif du cartilage blessé dans les lésions cartilagineuses précoces

Protocole

NOTE: Les explants de cartilage ont été obtenus auprès de la biobanque IdISBa (IB 1995/12 BIO) conformément aux directives institutionnelles après approbation éthique du projet par le CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Préparation des colonnes

1. Équilibrez les colonnes en suivant les instructions du fabricant ou comme suit :
   1. Retirez le capuchon de colonne et équilibrez la colonne. Retirez le tampon de stockage par élution.
   2. Lavez la colonne 3 fois avec 2,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lors de chaque lavage, attendez que la colonne absorbe tout le volume.
      REMARQUE: Ne laissez pas la colonne sécher.....

Résultats

Une vue d’ensemble schématique de l’étiquetage des véhicules électriques et de la surveillance de l’absorption est illustrée à la figure 1. La concentration de particules et la taille des VE détectées par la NTA dans le tableau 1 montrent que la concentration de VE diminue au cours du processus en raison de l’étape de purification effectuée deux fois après l’étiquetage avec la colonne. Cependant, la quantité obtenue se situe dans la plage optimale du nombre de particules à u.......

Discussion

L’imagerie des VE aide à comprendre les propriétés des VE, telles que leurs mécanismes de libération et d’absorption. Leur imagerie permet le suivi de leur biodistribution et la caractérisation de leurs propriétés pharmacocinétiques en tant que véhicules médicamenteux. Cependant, l’imagerie et le suivi des VE peuvent être difficiles en raison de leur petite taille, bien que de nombreux dispositifs d’imagerie et techniques d’étiquetage aient été développés pour aider les chercheurs à surveiller les VE dans des conditions .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Material
1.5 mL Tube à centrifuger	SPL life sciences	PLC60015
1 mL Seringue BD Plastipak	BD	303174
2-Propanol (Isopropanol)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	Préparé à 20 % avec de l’eau Milli-Q
Plaque de culture à 96 puits	SPL life sciences
Éthanol absolu Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	Utilisé pour préparer de l’éthanol à 96 % et 75 % avec de l’eau Milli-Q
Biopsie Punch avec piston 3 mm	Scandidact	MTP-33-32
Sérum bovin  ; Albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Préparé à 5 % avec
des explants de cartilage	IdISBa Biobank
Tube de concentration 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
Tube de concentration 500 µ ; L Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
Verre de couverture 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium	Biowest	L0092
Dulbecco’s PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Blocs de tissu de paraffine intégrés	IdISBa Biobank		Rémunération à l’acte
Colonnes mini-HD exo-spin	Systèmes de guidage cellulaire	EX05
Feather S35 Microtome Blade	Feather	43037
Filtropur S 0.2 µ ; m filtre à seringue	Sarstedt	83.1826.001
Fluoroshield avec DAPI	Sigma-Aldrich	F-6057
Oncostatin M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	Préparer une solution mère à une concentration finale de 0,1 & micro ; g/µ ; L dilué dans PBS-0,1 % BSA
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	8.18715.1000	Préparé à 4 % avec PBS et stocké à 4 ° ; C
Pénicilline-Streptomycine Solution 100x	Biowest	L0022
PKH26 Kit de liaison cellulaire fluorescente rouge pour le marquage général de la membrane cellulaire	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 et Dliuent C inclus
Citrate de sodium dihydraté	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus Lames de microscope	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNFet alpha ;	R& D systems	210-TA-005	Préparer une solution mère à une concentration finale de 0,01 & micro ; g/µ ; L dilué dans PBS-0,1 % BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Utilisé pour préparer une solution de citrate de sodium à 0,1 % Triton-0,1 % avec de l’eau Milli-Q
Xylene	Scharlab	XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11
rotor NanoSight NS300	Malvern	NS300	Dispositif avec laser intégré à &lambda ;= 532 nm et caméra sCMOS
Shandon Finesse 325 Microtome manuel	Thermo Scientific&trade ;
Microscope confocal TCS-SPE	Leica Microsystems	5200000271

PLC30096 PBS A78100101