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Article de méthode

Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

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DOI :

10.3791/62780

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4 octobre 2021

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1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d'Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS), Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les vésicules extracellulaires dérivées du lysat plaquettaire afin de surveiller leur migration et leur absorption dans les explants cartilagineux utilisés comme modèle pour l’arthrose.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont utilisées dans différentes études pour prouver leur potentiel en tant que traitement sans cellules en raison de leur cargaison dérivée de leur source cellulaire, comme le lysat plaquettaire (PL). Lorsqu’ils sont utilisés comme traitement, on s’attend à ce que les VE pénètrent dans les cellules cibles et y répondent. Dans cette recherche, les VE dérivés de PL ont été étudiés comme traitement sans cellules pour l’arthrose (OA). Ainsi, une méthode a été mise en place pour étiqueter les VE et tester leur absorption sur les explants cartilagineux. Les VE dérivés de PL sont marqués avec le colorant lipophile PKH26, lavés deux fois à travers une colonne, puis testés dans un modèle d’arthrose in vitro induit par l’inflammation pendant 5 h après quantification des particules par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Toutes les heures, les explants de cartilage sont fixés, paraffinés, coupés en sections de 6 μm pour être montés sur des lames et observés au microscope confocal. Cela permet de vérifier si les VE pénètrent dans les cellules cibles (chondrocytes) pendant cette période et d’analyser leur effet direct.

Introduction

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative articulaire qui implique une inflammation progressive et irréversible et la destruction de la matrice extracellulaire du cartilage articulaire1. Bien que diverses formes d’arthrite aient de nombreux traitements2,3,4, ceux-ci sont limités par leurs effets secondaires et leur efficacité limitée. Les techniques d’ingénierie tissulaire utilisant l’implantation de chondrocytes autologues sont couramment appliquées pour le traitement régénératif du cartilage blessé dans les lésions cartilagineuses précocesde l’arthrose 4. Les thérapies cellulaires sont limitées principalement en raison du nombre limité de chondrocytes phénotypiquement stables ou de chondroprogenitors capables de réparer efficacement le cartilage3. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir la progression de la maladie et régénérer les grandes lésions cartilagineuses est d’une importance capitale.

Les vésicules extracellulaires (VE) ont été suggérées comme traitement de l’arthrose par différents auteurs5,6. Les VE sont des corps membraneux sécrétés par la majorité des types de cellules, sont impliqués dans la signalisation intercellulaire et il a été démontré qu’ils exercent les effets thérapeutiques des cellules souches7,8,9, en raison desquels ils ont récemment suscité un intérêt pour la médecine régénérative10. Les VE dérivés de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont les principaux VE thérapeutiques étudiés pour l’arthrose, bien que d’autres cellules liées aux articulations aient été utilisées comme sources de VE, par exemple, les chondroprogeniteurs ou les cellules immunitaires11,12.

Les concentrés de plaquettes, tels que les lysats plaquettaires (PL), sont utilisés pour améliorer la cicatrisation des plaies dans différentes blessures, telles que les ulcères cornéens13,14,15 ou dans la régénération du tissu tendineux16, en raison de l’hypothèse que le composant EV des concentrés plaquettaires peut être responsable de ces effets17 . Certaines études liées aux maladies articulaires utilisent des VE d’origine plaquettaire (PL-VE) comme traitement pour améliorer les conditions arthrosiques. Les PL-EV améliorent la prolifération des chondrocytes et la migration cellulaire en activant la voie Wnt/β-caténine18,favorisant l’expression de marqueurs chondrogènes dans les chondrocytes arthrosiques19,ou montrant des niveaux plus élevés de protéines chondrogènes et moins d’anomalies tissulaires chez les lapins arthrosiques traités par PL-VE18.

Les VE contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques qui sont libérés dans la cellule cible, établissant une communication de cellule à cellule, qui est la principale caractéristique liée à leurs applications thérapeutiques20. Les effets des véhicules électriques dépendent de leurs cellules d’atteinte et du rejet ultérieur de la cargaison. Cet effet peut être confirmé indirectement par des changements causés dans les cellules, tels que l’activité métabolique ou la modification de l’expression des gènes. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de visualiser comment les VE atteignent les cellules pour exercer leur fonction. Ainsi, cet article présente une méthode pour étiqueter ces VE dérivés de PL à utiliser comme traitement pour les explants de cartilage OA induits par l’inflammation. La microscopie confocale a été utilisée pour surveiller l’absorption et la progression de la VE vers les chondrocytes présents dans les explants en un laps de temps de 5 h.

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Protocole

NOTE: Les explants de cartilage ont été obtenus auprès de la biobanque IdISBa (IB 1995/12 BIO) conformément aux directives institutionnelles après approbation éthique du projet par le CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Préparation des colonnes

  1. Équilibrez les colonnes en suivant les instructions du fabricant ou comme suit :
    1. Retirez le capuchon de colonne et équilibrez la colonne. Retirez le tampon de stockage par élution.
    2. Lavez la colonne 3 fois avec 2,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lors de chaque lavage, attendez que la colonne absorbe tout le volume.
      REMARQUE: Ne laissez pas la colonne sécher.
    3. Couvrir la colonne avec le bouchon après le dernier lavage et jusqu’à la préparation de l’échantillon.

2. Étiquetage des véhicules électriques

REMARQUE: Ce protocole d’étiquetage EV utilise un échantillon PL-EV précédemment isolé par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec des conditions précédemmentdécrites21,22. Cependant, tout échantillon EV provenant de n’importe quelle source peut être utilisé avec ce protocole.

  1. Concentrez l’échantillon EV et le contrôle (PBS) à l’aide d’un tube de concentration.
    1. Placez les échantillons dans un tube de concentration de 15 mL ou 500 μL, selon le volume de départ de l’échantillon EV de départ. Centrifugez les tubes selon les instructions du fabricant jusqu’à l’obtention d’un échantillon presque sec.
      REMARQUE: L’échantillon de contrôle est nécessaire pour vérifier tout fond de colorant. Bien que cette méthode ne nécessite aucun volume initial spécifique, il faut considérer qu’environ 10% des particules seront perdues lors des étapes de purification.
  2. Remettre en suspension les échantillons concentrés avec le diluant C. Remettre en suspension les échantillons EV avec 200 μL et le groupe témoin avec 100 μL et les transférer dans de nouveaux tubes centrifuges de 1,5 mL.
  3. Séparer l’échantillon EV en deux aliquotes de 100 μL. Marquez-en un avec un colorant et utilisez-le comme traitement (PKH-PL-EV); laissez l’autre non marqué, mais traitez-le (NTA-PL-EV) comme l’échantillon de VE et utilisez-le pour quantifier la concentration de VE par NTA.
  4. Préparer 2x solution de colorant, résultant en une solution de PKH26 de 8 μM dans le diluant C.
  5. Mélanger 1 μL de 1 mM de liant PKH26 par 125 μL de diluant C dans l’échantillon. Préparez un volume à ajouter aux échantillons dans un rapport de 1:1.
  6. Ajouter 2x solution de colorant à PKH-PL-EV et contrôler les échantillons dans un rapport de 1:1 pour obtenir une concentration de colorant de 1x et une concentration de PKH26 de 4 μM. Ajoutez le même volume de PBS à l’échantillon NTA-PL-EV. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  7. Ajouter la solution d’albumine-PBS sérique bovine à 5 % aux échantillons dans un rapport de 1:1 et s’assurer que le volume final est d’environ 400 μL.
    REMARQUE: Cette étape permet d’éliminer les interactions de colorant non spécifiques ou de colorant non lié.
  8. Procédez à la séparation des VÉHICULES étiquetés du colorant non lié et des interactions non spécifiques du colorant avec la colonne.

3. Isolation des véhicules électriques étiquetés

  1. Retirez le bouchon de la colonne, ajoutez 400 μL de l’échantillon (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV ou témoin) et jetez tout liquide élué.
  2. Attendez que l’exemple entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 μL de PBS et jeter tout le liquide élué.
  3. Attendez que le PBS entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 μL de PBS et recueillir une fraction de 600 μL dans un 1,5. Tube de centrifugeuse mL (VE ou contrôle).
    REMARQUE: Ces étapes sont nécessaires pour éliminer l’excès de colorant des échantillons. Une autre séparation par colonne est nécessaire pour obtenir des VÉHICULES plus purs. Ainsi, les étapes suivantes doivent être effectuées dans une nouvelle colonne équilibrée (étape 4.1.) ou dans la même colonne après une étape de lavage initiale (étape 4.2).
  4. Préparez la colonne pour une nouvelle étape de séparation des VE afin d’obtenir des VE plus purs. S’il s’agit d’une nouvelle colonne, répétez les étapes 2.1. et 2.2. S’il s’agit de la même colonne, lavez la colonne avec 2,5 mL d’isopropanol à 20 %, puis répétez les étapes 2.1 et 2.2.
  5. Ajouter 600 μL de VÉHICULES électriques préalablement élués obtenus à l’étape 2.5 à la colonne et jeter le volume élué. Attendez que le liquide pénètre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.
  6. Ajouter 400 μL de PBS et jeter tout le volume élué. Attendez que le liquide pénètre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.
  7. Ajouter 600 μL de PBS et recueillir une fraction de 600 μL dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Utilisez les véhicules électriques et les échantillons de contrôle pour d’autres analyses ou stockez-les pendant la nuit à 4 oC.
  8. Stockez les colonnes utilisées pour une utilisation ultérieure.
    1. Laver la colonne avec 25 mL d’isopropanol à 20 % et jeter le volume élué. Lavez la colonne 3 fois avec 2,5 mL de PBS.
    2. Ajoutez la mémoire tampon de stockage supprimée à l’étape 1.1.1 et attendez que la mémoire tampon entre dans la colonne. Couvrir la colonne avec le bouchon et conserver à 4 oC jusqu’à utilisation ultérieure.

4. Quantification des VE

  1. Préparer les dilutions 1:1 000 de l’échantillon NTA-PL-EV et de l’échantillon PL-EV initial comme décrit dans les deux étapes suivantes.
    1. Préparer 1 mL de NTA-PL-EV dilué à 1:10 et 1 mL de PL-EV initial dilué à 1:10 avec du PBS filtré à travers un filtre de 0,2 μm.
    2. Préparer 1 mL d’une dilution à 1:100 des échantillons dilués précédents avec du PBS filtré à travers un filtre de 0,2 μm.
  2. Injecter l’échantillon NTA-PL-EV dilué au 1:1 000 ou l’échantillon PL-EV initial à l’aide d’une seringue stérile dans la pompe NTA. Suivez les instructions et les recommandations du fabricant pour la détermination de la concentration des particules et de la distribution granulométrique.
    REMARQUE: Comme la concentration de VE dépend du volume de démarrage de l’échantillon, il peut être nécessaire de lire les dilutions intermédiaires et de faire des ajustements pour obtenir une détermination correcte de la NTA.

5. Ve électriques utilisés comme traitement de l’arthrose induite par l’inflammation

  1. Lavez le cartilage deux fois avec du PBS et excisez-le à l’aide d’un poinçon de biopsie de 3 mm de diamètre dans des conditions stériles.
    REMARQUE: Effectuez la procédure des étapes 5.1 à 5.6 dans une culture cellulaire.
  2. Placer les explantes dans des plaques de culture de 96 puits avec un milieu DMEM-F12 complété par 1% de pénicilline-streptomycine à 37 oC, 5% de CO2et 80% d’humidité.
    1. Pour établir un modèle d’arthrose induite par l’inflammation, complétez le milieu de culture cellulaire avec 10 ng / mL d’oncostatine M et 2 ng / mL de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα).
  3. Traiter les explants avec 1 × 109 particules/puits de VE marqués (PKH-PL-EV) ou contrôler dans un milieu de culture cellulaire complété par de l’oncostatine M et du TNFα.
    REMARQUE: Mesurer le volume de l’échantillon contenant 1 × 109 particules / puits et utiliser le même volume pour le contrôle.
  4. Retirez le milieu des plaques de culture cellulaire à 96 puits contenant des explants de cartilage. Ajouter 200 μL du milieu de culture cellulaire décrit à l’étape 5.3 à chaque puits.
    REMARQUE: Si les plaques de 96 puits ont été en contact avec du sérum bovin fœtal (FBS), lavez chaque puits trois fois avec 200 μL de PBS pour retirer tout VE du FBS.
  5. Arrêtez le test in vitro à différents moments: 0, 1, 2, 3, 4 et 5 h.
  6. Lavez deux fois les puits de culture cellulaire contenant les explantations cartilagineuses avec 200 μL de PBS.
  7. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans le tissu pour le fixer pendant 3 h à 4 oC.
    REMARQUE : Les étapes impliquant des PFA doivent être effectuées dans une hotte aspirante conformément aux recommandations de la fiche de données de sécurité.
  8. Retirer le PFA, ajouter 100 μL de PBS, conserver le tissu fixe à 4 °C et traiter les échantillons dans les 48 h.

6. Préparation et visualisation de la microscopie

REMARQUE: Cette procédure histologique consiste en des étapes de déshydratation, d’incorporation de paraffine et de réhydratation. Ces étapes peuvent réduire la fluorescence globale des colorants (une limitation mentionnée dans la fiche technique du PKH26). Par conséquent, d’autres procédures, telles que le sectionnement congelé, peuvent être plus appropriées pour la visualisation EV par microscopie confocale.

  1. Incorporez les tissus fixes dans des blocs de paraffine. Coupez le tissu en sections de 6 μm d’épaisseur.
  2. Déparaffiniser les sections tissulaires.
    REMARQUE: Toutes les étapes utilisant du xylène doivent être effectuées dans une hotte.
    1. Immerger les coupes de tissus dans du xylène pendant 30 min, 100% d’éthanol pendant 2 min, 96% d’éthanol pendant 2 min, 75% d’éthanol pendant 1 min, et enfin dans de l’eau distillée pendant 30 s.
  3. Perméabiliser les coupes tissulaires.
    1. Préparer une solution de citrate de sodium à 0,1 % de Triton-0,1 % pour perméabiliser le tissu. Ajouter une goutte de 20 μL à chaque section de tissu et incuber pendant 10 min à température ambiante. Lavez chaque section deux fois avec 20 μL de PBS.
  4. Sur une lame microscopique, ajouter une goutte de milieu de montage contenant du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) avec un milieu de montage aqueux pour préserver la fluorescence. Couvrez la lame contenant 3 coupes de tissu de l’étape 6.3.1.
  5. Incuber les toboggans pendant la nuit à température ambiante, à l’abri de la lumière.
  6. Conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à la microscopie confocale.

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Résultats

Une vue d’ensemble schématique de l’étiquetage des véhicules électriques et de la surveillance de l’absorption est illustrée à la figure 1. La concentration de particules et la taille des VE détectées par la NTA dans le tableau 1 montrent que la concentration de VE diminue au cours du processus en raison de l’étape de purification effectuée deux fois après l’étiquetage avec la colonne. Cependant, la quantité obtenue se situe dans la plage optimale du nombre de particules à u...

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Discussion

L’imagerie des VE aide à comprendre les propriétés des VE, telles que leurs mécanismes de libération et d’absorption. Leur imagerie permet le suivi de leur biodistribution et la caractérisation de leurs propriétés pharmacocinétiques en tant que véhicules médicamenteux. Cependant, l’imagerie et le suivi des VE peuvent être difficiles en raison de leur petite taille, bien que de nombreux dispositifs d’imagerie et techniques d’étiquetage aient été développés pour aider les chercheurs à surveiller les VE dans des conditions ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par l’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinancée par le Fonds social européen du FSE et le Fonds européen de développement régional du FEDER (MS16/00124; CP16/00124); par le PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financé par la taxe de tourisme durable des îles Baléares; par la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); par le programme postdoctoral FOLIUM (FOLIUM 17/01) dans le cadre du FUTURMed, financé à 50% par la taxe de tourisme durable des îles Baléares et à 50% par le FSE; et par la Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Material
1.5 mL Tube à centrifugerSPL life sciencesPLC60015
1 mL Seringue BD PlastipakBD303174
2-Propanol (Isopropanol)Panreac AppliChem1.310.901.211Préparé à 20 % avec de l’eau Milli-Q
Plaque de culture à 96 puitsSPL life sciences
Éthanol absolu PharmpurScharlabET0006005PUtilisé pour préparer de l’éthanol à 96 % et 75 % avec de l’eau Milli-Q
Biopsie Punch avec piston 3 mmScandidactMTP-33-32
Sérum bovin  ; Albumine (BSA)Sigma-AldrichA7030Préparé à 5 % avec
des explants de cartilageIdISBa Biobank
Tube de concentration 15 mL Nanosep 100 kD OmegaPallMCP100C41
Tube de concentration 500 µ ; L Nanosep 100 kD OmegaPallOD003C33
Verre de couverture 24 x 60 mmDeltalabD102460
DMEM-F12 -GlutaMAX mediumBiowestL0092
Dulbecco’s PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
Blocs de tissu de paraffine intégrésIdISBa BiobankRémunération à l’acte
Colonnes mini-HD exo-spinSystèmes de guidage cellulaireEX05
Feather S35 Microtome BladeFeather43037
Filtropur S 0.2 µ ; m filtre à seringueSarstedt83.1826.001
Fluoroshield avec DAPISigma-AldrichF-6057
Oncostatin M HumanSigma-AldrichO9635-10UGPréparer une solution mère à une concentration finale de 0,1 & micro ; g/µ ; L dilué dans PBS-0,1 % BSA
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich8.18715.1000Préparé à 4 % avec PBS et stocké à 4 ° ; C
Pénicilline-Streptomycine Solution 100xBiowestL0022
PKH26 Kit de liaison cellulaire fluorescente rouge pour le marquage général de la membrane cellulaireSigma-AldrichMINI26PKH26 et Dliuent C inclus
Citrate de sodium dihydratéScharlabSO019911000
Superfrost Plus Lames de microscopeThermo ScientificJ1800AMNZ
TNFet alpha ;R& D systems210-TA-005Préparer une solution mère à une concentration finale de 0,01 & micro ; g/µ ; L dilué dans PBS-0,1 % BSA
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Utilisé pour préparer une solution de citrate de sodium à 0,1 % Triton-0,1 % avec de l’eau Milli-Q
XyleneScharlabXI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11
rotor NanoSight NS300MalvernNS300Dispositif avec laser intégré à &lambda ;= 532 nm et caméra sCMOS
Shandon Finesse 325 Microtome manuelThermo Scientific&trade ;
Microscope confocal TCS-SPELeica Microsystems5200000271
PLC30096 PBS A78100101

Références

  1. Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
  2. Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
  3. Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
  4. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  5. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  6. Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
  8. Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
  9. Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
  10. Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
  11. D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).
  12. Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
  13. El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
  14. Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
  15. Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).
  16. Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).
  17. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
  18. Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).
  19. Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).
  20. Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
  21. Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).
  22. de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  23. Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
  24. Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
  25. Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).
  26. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).
  27. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029(2015).
  28. Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
  29. Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
  30. Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).
  31. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  32. Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
  33. Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
  34. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  36. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).
  37. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).

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Réimpressions et autorisations

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