Surveillance en temps réel de la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines

Le développement et la fonction corrects des lymphocytes T sont essentiels à la capacité du système immunitaire à reconnaître les antigènes et à y répondre. La phosphorylation oxydative mitochondriale (OxPhos) change en fonction de l’état de la cellule T. Les lymphocytes T naïfs utilisent principalement OxPhos pour produire de l’ATP, tandis que les lymphocytes T activés subissent une transition métabolique où la glycolyse devient ^dominante1. Après la phase effectrice, le petit sous-ensemble restant de lymphocytes T mémoire revient à un état métabolique dominé par ^OxPhos2,3. Les changements d’OxPhos suivent la différenciation des lymphocytes T à un tel degré que même des sous-ensembles de lymphocytes T peuvent être différenciés par leurs propriétés spécifiques d’OxPhos1. Inversement, OxPhos est important pour le fonctionnement des lymphocytes T, et il a été démontré que l’inhibition d’OxPhos bloque la prolifération et la production de cytokines des lymphocytes ^T4. Par conséquent, la capacité de quantifier les propriétés des lymphocytes T OxPhos de manière précise et reproductible est un outil puissant pour quiconque travaille avec des lymphocytes T.

Dans ce protocole, les propriétés des lymphocytes T OxPhos sont mesurées à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. La fonction principale de cet analyseur est de mesurer en continu la teneur en oxygène des milieux de croissance des cellules à analyser. L’oxygène retiré du milieu de croissance est supposé être absorbé par les cellules. En traitant les cellules avec une variété d’inhibiteurs ou de modificateurs d’OxPhos, une baisse de l’absorption d’oxygène est associée à la fonction inhibée ou modulée. Par exemple, l’inhibition de l’ATP synthase entraînera une réduction de l’absorption cellulaire de l’oxygène qui serait autrement utilisé pour produire de l’ATP par phosphorylation oxydative. D’autres équipements, y compris l’électrode Clark et l’instrument Oroboros, offrent des fonctionnalités similaires, et chaque instrument présente des avantages et des inconvénients différents. Un large éventail de types de cellules peut être utilisé pour des études dans ces dispositifs, mais un type de cellule particulièrement difficile est les lymphocytes T primaires ^humains5. En raison de leur petite taille, de leur faible survie ex vivo et de leurs propriétés non adhérentes, les cellules T primaires humaines peuvent être difficiles à étudier.

Il s’agit d’un protocole pour étudier la respiration mitochondriale des cellules T primaires humaines par un analyseur extracellulaire. Le protocole est divisé en une série d’optimisation, où les concentrations optimales du nombre de cellules par puits, ainsi que la concentration optimale d’olligomycine et de FCCP, sont déterminées. En outre, une exécution d’essai, où les conditions optimisées sont utilisées.

En utilisant des PBMC humains d’origine sanguine et des cultures de lymphocytes T primaires ex vivo , ce protocole démontre l’importance d’une concentration optimale d’inhibiteurs et la pertinence d’utiliser une injection séparée au lieu d’une injection séquentielle d’inhibiteurs mitochondriaux lorsque vous travaillez avec des types de cellules sensibles. Enfin, il est démontré que ce test peut détecter de manière robuste des différences subtiles dans la respiration mitochondriale lors de la polarisation avec les cytokines IL-2 et IL-15.

Les expériences ont été menées selon les directives de l’hôpital Herlev et de la région de la capitale du Danemark.

Remarque : Ce protocole contient des instructions pour une exécution d’optimisation et une exécution de tests. Il est clairement écrit dans le texte lorsque les instructions concernent une exécution d’optimisation ou une exécution de test. Exécuter une exécution d’optimisation avant de poursuivre les exécutions d’assay

1. Isolement mononucléaire du sang périphérique humain (PBMC) des pelages bouffants

1. Isolation PBMC
   1. Prélever les manteaux bouffants de l’établissement approprié (recueillis dans des poches de collecte de sang). Les manteaux Buffy proviennent de donneurs sains. Exclure les donneurs qui ont récemment utilisé des analgésiques.
   2. Vaporisez la poche de prélèvement sanguin contenant le manteau bouffant avec de l’éthanol à 70% avant de la transférer dans une armoire à flux laminaire. Utilisez toujours des techniques stériles et du matériel stérile pour toutes les étapes
      REMARQUE : S’assurer que les autorisations correctes pour la manipulation des échantillons de sang humain sont obtenues.
   3. Transférer le sang dans un tube de centrifugeuse stérile de 50 mL.
   4. Diluer le sang au moins 10% avec RPMI 1640 non supplémenté.
   5. Versez 20 mL du milieu de gradient de densité préféré dans un tube de centrifugeuse de 50 mL.
   6. Aspirer 25 mL du sang dilué dans une pipette sérologique. Réglez le contrôleur de pipette électrique à la vitesse la plus basse.
   7. Maintenez le tube avec un milieu de gradient de densité à un angle de 45° et posez la pointe de la pipette sérologique sur la face interne du tube de centrifugeuse de 50 mL. Libérer lentement 25 mL de sang dilué de la pipette sérologique.
   8. Assurez-vous que le sang dilué et le milieu de gradient de densité ne se mélangent pas. Assurez-vous que le sang dilué repose sur le milieu de gradient de densité.
   9. Répétez cette opération avec les tubes de milieu à gradient de densité suivants jusqu’à ce que tout le sang dilué soit traité.
   10. Déplacez soigneusement les tubes vers une centrifugeuse et centrifugez à 1000 x g pendant 30 min dans un rotor oscillant à température ambiante (RT). Assurez-vous que l’accélération et la pause sont au minimum.
       REMARQUE: Après la centrifugation, différentes couches doivent être visibles. La couche supérieure, rose à orange claire, se compose du plasma sanguin et des plaquettes. La couche blanche moyenne se compose des PBMC suivis d’une couche claire qui se compose du milieu de gradient de densité, et enfin d’une couche rouge foncé au fond avec des globules rouges.
   11. À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, aspirer soigneusement la couche blanche contenant du PBMC dans un tube de centrifugeuse de 50 mL.
       REMARQUE: Assurez-vous de ne pas transférer le milieu de gradient de densité car cela affectera la purification en aval. L’excès de plasma n’affectera pas les résultats.
   12. Regroupez tous les PBMC collectés dans le même tube de centrifugeuse de 50 mL et rechargez jusqu’à 50 mL avec RPMI 1640.
   13. Centrifugez les cellules à 500 x g pendant 5 min à TA (effectuez les étapes de centrifugation restantes à ce réglage, sauf indication contraire).
   14. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 30 mL de RPMI 1640. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
   15. Pour la cryoconservation, remettre en suspension un maximum de 30 millions de cellules par 1 mL de milieu de congélation.
   16. Transférer les cellules dans des cryotubes et congeler jusqu’à -80 °C à l’aide d’un récipient de congélation à vitesse contrôlée (-1 °C par minute). Pour un stockage à long terme, déplacez les PBMC à -140 °C.
       REMARQUE: Limitez la durée pendant laquelle les cellules sont dans le milieu de congélation à RT. À RT, le DMSO est très toxique pour les cellules.

2. Culture de lymphocytes T primaires humains activés

1. Décongélation des cellules (Jour 1)
   1. Préchauffer 10 mL de RPMI 1640 par échantillon à environ 37 °C.
   2. Prenez le nombre souhaité d’ampoules cellulaires et stockez-les temporairement sur de la glace carbonique.
   3. Remettre en suspension les cellules congelées dans 10 mL de RPMI 1640 préchauffé.
   4. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g à TA.
   5. Jeter le surnageant et laver à nouveau les cellules en les remettant en suspension dans 10 mL de RPMI 1640 et en centrifugeuse comme décrit au point 2.1.4.
   6. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules à 2 x ¹⁰⁶ cellules par mL de milieu X-VIVO 15 + 5% de sérum humain (ci-après : milieu cellulaire T).
   7. Plaque 2 mL des cellules par puits dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits et incuber pendant la nuit à 37 °C et 5 % de _CO2.
2. Activation des cellules (Jour 0)
   1. Laver les billes CD3/CD28 en transférant 12,5 μL de billes par 1 million de cellules dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 12,5 μL de PBS par 12,5 μL de billes.
      REMARQUE: Il est important de vortexer le flacon de perles avant utilisation.
   2. Placez le tube de microcentrifugation sur un aimant approprié pendant 1 min.
   3. Jeter le tampon et remettre les billes en suspension dans le volume d’origine du milieu cellulaire T (12,5 μL de milieu cellulaire T pour 12,5 μL du volume original de perles).
   4. Ajouter 12,5 μL de billes par million de cellules correspondant à un rapport de 1:2 (perles : cellules).
   5. Divisez les cellules en deux conditions avec environ 5 millions de cellules dans chacune.
   6. Ajouter le volume correct de cytokines aux conditions mentionnées dans le tableau 1.
   7. Incuber les cellules pendant 3 jours à 37 °C et 5 % de _CO2.
3. Culture de cellules (Jours 3 et 5)
   1. Resuspendez les cellules et divisez-les en transférant la moitié du volume de chaque puits dans un nouveau puits. Ajouter le même volume de milieu cellulaire T frais à chaque puits.
   2. Ajouter de nouvelles cytokines à chaque condition comme mentionné dans le tableau 1.

3. Test de flux extracellulaire

1. Hydratation de la cartouche du capteur (Jour 0)
   1. Déballez la cartouche du capteur et retirez-la soigneusement de la plaque de l’utilitaire.
   2. Placez la cartouche du capteur à l’envers, en prenant soin de ne pas toucher les sondes du capteur.
   3. Remplissez la plaque utilitaire avec 200 μL d’étrier (voir la table des matériaux pour plus de détails) et replacez soigneusement la cartouche du capteur dans la plaque utilitaire.
   4. Alternativement, pour éliminer toute formation de bulles, incuber la cartouche du capteur dans de l’eau ultrapure stérile pendant la nuit et remplacez-la par un calibrant préchauffé le matin du test.
   5. Incuber la plaque de la cartouche du capteur à 37 °C dans une armoire chauffante non régulée au _CO2 pendant la nuit.
      REMARQUE: Il est très important d’utiliser une armoire non régulée en _CO2 car un excès de _CO2 influencera la cartouche du capteur. Assurez-vous que l’analyseur de flux (voir tableau des matériaux pour plus de détails) est allumé au moins un jour avant utilisation pour lui permettre de se réchauffer à 37 °C.
2. Revêtement cellulaire et préparation d’inhibiteurs mitochondriaux (Jour 1)
   1. Préparer une solution de revêtement (voir tableau des matériaux) contenant du NaHCO3 (pH 8,3, 0,1 M, 1128 μL), du Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) et du NaOH (1,0 M, 24 μL).
      REMARQUE: La solution de revêtement doit toujours être faite et utilisée fraîche.
   2. Ouvrez une plaque de culture cellulaire XF fraîche et ajoutez 12 μL de la solution de revêtement fraîchement préparée à chaque puits. Assurer une distribution uniforme de la solution de revêtement dans le fond de tous les puits.
   3. Incuber la plaque à RT avec le couvercle pendant 30 min et jeter la solution liquide restante de tous les puits.
   4. Lavez la plaque avec 200 μL d’eau stérile et jetez le liquide.
   5. Lavez la plaque avec 200 μL de PBS stérile de qualité de culture cellulaire et jetez le liquide.
   6. Laissez la plaque à TA et laissez-la sécher pendant au moins 30 min.
3. Cellules T de la plaque dans la plaque de culture cellulaire XF (Jour 1)
   1. Préparer 50 mL de milieux d’essai en mélangeant des milieux XF RPMI appropriés avec du glucose, du pyruvate et de la glutamine selon la configuration expérimentale (niveaux recommandés : 4 mM de glucose, 1 mM de pyruvate et 3 mM de glutamine).
   2. Chauffer à 37 °C dans un incubateur _non corégulé et fixer le pH à 7,4. S’assurer qu’il y a suffisamment de milieu pour le placage des cellules et la préparation des solutions d’oligomycine et de FCCP (rubrique 3.4).
   3. Concevez une disposition de plaque avec un nombre croissant de cellules par puits pour l’exécution de l’optimisation ou de l’essai. Utilisez quatre puits 4, remplis de milieux et injectés de milieux, pour les mesures de fond.
   4. Compter les lymphocytes T préparés à la section 2.3 (selon la méthode préférée) et pipeter le nombre correct de cellules dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire XF recouverte de la solution de revêtement, selon la disposition de la plaque.
      REMARQUE: Le volume final de chaque puits peut varier, mais doit être suffisant pour couvrir le fond du puits.
   5. Centrifugez la plaque de culture cellulaire XF à 1000 x g à RT pendant 10 min pour faire adhérer la cellule T à la surface revêtue.
   6. Lavez les cellules avec 200 μL de milieu d’essai, jetez-les et ajoutez 180 μL de milieu d’essai.
      REMARQUE: Inspectez visuellement les puits à l’aide d’un microscope à lumière inversée pour vous assurer que les cellules sont attachées et réparties uniformément sur la surface du puits.
   7. Incuber la plaque de culture cellulaire XF dans l’armoire chauffante non régulée au _CO2 pendant 30 minutes pour s’assurer que la température de la plaque est de 37 °C.
4. Chargement de la cartouche de capteur avec oligomycine et FCCP pour l’optimisation (Jour 1)
   REMARQUE : Si les concentrations d’oligomycine et de FCCP étaient déjà optimisées, continuer à la rubrique 3.5.
   1. Préparer des solutions de travail d’oligomycine et de FCCP dans des milieux d’essai (préparés à l’étape 3.3.1) comme décrit aux étapes 3.4.2 et 3.4.3.
   2. Solutions de travail à l’oligomycine : préparer une solution de 5 μM (2 mL de milieu d’essai + 10 μL de 1 mM de stock d’oligomycine) et une solution de 3 μM (8 mL de milieu d’essai + 24 μL de 1 mM de stock d’oligomycine).
   3. Solution de travail FCCP : Préparer une solution de 2 μM (2 mL de milieu d’essai + 13,2 μL de 300 μM de papier FCCP) et une solution de 1,3 μM (8 ml de milieu d’essai + 34,6 μL de 300 μM de papier FCCP)
   4. Chargez les solutions de travail d’oligomycine ou de FCCP dans les orifices d’injection de la cartouche du capteur (tableau 2).
      NOTE. Il est important qu’aucun orifice d’injection ne contienne uniquement de l’air. Si, pour une raison quelconque, tous les ports d’injection ne sont pas utilisés, les ports vides doivent être remplis de supports de dosage.
   5. Frappez doucement les bords de la plaque sur la table pour éliminer les bulles potentielles dans les orifices d’injection.
5. Cartouche de capteur de chargement avec oligomycine, FCCP et antimycine A pour l’exécution du test (Jour 1)
   1. Préparer des solutions d’oligomycine, FCCP dans des milieux d’essai (préparés à l’étape 3.3.1) en fonction des concentrations optimales identifiées lors d’une précédente exécution d’optimisation. Préparez également une solution d’antimycine A de 20 μM.
   2. Chargez 20 μL d’oligomycine ou de FCCP dans l’orifice d’injection A de la cartouche du capteur selon la disposition de la plaque. Ajouter 22 μL de 20 μM d’antimycine A au port d’injection B de tous les puits. La concentration résultante d’antimycine A une fois injectée dans le puits sera de 2 μM.
6. Configuration d’un protocole expérimental dans le logiciel d’analyse de flux.
   1. Affectez les groupes et la carte de plaque pour chaque condition par disposition de plaque.
   2. Concevoir le protocole en fonction de la stratégie d’injection (tableau 3 et figure 1).
      REMARQUE: Lors de l’exécution d’Assay, les injections C et D peuvent être omises.
   3. Enregistrez la configuration du test, remplissez les informations requises pour être inclus pour le test et appuyez sur Démarrer.
   4. L’analyseur de flux demandera la cartouche de capteur préparée à la section 3.5. Retirez le couvercle et insérez la cartouche du capteur selon les instructions de l’analyseur.
      REMARQUE: Le test étalonnera et vérifiera les capteurs indiqués par des coches. Après un étalonnage réussi, l’analyseur demandera la plaque de culture cellulaire XF préparée à la section 3.3. La plaque utilitaire est éjectée de l’analyseur et remplacée par la plaque de culture cellulaire XF pour démarrer le test.

Une détermination correcte des propriétés d’OxPhos est un outil indispensable lors de l’étude des lymphocytes T. Toutefois, si les conditions d’essai n’ont pas été optimisées, il existe un risque important de résultats trompeurs ou erronés. Dans ce protocole, l’accent est mis sur l’optimisation du nombre de cellules par puits et des concentrations d’oligomycine et de FCCP à utiliser. Dans la configuration décrite, l’oligomycine et le FCCP sont ajoutés progressivement au même puits, ce qui augmente la concentration des modulateurs mitochondriaux. La concentration optimale d’olligomycine et de FCCP peut être déterminée à partir des courbes OCR résultantes des puits ainsi que de la concentration où un plateau est atteint.

Dans la course représentative, l’oligomycine est ajoutée dans une concentration croissante et inhibe l’ATP synthase (complexe V de la chaîne de transport d’électrons), entraînant une diminution de la respiration mitochondriale. Un plateau en OCR est atteint après que la concentration accumulative des puits a atteint 1 μM. À partir de cette concentration et de l’augmentation des concentrations, l’OCR n’a pas été réduite davantage (figure 1A). Pour les puits traités avec une concentration incrémentielle du fccP découpleur, les niveaux d’OCR ont augmenté comme prévu jusqu’à atteindre un plateau après l’ajout de 0,2 μM de FCCP, ce qui indique qu’à cette concentration, un découplage complet a été obtenu (figure 1B). Une optimisation des cellules plaquées par puits est importante pour un dosage correct et reproductible. Si le nombre de cellules utilisées est trop faible, le niveau d’oxygène retiré du milieu d’essai par les cellules est trop faible pour être correctement mesuré par l’analyseur. D’autre part, si le nombre de cellules par puits est trop élevé, la consommation d’oxygène des cellules peut devenir si élevée que le système ne peut pas reconstituer les niveaux d’oxygène du milieu d’essai après chaque mesure, ce qui conduit à un environnement de plus en plus hypoxique et à une caractérisation erronée d’OxPhos.

Dans la série représentative, les cellules ont été ensemencées à une densité de 200 000 et 400 000 cellules par puits (figure 2A-C). Pour une course avec 200 000 cellules, l’OCR initial est d’environ la moitié d’une course avec 400 000 cellules par puits. Pour le traitement FCCP, l’OCR maximale est de 61,6 pmol/min (200 000 cellules) contre 190,4 pmol/min (400 000 cellules). Après un traitement à l’oligomycine, l’OCR en cours d’exécution avec 200 000 cellules s’effondre en OCR à un chiffre (6,4 pmol / min). C’est inférieur à l’OCR de la course, avec 400 000 cellules par puits traité à l’oligomycine (25,8 pmol/min, respectivement).

Par conséquent, d’après l’exécution de l’optimisation, il est clair qu’un nombre de cellules de 400 000 cellules par puits était nécessaire pour les essais futurs, en utilisant 1 μM d’oligomycine et 0,2 μM de FCCP. Dans la configuration classique recommandée par le fabricant, l’oligomycine et le FCCP sont ajoutés séquentiellement avec l’ajout final d’antimycine A. Pour les lymphocytes T, ce n’est pas l’approche optimale car le traitement à l’oligomycine peut être vu pour limiter le découplage après le traitement FCCP (Figure 3A,B). Dans cette méthode présentée, il est recommandé d’exécuter chaque condition dans des puits en double et de traiter l’un avec de l’oligomycine et l’autre avec du FCCP, avec un ajout final d’antimycine A pour les deux puits. En utilisant cette approche, le traitement à l’oligomycine n’affecte pas l’OCR après le traitement FCCP. Cette approche permet de déterminer les mêmes propriétés mitochondriales que la configuration classique, où les médicaments sont ajoutés en séquence (Figure 3C)

Enfin, il a été étudié si les effets des cytokines IL-2 et IL-15 pouvaient être différenciés sur le métabolisme des cellules T primaires humaines cultivées ex vivo. En effet, les cellules cultivées à l’IL-15 possédaient une respiration maximale plus élevée et une capacité respiratoire inutilisée, comme cela a été montré précédemment1 (figure 4A-E). La respiration basale et la production d’ATP n’ont pas été affectées. Prises ensemble, ces données montrent que la respiration mitochondriale des cellules T primaires humaines cultivées ex vivo peut être analysée avec succès à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire.

Figure 1 : Taux de consommation d’oxygène (OCR) mesuré pendant le titrage des inhibiteurs oligomycine et FCCP dans des lymphocytes T primaires humains cultivés ex vivo. (A) OCR pendant le titrage progressif de l’oligomycine à partir de 0-1,25 μM concentration finale. (B) OCR pendant le titrage progressif du FCCP à partir de 0-0,5 μM de concentration finale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Influence de la concentration cellulaire sur les mesures OCR dans les lymphocytes T primaires humains cultivés ex vivo. Mesures OCR de lymphocytes T primaires humains cultivés ex vivo avec 200 000 ou 400 000 cellules par puits après injection de (A) FCCP ou (B) d’oligomycine. (C) Respiration basale, respiration maximale, production d’ATP et capacité respiratoire inutilisée des lymphocytes T primaires humains utilisant 200 000 ou 400 000 cellules par puits. Représentatif de trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Injection simple ou séquentielle de modulateurs mitochondriaux. (A) Mesures OCR représentatives pendant la ligne de base et après l’injection d’oligomycine et de FCCP (a, b) ou d’antimycine A (c) sous forme d’injections individuelles uniques ou d’injections séquentielles. (B) Valeurs OCR avant l’injection (respiration basale) ou après l’injection d’oligomycine ou de FCCP sous forme d’injections uniques ou séquentielles. (C) Représentation schématique de la stratégie d’injection et de mesure. Représentant d’une expérience indépendante Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Différences dans la respiration mitochondriale dans les lymphocytes T primaires humains différenciés par cytokines. (A-D) Respiration basale, respiration maximale, production d’ATP et capacité respiratoire inutilisée des lymphocytes T primaires humains cultivés avec de l’IL-2 ou de l’IL-15 pendant sept jours (n = 3). (E) Parcelles représentatives de (A-D), avec des injections d’oligomycine ou de FCCP (a) ou d’antimycine A (b). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Préparation de cultures de cytokines utilisées pour guider les changements métaboliques dans les lymphocytes T.

Tableau 2 : Stratégie de préparation des inhibiteurs et modulateurs mitochondriaux. Concentrations de préparation, concentrations de travail et stratégies d’injection pour une exécution d’optimisation.

Tableau 3 : Conception du protocole d’une opération d’optimisation avec titrage des inhibiteurs et modulateurs mitochondriaux à l’aide de 4 injections avec 3 mesures dans chacune.

Tableau 4 : Explication des différents composants de la respiration mitochondriale étudiés à l’aide de l’analyseur de flux

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.