Culture et imagerie des organoïdes épithéliaux nasaux humains

Introduction à la technique
Les tests basés sur la culture ex vivo sont un outil de plus en plus utilisé pour la médecine de précision et l’étude de la physiopathologie des maladies. La culture épithéliale nasale humaine primaire (HNE) a été utilisée dans de nombreuses études sur la fibrose kystique 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , une maladie autosomique récessive qui affecte la fonction des cellules épithéliales dans plusieurs organes. La culture HNE fournit une source renouvelable d’épithélium des voies respiratoires qui peut être obtenue prospectivement et récapitule les qualités électrophysiologiques et biochimiques pour tester l’activité du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR). Les cellules HNE peuvent être échantillonnées avec des effets secondaires minimes¹⁴, similaires aux écouvillons respiratoires viraux courants. Des travaux de recherche décrivant un modèle d’étude sur la fibrose kystique dérivé de biopsies à la brosse HNE ont été récemment publiés^11,13. Bien que similaire à d’autres modèles utilisant^{l’HNE primaire 2,3} et le tissu intestinal 15,16,17,18,19, la caractérisation détaillée de la différenciation et de l’imagerie de ce modèle est décrite ici pour une utilisation dans la recherche sur la FK et pour aider aux études d’autres maladies des voies respiratoires ¹³ . Le modèle organoïde n’est pas illimité comme les lignées cellulaires immortalisées, mais peut être étendu par reprogrammation conditionnelle (en utilisant des fibroblastes d’alimentation irradiés et inactivés et des inhibiteurs de rho-kinase) à un état plus semblable à celui des cellules souches ^20,21,22,23. Le traitement des biopsies au pinceau HNE à l’aide de cette méthode produit un grand nombre de cellules épithéliales pour une utilisation dans de multiples applications à un débit plus élevé tout en conservant la capacité de se différencier pleinement. Bien que ce protocole ait été élaboré à l’aide de cellules nourricières, d’autres méthodologies peuvent être utilisées par les chercheurs qui souhaitent éviter la technologie des cellules ^{d’alimentation 14,24}.

Importance de la technique pour la biologie pulmonaire
Une étude importante a été consacrée à la compréhension de la façon dont l’absence de CFTR régulier et fonctionnel dans la membrane cellulaire des cellules épithéliales entraîne un dysfonctionnement des poumons, du pancréas, du foie, de l’intestin ou d’autres tissus. Le transport dysfonctionnel des ions épithéliaux, en particulier celui du chlorure et du bicarbonate, entraîne une diminution du volume des fluides de la muqueuse épithéliale et des modifications des sécrétions muqueuses, entraînant une stase muqueuse et une obstruction. Dans d’autres maladies des voies respiratoires, telles que la dyskinésie ciliaire primaire, une altération du mouvement ciliaire altère la clairance mucociliaire et entraîne une stase muqueuse et une obstruction²⁵. Par conséquent, le modèle organoïde HNE actuel a été développé pour diverses applications, en fonction de la conception expérimentale et des ressources de l’investigateur. Cela comprend l’imagerie de cellules vivantes à l’aide de taches de cellules vivantes; fixation et sectionnement pour caractériser la morphologie; coloration par immunofluorescence avec des anticorps et imagerie confocale à montage entier pour éviter de perturber les structures intraluminales; et l’imagerie en champ lumineux et la tomographie par cohérence micro-optique pour les mesures quantitatives de la fréquence des battements ciliaires et du transport mucociliaire¹³. Pour faciliter l’expansion à d’autres chercheurs, des réactifs et des fournitures disponibles dans le commerce ont été utilisés pour la culture. Un test fonctionnel a été développé qui utilisait des techniques de microscope courantes et un équipement plus spécialisé. Dans l’ensemble, bien que le présent modèle ait été conçu pour évaluer l’activité du CFTR au départ ou en réponse à des traitements, les techniques décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres maladies impliquant la fonction des cellules épithéliales, en particulier le transport du liquide cellulaire épithélial.

Comparaison avec d’autres méthodologies
Récemment, l’utilité de ce modèle organoïde a été développée en corrélant les réponses in vitro du modulateur CFTR des organoïdes des patients avec leur réponse clinique¹¹. Notamment, il est également démontré que le modèle actuel était parallèle aux réponses de courant de court-circuit, l’étalon-or actuel pour évaluer la fonction CFTR, chez les mêmes patients. Le courant de court-circuit diffère du test de gonflement car le premier mesure la fonction CFTR via le transport ionique²⁶. En revanche, ce test mesure un effet plus en aval avec le transport de fluide, fournissant des informations supplémentaires sur la fonction globale du CFTR 27,28,29,30,31,32. Les mesures de courant de court-circuit ont continué d’être une méthode courante et fiable pour déterminer l’activité^du canal chlorure CFTR ^1,33. Ces essais électrophysiologiques nécessitent un équipement spécialisé et coûteux, nécessitent beaucoup plus de cellules pour chaque réplication expérimentale que le test organoïde, ne peuvent pas être facilement automatisés et ne se prêtent pas à une mise à l’échelle pour des applications à haut débit. Un autre modèle organoïde dérivé de l’épithélium intestinal présente des avantages supplémentaires 15,16,17,18, tels qu’une capacité de réplication plus excellente, mais n’est ni dérivé d’un tissu des voies respiratoires ni universellement disponible. Les brossages HNE sont obtenus avec des brosses cytologiques peu coûteuses sans sédation et avec un risque minimal. L’obtention du brossage ne nécessite pas de clinicien et peut être effectuée par des coordonnateurs de recherche formés et d’autres membres du personnel de recherche¹⁴. Le modèle organoïde HNE peut être cultivé par n’importe quel laboratoire doté de capacités de culture cellulaire primaire, et certaines des applications peuvent être réalisées avec des techniques de microscopie standard. Dans l’ensemble, ces avantages offrent un accès supplémentaire à la technologie d’évaluation de la fonction épithéliale des voies respiratoires qui pourrait autrement ne pas être disponible pour certains laboratoires. En outre, les organoïdes HNE peuvent être utilisés pour étudier d’autres états pathologiques qui affectent les voies respiratoires, tels que la dyskinésie ciliaire primaire²⁵ ou l’infection virale, ce que les organoïdes intestinaux ne peuvent pas.

Des échantillons de HNE ont été prélevés à l’hôpital Children’s of Alabama. Toutes les procédures et méthodes décrites ici ont été approuvées par l’IRB University of Alabama à Birmingham (UAB IRB #151030001). Pour faciliter l’expansion et améliorer la fonction des cellules épithéliales nasales humaines (HNE), les méthodes de culture actuelles sont adaptées de la méthode de culture bien connue de l’interface air-liquide (ALI)^28,34. Les HNE ont d’abord été prélevés par biopsie au pinceau comme décrit précédemment^12,14, la seule différence étant l’utilisation d’une brosse de cytologie. Toutes les étapes de traitement des échantillons et de culture cellulaire ont été effectuées dans l’armoire de biosécurité.

1. Culture cellulaire et expansion des cellules épithéliales nasales

1. Après le brossage, conserver l’échantillon de biopsie nasale dans 8 mL de milieu RPMI dans un tube conique de 15 mL sur de la glace et le transférer au laboratoire dans les 4 h (pas plus de 24 h).
2. Dissocier la biopsie nasale de la brosse en 8 mL de milieu RPMI dans un tube conique de 15 mL en faisant passer la brosse de cytologie à travers une pointe de pipette de gros alésage de 1 mL (couper la pointe) plusieurs fois jusqu’à ce que la brosse soit débarrassée du tissu.
3. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant, puis remettre en suspension la pastille cellulaire dans 3 mL de solution de détachement cellulaire (voir Tableau des matériaux) et incuber à température ambiante pendant 16 min pour digérer.
4. Utilisez 5 mL de milieu expansif (tableau 1) pour laver les cellules deux fois. Ensuite, ajoutez des cellules à une fiole T75 pré-ensemencée avec des fibroblastes 3T3 irradiés et inactivés²² (confluence de 50% à 60%) pour co-cultiver les cellules et se dilater dans le milieu d’expansion pendant 7 à 14 jours (voir la figure 1 pour la colonie appropriée). Avant utilisation, testez les fibroblastes 3T3 irradiés pour vous assurer qu’ils ne peuvent pas proliférer, ce qui influencera négativement l’expansion des cellules épithéliales.
   REMARQUE: Jetez les cellules si la confluence des cellules épithéliales nasales n’atteint pas 70% dans les 14 jours.
5. Pour les cellules dérivées de patients atteints de mucoviscidose, introduire quatre antibiotiques (100 μg/mL de tobramycine, 2,5 μg/mL d’amphotéricine B, 100 μg/mL de ceftazidime, 100 μg/mL de vancomycine, voir Tableau des matériaux) dans le milieu d’expansion pour la désinfection des cellules pendant les 3 premiers jours de culture, puis remplacer le milieu par un milieu d’expansion sans antibiotique changeant le milieu tous les 2 jours.
   REMARQUE: Cette utilisation limitée d’antibiotiques vise à réduire la perte de culture due à la colonisation bactérienne tout en encourageant la prolifération après l’élimination des antibiotiques supplémentaires. Ces antibiotiques peuvent être adaptés aux résultats microbiologiques spécifiques du patient, avec des sensibilités, si nécessaire.
6. Récoltez les HNE à partir de la co-culture en utilisant la méthode de double trypsinisation²² une fois que les cellules atteignent environ 80% de confluence. Cette méthode garantit que les fibroblastes 3T3 irradiés et inactivés sont retirés de la fiole et qu’ils ne contaminent pas l’ensemencement organoïde ultérieur.
   1. Lavez les cellules avec 1x DPBS, puis ajoutez 1,5 mL de trypsine-EDTA à 0,05% dans la fiole T75 pendant 4 min à 37 °C pour éliminer le fibroblaste 3T3 irradié et inactivé de la culture.
   2. Rincez la fiole T75 avec 1x DPBS deux fois pour bien laver les fibroblastes 3T3 restants; ajouter 1,5 mL de 0,05 % de trypsine-EDTA dans la fiole T75 pendant 10 min à 37 °C pour détacher les HNE.
   3. Neutraliser la trypsine avec un inhibiteur de la trypsine de soja (voir tableau des matériaux) dans un rapport de 1:1. Centrifugez les cellules à 500 x g pendant 5 min, puis retirez le surnageant. Après avoir lavé les cellules avec 5 mL de milieu d’expansion une fois, les cellules sont prêtes à être ensemencées pour développer des organoïdes.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser les HNE avec un numéro de passage de trois pour d’autres expériences.

2. Croissance et différenciation des organoïdes dans les lames et les inserts de culture

1. Décongeler la matrice extracellulaire (ECM) de culture organoïde pendant la nuit à 4 °C. Refroidir les embouts de pipette à 4 °C et les lames d’angiogenèse à 15 puits (voir tableau des matériaux) pendant la nuit à 4 °C.
   REMARQUE: L’ECM doit être mis à 4 ° C la nuit avant que le prélèvement cellulaire ne soit effectué.
2. Enduire les lames de 5 μL d’ECM froid à 100 % sur glace (pipette 5 μL d’ECM froid 100 % avec une pointe de pipette froide dans chaque puits de la lame de 15 puits), puis placez-les dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant au moins 30 min pour la consolidation.
3. Compter les HNE récoltés en co-culture à l’aide d’un hémocytomètre et diluer les cellules à 500 cellules/μL en nombre total avec 20 % d’ECM dilué par des milieux de différenciation (tableau 2) sur glace. Ensuite, ensemencez 5 μL du mélange cellule froide/ECM dans chaque puits des lames recouvertes d’ECM.
4. Transférer immédiatement les lames dans un incubateur de culture à 37 °C pendant 1 h pour consolider le mélange cellule/ECM.
5. Nourrissez les cellules dans chaque puits des lames d’angiogenèse à 15 puits avec 50 μL de milieux de différenciation. Changez le média tous les deux jours jusqu’à ce que les organoïdes soient prêts pour d’autres expériences.
   REMARQUE: Les organoïdes peuvent généralement être visualisés après 1-2 jours. Il y a 20 à 90 organoïdes couramment formés dans chaque puits des lames. Les organoïdes peuvent généralement survivre pendant 40 à 60 jours dans l’ECM avec une alimentation tous les deux jours lorsqu’ils sont conservés dans un incubateur humidifié à 37 ° C.
6. Cultiver les organoïdes dans les inserts de culture (voir tableau des matériaux) pour une plus grande quantité pour des applications spécifiques (telles que la section pour l’histologie ou l’immunofluorescence) selon les étapes mentionnées ci-dessous.
   1. Pour cultiver des organoïdes dans les inserts de culture, préparez l’ECM de culture organoïde, les embouts de pipette et les inserts comme mentionné aux étapes 2.1-2.2. Enduisez les inserts de 100 μL de froid 100% ECM.
   2. Graine 60 μL de mélange cellule/ECM (500 cellules/μL avec 20% d’ECM dans les milieux de différenciation) sur le revêtement ECM dans l’insert.
      REMARQUE: Toutes les autres étapes de fabrication d’organoïdes dans les inserts sont les mêmes que celles effectuées dans les diapositives, étapes 2.4-2.5.
   3. Ajouter 600 μL du support de différenciation dans la partie inférieure de l’insert. Changez le média tous les deux jours jusqu’à ce que les organoïdes soient utilisés pour des expériences, généralement 2-3 semaines.

3. Préparation et isolement des organoïdes pour l’immunofluorescence de montage entier

1. Isolement et fixation des organoïdes
   1. Prétraitez les lames de la chambre à fond de verre à 8 puits avec de l’adhésif cellulaire (voir tableau des matériaux) pendant 30 minutes suivant la référence³⁵. Après avoir jeté la solution, sécher les puits à l’air libre pendant 30 min.
   2. Pour prélever les organoïdes, retirez le support du haut de l’ECM, puis ajoutez 50 μL de PBS froid 1x dans chaque puits des diapositives de 15 puits sur glace (1:1 avec le volume ECM).
   3. Pipette de haut en bas 3 à 5 fois en utilisant 200 μL de la pointe de la pipette de gros calibre, puis distribuer la solution au centre d’un puits des glissières de la chambre à 8 puits.
   4. Retirez immédiatement l’excès de liquide des puits à l’aide d’une pipette à pointe fine. Ensuite, placez la glissière de la chambre dans un incubateur à 37 °C pendant 40 min pour améliorer l’organoïde adhérant au fond du verre.
   5. Après avoir lavé doucement avec 1x PBS deux fois, fixez les organoïdes avec 300 μL de paraformaldéhyde à 4% dans chaque puits pendant 30 min à température ambiante (RT).
   6. Laver deux fois avec 1x PBS et stocker les organoïdes dans 1x PBS à 4 °C pour l’immunocoloration jusqu’à 2 semaines.
2. Coloration par immunofluorescence
   1. Pour réduire l’autofluorescence, ajoutez 250 μL de 50 mM NH₄Cl dans 1x PBS dans chaque puits des lames à RT pendant 30 min tout en secouant doucement sur un shaker à 20 tr/min.
   2. Après avoir lavé deux fois avec 1x PBS, perméabilisez les cellules avec 0,1% de Triton X-100 pendant 30 min à RT tout en secouant doucement à 20 tr / min.
   3. Après avoir lavé deux fois avec 1x PBS, ajouter 300 μL de solution bloquante, dont 5% de BSA et 0,1% de Triton X-100 dans 1x PBS, dans chaque puits pendant 1 h à RT.
   4. Après le lavage, ajouter des anticorps primaires dans les puits appropriés, suivis d’anticorps secondaires (voir tableau des matériaux). Préparer des solutions d’anticorps primaires et secondaires dans 2% de BSA et 0,3% de Triton X-100 dans 1x PBS. Incuber tous les anticorps primaires à 4 °C pendant 2 jours et tous les anticorps secondaires à 4 °C pendant 1 jour.
      REMARQUE: Les concentrations finales dépendent de la protéine souhaitée pour l’expérience. Veuillez vérifier la concentration des stocks sur la fiche technique du fabricant. Ensuite, calculez les concentrations finales en fonction des dilutions utilisées dans le tableau des matériaux.
   5. Après l’incubation, lavez soigneusement les puits avec 1x PBS et ajoutez du DAPI dans 2% de BSA et 0,3% de Triton X-100 dans chaque puits pour la coloration nucléaire.
   6. Imagez les organoïdes à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser, avec un objectif d’immersion dans l’huile 20-60x (voir tableau des matériaux). Utilisez le mode Z-stack pour définir les limites supérieure et inférieure de l’image et utilisez la taille Z-step optimale recommandée déterminée par le logiciel confocal.
      REMARQUE: Les quatre longueurs d’onde d’excitation laser confocales suivantes ont été utilisées: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm et 637,9 nm.

4. Préparation et isolement des organoïdes pour la section histologique

1. Pour prélever les organoïdes pour des études histologiques, retirez le milieu de la culture et ajoutez 50 μL de PBS froid 1x dans chaque puits des lames sur glace.
2. Pipette de haut en bas trois à cinq fois à l’aide d’une pointe de pipette de gros calibre de 200 μL, combinez toutes les solutions de la glissière de 15 puits ou des inserts de culture dans un tube conique de 15 mL sur glace. Réglez le volume total de la solution dans le tube à 10 mL en ajoutant 1x PBS froid supplémentaire.
3. Centrifuger le tube à 4 °C, 300 x g pendant 5 min; aspirer le surnageant et ajouter 60 μL d’histogel chaud (voir Tableau des matériaux) à mélanger avec la pastille organoïde à l’aide d’un 200 μL de l’embout de la pipette de gros calibre.
4. Transférer immédiatement la suspension dans un moule d’histologie. Après la consolidation de l’histogel à température ambiante, mettre le bloc de moisissure dans du paraformaldéhyde à 4% pour la fixation pendant la nuit à 4 °C.
5. Après avoir incorporé de la paraffine, coupez le bloc d’histogel en sections transversales de 5 μm (par exemple, avec un microtome), fixez les sections sur des lames de verre et colorez à l’aide d’hématoxyline et d’éosine (H & E) ou d’anticorps marqués par immunofluorescence. Prenez des images à l’aide d’un microscope à champ lumineux ou d’un microscope à épifluorescence inversée (voir tableau des matériaux).

5. Imagerie d’organoïdes vivants

REMARQUE: Les étapes suivantes sont effectuées à l’aide d’un système d’imagerie automatisé (voir tableau des matériaux). Différents systèmes d’imagerie doivent adapter ces étapes en suivant les instructions spécifiques de leur fabricant. Quel que soit l’équipement utilisé, l’imagerie des organoïdes vivants nécessite une chambre environnementale à température contrôlée et humidifiée avec un contrôleur de gaz CO₂ accompagné.

1. Pour surveiller la différenciation des organoïdes avant d’effectuer un test de gonflement fonctionnel³⁶, capturez manuellement l’ensemble des images de diapositives avec n’importe quel microscope à champ lumineux ou avec un système d’imagerie automatisé, comme détaillé ci-dessous.
   1. Mettez sous tension le système d’imagerie automatisé et le contrôleur de gaz CO₂/O₂ et laissez le système terminer l’étalonnage automatisé (~30 min).
   2. Une fois terminé, réglez la température du système d’imagerie à 37 °C; ajouter 15 mL d’eau stérile au réservoir d’humidification, ouvrir les vannes de CO₂ , fermer les couvercles et laisser le système d’imagerie pré-incuber pendant au moins 30 min avant l’imagerie.
   3. Ouvrez le logiciel d’imagerie automatisé pour configurer un protocole d’imagerie et choisissez l’emplacement pour enregistrer les données expérimentales brutes.
      REMARQUE: Un exemple de fichier de protocole (fichier supplémentaire 1), spécifique au système d’imagerie, a été fourni comme modèle pour l’imagerie automatisée des organoïdes afin de surveiller la différenciation organoïde.
   4. Une fois les paramètres environnementaux respectés, transférez immédiatement jusqu’à deux glissières de 15 puits avec couvercles dans la chambre environnementale dans l’insert du support de diapositive du système d’image automatisé (voir tableau des matériaux).
   5. Sélectionnez les puits à imager et commencez l’imagerie pour terminer l’imagerie des puits souhaités.
      REMARQUE: Les paramètres de base recommandés sont: objectif d’air 4x et 10x, canal de champ lumineux, montage 2 x 2 pour objectif 4x pour couvrir toute la zone du puits, montage 4 x 4 pour un objectif 10x. Paramètres de la pile Z : trois à six tranches de la pile Z, taille de la pile Z = 50 à 100 μm, une à deux tranches en dessous du point de mise au point automatique et trois à cinq tranches au-dessus.
2. Pour imager des organoïdes vivants à utiliser dans un test de gonflement induit par la forskoline (FIS), utilisez un microscope avec un étage automatisé équipé d’une chambre d’imagerie contrôlée par l’environnement qui permet le contrôle de la température et du CO₂ .
   1. Commencez par les étapes 5.1.1 à 5.1.4, remplacez le fichier de protocole de l’étape 5.1.3 par celui fourni dans l’exemple de fichier de protocole (fichier supplémentaire 2) contenant des paramètres spécifiques à l’exécution d’un test FIS.
   2. Avant chaque expérience, ajustez les paramètres d’exposition en évaluant au moins trois puits pour chaque diapositive (à l’extrême gauche, au milieu et à l’extrême droite). Appliquez les décalages de coordonnées X et Y pour vous assurer que l’objectif sera au centre du puits pour tous les puits.
      REMARQUE: Les paramètres de base recommandés sont: objectif d’air 4x, canal 1 = champ lumineux, canal 2 = DAPI, montage 2 x 2 (quatre tuiles d’image). Paramètres de la pile Z : trois à quatre tranches de la pile Z, taille de la pile Z = 50-100 μm, une tranche en dessous du point de mise au point automatique et deux à trois tranches au-dessus. Temps d’acquisition de l’image: 8 h avec des intervalles de 20 minutes (Lectures totales = 25; Lire 1 est T = 0).
   3. Une fois que tous les paramètres sont correctement sélectionnés, choisissez les puits à imager pour les deux diapositives, ou sélectionnez tous, et commencez la course selon les instructions de l’équipement.
   4. Après l’exécution, enregistrez l’expérience, fermez le logiciel d’imagerie et arrêtez le système d’imagerie³⁷.

6. Mesures de la lumière de base

REMARQUE: Cela se fait à l’aide d’un logiciel d’analyse d’imagerie manuelle (voir tableau des matériaux). Une méthodologie similaire peut être suivie à l’aide d’un logiciel open source³⁸ ou de tout logiciel capable de mesurer la surface d’une région sur une image.

1. Dans le logiciel, ouvrez le panneau de mesure automatisée en cliquant avec le bouton droit sur le bas de l’écran, sélectionnez Mesure, puis Résultats de mesure automatisés. La zone de chaque région d’intérêt (ROI) mesurée y apparaîtra.
2. Ouvrez l’image organoïde dans le logiciel et sélectionnez 5 à 10 organoïdes avec des lumens visibles.
   REMARQUE: Lumens sera une zone circulaire au milieu de l’organoïde qui est visiblement différente en couleur que le reste de l’organoïde (Figure 2A).
3. À l’aide de la fonction de mesure du retour sur investissement du polygone, maintenez la touche droite enfoncée sur l’image pour ouvrir le menu et sélectionnez ROI polygonal pour définir l’organoïde complet afin d’obtenir la surface totale (TSA) de l’organoïde. Ensuite, à l’aide de la même fonction, tracez le contour de la zone lumineuse (LA) (Figure 2B).
4. Répétez l’opération pour les organoïdes restants dans le puits et tous les puits dans le test.
5. Exportez les données vers Excel. Divisez le LA par la TSA et faites la moyenne de tous les organoïdes de l’échantillon pour obtenir le rapport de lumière de base (BLR)^11,13.
   REMARQUE: En règle générale, ~ 87% des organoïdes non CF auront un BLR supérieur à 0,6 et 97% auront plus de 0,5, tandis que seulement 14% des organoïdes CF auront un BLR supérieur à 0,6 et 31% seront supérieurs à 0,5.

7. Prétraitement et imagerie automatisée des organoïdes HNE

REMARQUE: Toutes les étapes de prétraitement sont effectuées dans une armoire de biosécurité propre. Préconfigurez le système d’imagerie automatisé et le logiciel d’enregistrement du test avant l’étape 7.1. L’incubation avec DAPI est facultative mais est recommandée comme sécurité intégrée si la qualité des images en champ lumineux est compromise. Dans ce cas, le canal DAPI (377 nm) peut être analysé à la place.

1. Pré-incuber les organoïdes dans un puits de lames de 15 puits avec 50 μL de milieux de différenciation contenant du DAPI avec ou sans 100 μM de CFTRinh-172 (voir tableau des matériaux) dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h. Pendant que les organoïdes incubent, effectuez l’étape 5.2.1 à l’aide d’un protocole personnalisé de dosage de gonflement suivant le fichier supplémentaire 2.
2. Retirer le milieu de pré-incubation à l’aide d’une pipette Pasteur en verre avec aspiration. Ajouter 10 μM de forskoline et 100 μM d’IBMX (cocktails de stimulation) (voir tableau des matériaux) pour un volume total de 50 μL de milieux de différenciation dans chaque puits.
   REMARQUE: Assurez-vous qu’aucune bulle n’est introduite dans les puits. Les bulles sur les images affecteront l’analyse automatisée.
3. Sans délai, commencez le protocole d’imagerie FIS en suivant les étapes 5.2.2 à 5.2.4. Acquérir des images toutes les 20 minutes dans chaque puits, avec une durée d’exécution totale de 8 h.

8. Analyse automatisée du dosage de gonflement induit par la forskoline sur les organoïdes HNE

1. Ouvrez le logiciel d’analyse d’imagerie automatisé, recherchez l’expérience précédemment enregistrée à partir de l’étape 7.3 et affichez les images de l’expérience.
2. Choisissez la fenêtre de navire à évaluer et sélectionnez l’option contenant les images traitées qui ont été assemblées et projetées en Z. Cette étape doit fournir une image de l’ensemble du puits avec tous les organoïdes dans le cadre d’imagerie pour l’évaluation et les mesures de masquage.
3. Choisissez l’image du puits à évaluer. Sélectionnez Analyser. Répétez ce processus pour d’autres images afin d’assurer un masquage approprié pour toutes les images incluses dans les mesures automatisées. Enregistrez les paramètres de réglage.
4. Une fois les paramètres d’analyse terminés, appliquez les modifications. Le logiciel modifiera les mesures en fonction des paramètres.
   REMARQUE: Une fois le prétraitement initial de l’image terminé, des mesures de contrôle de la qualité (CQ) doivent être effectuées pour assurer un masquage cohérent. Il s’agit notamment d’examiner manuellement tous les puits pour s’assurer que les organoïdes se trouvent dans le cadre d’imagerie, que les bulles ou les débris ne sont pas masqués de manière inappropriée, et de vérifier le masquage dans les canaux en champ lumineux et DAPI.
5. Exportez les données pour l’analyse sommaire (y compris l’analyse graphique et statistique).

L’expansion des HNE est essentielle à une culture organoïde florissante. Les HNE d’une collecte d’échantillons réussie devraient s’étendre à plus de 70% de confluence vers 10 jours. Un exemple d’échantillons réussis et infructueux est illustré à la figure 1A et à la figure 1B, respectivement. Les cellules doivent être jetées si elles ne peuvent pas atteindre 70% de confluence 14 jours après la co-culture avec des cellules 3T3 irradiées. Toutes les cellules contaminées doivent être immédiatement jetées si elles ne peuvent pas être sauvées rapidement avec des agents antimicrobiens supplémentaires.

La croissance des organoïdes a été comparée dans des lames de 15 puits et des inserts de culture. Les inserts de culture sont plus épais et plus éloignés de l’objectif que les diapositives optiquement optimisées, ce qui a un impact sur l’image et la résolution. Malgré cela, aucune différence significative dans la morphologie n’a été observée dans ces deux méthodes de culture, comme le montre la figure 2. Des différences morphologiques peuvent être observées entre les organoïdes non ATTEINTs de mucoviscidose et de FK, comme le montre la figure 3A. Les organoïdes non ATTEINTS de mucoviscidose ont tendance à avoir une lumière plus grande contenant plus de liquide à l’intérieur. En revanche, les organoïdes de la mucoviscidose ont généralement une lumière plus petite avec moins de liquide et sont parfois remplis de mucus et de débris. La taille des lumens a été mesurée manuellement (figure 3B), et le rapport lumineux de référence a été calculé et illustré à la figure 3C. Les organoïdes en coupe transversale ont été caractérisés à l’aide de colorations H&E et immunofluorescence. Les images représentatives sont illustrées à la Figure 4A,B. Les marqueurs épithéliaux des voies respiratoires tels que les cils, le mucus et la jonction serrée sont démontrés dans les organoïdes par coloration immunofluorescente de montage entier illustrée à la figure 5A-D. Selon l’application, une immunofluorescence sectionnée ou à montage entier peut être utilisée. La méthode de montage entier maintient la nature tridimensionnelle de l’organoïde, en gardant l’intérieur de l’organoïde intact, comme le montre l’ouvrage précédemment publié13.

La fonction CFTR a été évaluée par un dosage de gonflement induit par la forskoline (FIS) à l’aide d’un système d’imagerie automatisé. Seules les diapositives de 15 puits sont utilisées pour les tests fonctionnels en raison de la meilleure résolution d’image. Une expérience dose-réponse représentative de la forskoline chez des volontaires non atteints de mucoviscidose (n = 5 sujets) est illustrée à la figure 6A pour illustrer la raison d’être du temps d’imagerie et de l’analyse optimisés. Les données comparant les réponses organoïdes non FK et CF sont détaillées dans les publications précédentes11,13. Une dose-réponse montre le changement progressif de l’activité CFTR pour démontrer la meilleure approche des mesures. La durée du dosage de 1 h et 8 h a été évaluée (figure 6B,C) ainsi que l’analyse utilisant la variation fractionnaire moyenne (AFC) par rapport à l’aire sous la courbe (ASC) est vue dans les figures 6C,D. Sur la base de notre expérience antérieure, l’enflure pour la plupart des sujets et des conditions plafonne après 8 h et, dans certains cas, entraîne l’éclatement des organoïdes au cours de cette période. Par conséquent, les essais ont été limités à 8 h seulement. À cette longueur de dosage étendue, le gonflement devient non linéaire. L’utilisation de la CUA tient également compte à la fois des changements de taille et du taux de variation. Par conséquent, l’ASC sur 8 h a été utilisée pour tous les essais FIS dans la méthodologie finale.

Figure 1 : Images en champ lumineux des HNE en co-culture. Les HNE se développent dans les milieux d’expansion avec des fibroblastes 3T3 irradiés et inactivés pendant 10 jours. Un microscope à champ lumineux inversé est utilisé pour l’imagerie des cellules. (A) Les HNE poussent bien en grande grappe (flèche noire). En revanche, en (B), les HNE se développent mal en deux petits amas (flèches noires) entourant les cellules 3T3 irradiées. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Formation d’organoïdes HNE dans une lame de 15 puits et un insert de culture. Des images en champ lumineux d’organoïdes ont été capturées à l’aide d’un microscope à champ lumineux inversé pendant 21 jours. Les organoïdes de la diapositive à 15 puits (A) ont des images plus précises et plus nettes que celles de l’insert de culture (B). Aucune différence morphologique n’a été observée entre les organoïdes cultivés dans la lame et l’insert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Taille de la lumière organoïde (panneau A) et mesures de la lumière (panneau B et C). (A) Les organoïdes non ATTEINTS de mucoviscidose ont généralement une lumière plus grande et plus fluide que les organoïdes de la mucoviscidose (F508del/F508del). (B) Méthode permettant de mesurer manuellement la surface totale (TSA) indiquée par le contour rouge et la zone lumineuse (LA) indiquée par le contour vert dans un seul organoïde. (C) Un exemple d’utilisation de la surface totale et de la surface lumineuse pour calculer le rapport de lumen de référence (LA: TSA) dans les organoïdes d’un sujet non CF par rapport à un sujet CF. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Coupe transversale des organoïdes incorporés dans la paraffine. (A) Un exemple de coloration H&E chez les organoïdes d’un sujet non CF et CF (F508del/F508del). (B) Coloration immunofluorescente des cils dans un organoïde. Le vert est les cils (flèche blanche) colorés avec de la tubuline acétylée et un anticorps secondaire marqué FITC, et le bleu est le noyau marqué avec DAPI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Images confocales de l’immunofluorescence de montage entier chez les organoïdes. (A,C) Images de projection maximale des deux organoïdes représentatifs. (B,D) Images de reconstruction tridimensionnelle de (A) et (C), respectivement. Une lame à fond de verre à 8 puits a été installée sur la plate-forme d’un microscope confocal, et la lentille 40x a été utilisée pour créer les photomicrographies. Un logiciel d’analyse d’imagerie a été appliqué pour l’imagerie et la reconstruction des images. Les flèches blanches indiquent le mucus (en B) et les cils (en C) dans la lumière des organoïdes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Justification de la longueur du dosage de gonflement et des méthodes d’analyse. Dosage de l’enflure induite par la forskoline (FSK) pour tester la fonction CFTR sur les cellules épithéliales nasales primaires. Différentes doses de forskoline indiquées dans les chiffres ont été administrées dans des organoïdes âgés de 21 jours dans les milieux de différenciation; le gonflement organoïde a été immédiatement enregistré avec l’imageur automatisé pendant 8 heures. Après 8 h, l’enflure est observée chez (A) (n = 5, sujets non atteints de mucoviscidose) en utilisant le changement fractionnaire moyen (AFC). La dose-réponse de FSK est comparée à l’AFC à 1 h (B) par rapport à 8 h (C), ce qui suggère que le test de 8 h peut produire une différence de gonflement plus significative entre les différentes doses de FSK que celles à 1 h. AFC (C) par rapport à la zone sous la courbe, l’ASC (D) à 8 h sont comparées, indiquant que l’ASC peut refléter une différence de gonflement mineure par rapport à l’AFC. L’axe X dans les panneaux (B-D) représente les différentes conditions de traitement correspondant aux symboles de la légende de la figure. Toutes les barres d’erreur dans les chiffres indiquent un écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Tous les composants pour la fabrication du support d’extension. Les informations détaillées sur la concentration des stocks de réactifs, le stockage des stocks, la quantité de stock pour la fabrication d’un milieu de 500 mL et la concentration finale ont été décrites. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Tous les composants pour la fabrication de supports de différenciation. Les informations détaillées sur la concentration des stocks de réactifs, le stockage des stocks, la quantité de stock pour la fabrication d’un milieu de 500 mL et la concentration finale ont été décrites. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Un exemple de fichier de protocole spécifique au système d’imagerie est fourni comme modèle pour l’imagerie automatisée des organoïdes afin de surveiller la différenciation des organoïdes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Exemple de fichier de protocole contenant des paramètres spécifiques à l’exécution d’un test FIS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

JSG est répertorié en tant qu’inventeur sur une demande de brevet 20170242033 de l’Université de Caroline du Nord qui décrit un modèle similaire. Lorsque la technologie concédée sous licence par l’UNC produit des redevances, les inventeurs reçoivent une part des revenus. Dans le cas contraire, les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, dans la collecte, l’analyse ou l’interprétation des données, dans la rédaction du manuscrit ou dans la décision de publier les résultats.