Isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux de rat pour la différenciation en cellules productrices d’insuline

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), également connues sous le nom de cellules stromales mésenchymateuses, sont parmi les types de cellules les plus largement utilisés pour la médecine régénérative ^1,2. Elles sont classées comme cellules souches adultes et caractérisées par un potentiel de différenciation multiligne et une capacité d’auto-renouvellement³. Les CSM peuvent être isolés et obtenus à partir de diverses sources, y compris le tissu adipeux, la moelle osseuse, le sang périphérique, le tissu et le sang du cordon ombilical, les follicules pileux et les dents ^4,5.

L’isolement des cellules souches du tissu adipeux est considéré comme à la fois attrayant et prometteur en raison de leur accès facile, de leur expansion rapide in vitro et de leur rendement élevé⁶. Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être isolées de différentes espèces telles que les humains, les bovins, les souris, les rats et, plus récemment, les chèvres⁷. Il a été prouvé que les Ad-MSC sont maintenant des candidats potentiels pour l’ingénierie tissulaire et la thérapie génique / cellulaire qui peuvent même être utilisés pour développer une alternative autologue pour la réparation à long terme des lésions ou des défauts des tissus mous ^7,8.

L’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) a défini trois critères minimaux qui doivent être présentés par les MSC pour une caractérisation complète⁹. Tout d’abord, ils doivent être adhérents au plastique. Deuxièmement, les CSM devraient exprimer des marqueurs mésenchymateux de la surface des cellules souches tels que CD73, CD90 et CD105 et manquer d’expression des marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 et HLA-DR. Enfin, les CSM devraient présenter la capacité de se différencier en trois lignées mésenchymateuses: adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Fait intéressant, les CSM peuvent également se différencier en d’autres lignées telles que les cellules neuronales, les cardiomyocytes, les hépatocytes et les cellules épithéliales^10,11.

En fait, les CSM possèdent des propriétés uniques qui leur permettent d’être appliquées en tant qu’agents thérapeutiques potentiels dans la thérapie régénérative pour différentes maladies. Les CSM peuvent sécréter des facteurs solubles pour induire un environnement immunomodulateur qui procure des avantages thérapeutiques¹². En outre, les CSM peuvent migrer vers des sites de blessures et des microenvironnements tumoraux pour administrer un traitement ciblé; toutefois, les mécanismes ne sont pas entièrement élucidés¹³. En outre, les CSM ont la capacité de sécréter des exosomes, des vésicules extracellulaires à l’échelle nanométrique qui transportent une cargaison d’ARN non codants, de protéines et de facteurs solubles, qui ont récemment émergé comme un nouveau mécanisme du potentiel thérapeutique des CSM dans diverses maladies¹⁴.

Plus important encore, les CSM ont suscité une attention marquée pour leur potentiel à se différencier en cellules productrices d’insuline (IPC), soit par modification génétique^15,16, soit en utilisant divers facteurs extrinsèques dans les milieux de culture in vitro¹⁷. La période d’induction de l’IPC varie considérablement, car elle dépend du protocole d’induction utilisé et des facteurs extrinsèques utilisés. Le processus de différenciation peut durer de quelques jours à plusieurs mois, et il nécessite une combinaison de facteurs exogènes qui doivent être ajoutés et / ou retirés à différentes étapes. Bon nombre de ces facteurs qui ont été utilisés pour la différenciation pancréatique endocrinienne sont des composés biologiquement actifs dont il a été démontré qu’ils favorisent la prolifération ou la différenciation/néogenèse des cellules β sécrétant de l’insuline et/ou augmentent la teneur en insuline des IPC 18,19,20,21. Il convient de noter ici que les CSM ont également été signalés pour avoir des effets thérapeutiques dans le diabète et ses complications via plusieurs mécanismes, y compris leur sécrétome, ainsi qu’un large éventail d’actions immunomodulatrices 22,23,24.

Dans ce protocole, nous présentons un protocole détaillé par étapes pour l’isolement et la caractérisation des CSAd à partir de graisse épididymale de rat, suivi d’un protocole simple et relativement court pour la génération de CPI à partir d’Ad-MSC.

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Faculté de pharmacie de l’Université britannique en Égypte (BUE), au Caire, en Égypte. Le protocole d’isolement Ad-MSC a été adopté par Lopez et Spencer, avec les modifications¹⁵.

1. Isolement des Ad-MSC des coussinets de graisse épididymiques de rat

1. Utilisez des rats Sprague-Dawley mâles pesant de 250 à 300 g et n’ayant pas plus de 1 mois (deux par isolement). Anesthésier les animaux, puis les euthanasier par luxation cervicale. Vaporisez l’animal euthanasié avec 70% d’éthanol. Excisez la peau et le muscle dans la partie inférieure de l’abdomen, puis retirez les deux testicules pour exposer les coussinets adipeux épididymiques.
2. Coupez doucement les coussinets de graisse épididymale et veillez à ne pas couper les vaisseaux sanguins.
3. Isolez le tissu adipeux entourant l’épididyme, puis placez-le dans une boîte de Pétri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
4. Dans l’armoire de biosécurité, coupez ces coussinets de graisse en petits morceaux à l’aide d’une pince et d’un scalpel. Transférer ces morceaux de tissu adipeux coupés dans un tube centrifuge de 50 mL contenant 10 mL de PBS stérile.
5. Lavez les tissus adipeux hachés 5 fois avec 10 ml de PBS à chaque fois pour éliminer le sang contaminant. Les procédures de lavage suivantes doivent être méticuleusement effectuées.
   1. Ajouter 10 mL de PBS au tissu et bien mélanger pendant 45 s. Ensuite, laissez le tissu se déposer par gravité en maintenant le tube debout pendant 5 minutes pour le séparer en deux couches.
   2. Aspirer le PBS de l’infranageant à l’aide d’une seringue de 10 ml et remplacer par 10 mL de PBS frais pour un autre lavage.
   3. Répétez cette étape de lavage 4 à 5 fois jusqu’à ce que le PBS soit exempt de sang. Cela indique que la plupart, sinon la totalité, du sang est enlevé.
6. Après le lavage, remettre en suspension le tissu adipeux dans 10 mL de solution de collagénase (0,1 % de collagénase de type 1 dans le PBS). Scellez hermétiquement le tube avec du parafilm, puis incubez-le dans un bain-marie (37 °C, 80 tr/min, pendant 45 min) jusqu’à ce que le tissu soit presque homogène.
   REMARQUE: Évitez la digestion complète du tissu (lorsque la solution devient complètement homogène avec la disparition complète de tous les résidus / morceaux de tissu), car elle affecte négativement la culture des cellules par la suite. Habituellement, la digestion prend 30-45 min.
7. Une fois la digestion de la collagénase terminée, vortex le tube pendant 15 s, puis centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Vortex le tube à nouveau pendant 10 s, suivi d’une autre centrifugation de 5 min. Trois couches seront alors observées. Jetez soigneusement la couche d’huile, suivie de la couche aqueuse, sans perturber la pastille de fraction vasculaire stromale (SVF).
   REMARQUE: Retirez le surnageant contenant les adipocytes et la solution de collagénase. Tout d’abord, retirez les adipocytes et la couche d’huile qui l’accompagne avec une pipette de 10 mL pour assurer l’élimination complète des gouttelettes d’huile, puis retirez la couche aqueuse inférieure.
8. Remettre en suspension la pastille de SVF au fond du tube dans 10 mL de solution stérile de BSA (albumine à 1%, solution de fraction V de sérum bovin dans PBS), puis centrifuger le tube pendant 5 min à 300 x g.
9. Après centrifugation, jeter le surnageant et suspendre la pastille de SVF dans 8,5 mL de milieu complet pour les CSA (composé du mélange modifié Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12] de Dulbecco complété par 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine).
10. Cultiver les cellules dans une fiole de^{25 cm 2} à 37 °C sous 5 % de CO_2. Le lendemain, vérifiez les cellules attachées, retirez les cellules suspendues et remplacez le support. Ensuite, changez de média tous les deux jours.
11. Passage des cellules tous les 5-7 jours quand elles sont confluentes à 80% à 90% en utilisant trypsine-EDTA. Utilisez des cellules entre les passages 3 à 5 pour les expériences ultérieures décrites dans ce protocole. Une présentation schématique de toutes les étapes d’isolement est fournie à la figure 1.
    REMARQUE: Habituellement, la puissance de Trypisn-EDTA peut varier entre les différents fournisseurs, alors essayez de minimiser le temps de trypsinisation pour éviter les effets toxiques sur les cellules.

2. Caractérisation des CSAd par immunophénotypage à l’aide d’analyses de cytométrie en flux

1. Au passage 3, divisez les cellules à l’aide de trypsine-EDTA. Laver avec PBS 2 fois, puis compter les cellules avec un hémocytomètre.
2. Incuber 100 000 cellules à 4 °C dans l’obscurité pendant 20 min avec un anticorps monoclonal anti-rat CD90 ou CD105 (marqueurs mésenchymateux) ou CD34 (marqueur hématopoïétique) marqué avec de la fluorescéine-isothiocyanate (FITC).
3. Lavez les cellules et suspendez-les dans 500 μL de tampon FACS. Analyser par cytométrie en flux²⁵.

3. Évaluation du potentiel de différenciation des CSA isolés en diverses lignées mésenchymateuses

1. Différenciation adipogénique
   1. Remettre en suspension les cellules dans un milieu complet (comme décrit à l’étape 1.9.), puis cultiver les cellules à une densité de 3,7 x 10⁴ cellules/puits dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂. Ensuite, changez le média tous les 3 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent presque 100% de confluence, ce qui prend généralement 3 jours.
   2. Lorsque les cellules atteignent la confluence souhaitée, remplacer le milieu de prolifération par le milieu de différenciation adipogénique (composé de milieux LG-DMEM complétés par 10 % de FBS, de 100 U/mL de pénicilline, de 100 μg/mL de streptomycine, de 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et de 2 mM de L-glutamine avec 1x supplément adipogène, fourni avec le kit d’identification fonctionnelle des cellules souches mésenchymateuses) pour induire l’adipogenèse. Ensuite, changez le média tous les 3 jours (0,5 mL/puits). Prenez soin d’effectuer le remplacement du support en douceur afin de ne pas perturber les vacuoles lipidiques.
   3. Après 21 jours, évaluer la différenciation adipogénique par examen microscopique de l’apparence des vacuoles lipidiques et par coloration rouge huile.
   4. Préparez une solution mère d’huile rouge en dissolvant 30 mg de tache rouge huile dans 10 ml d’isopropanol, puis conservez-la pendant au moins 20 minutes à température ambiante. Ensuite, préparez une solution de travail en mélangeant 3 parties de solution mère avec 2 parties d’eau double distillée (ddH₂O), mélangez-les bien et conservez-la pendant 10 minutes à température ambiante, puis filtrez ensuite par papier filtre.
   5. Pour documenter la différenciation adipogénique, lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné neutre à 10% (0,75 ml / puits) pendant 15 min. Après cela, lavez les cellules 2 fois avec du PBS en utilisant 1 mL / puits et incubez les cellules pendant 5 minutes à chaque fois. Il est important d’aspirer complètement le PBS avant d’ajouter la solution de travail Oil Red.
   6. Après le dernier lavage, ajouter la solution de travail Oil Red aux cellules et les incuber pendant 60 min à 37 °C. Ensuite, retirez la solution de coloration et lavez doucement les cellules 2 fois avec DU PBS. Observez les gouttelettes lipidiques colorées au microscope.
2. Différenciation ostéogénique
   1. Ensemencez 7,4 x 10³ cellules/puits (0,5 mL de milieu/puits) dans une plaque de 24 puits et incubez-les à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ en milieu complet (tel que décrit à l’étape 1.9.) pendant 3 jours pour atteindre près de 70 % de confluence.
   2. Induire les cellules avec le supplément ostéogénique (fourni avec le kit) dans un milieu LG-DMEM complété par 10% FBS, 100 U / mL pénicilline, 100 μg / mL streptomycine, 0,25 μg / mL amphotéricine B et 2 mM L-glutamine.
   3. Poursuivre l’induction ostéogénique pendant 21 jours, en changeant le milieu de différenciation tous les 3 jours.
   4. Préparer une solution de travail de la tache Alizarin Red S en dissolvant 200 mg de teinture Alizarin Red S dans 9 mL de ddH₂O, puis ajuster le pH à 4,1-4,3 en utilisant de l’hydroxyde d’ammonium et du HCl. Ensuite, augmentez le volume à 10 mL par ddH₂O. Ensuite, éliminez les précipités par filtration à l’aide de papier filtre.
   5. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné à 10% (0,75 mL / puits) pendant 15 min. Ensuite, lavez les cellules 2 fois à l’aide de PBS (1 mL / puits). A chaque fois, incuber les cellules pendant 5 min.
   6. Incuber les cellules fixes avec la solution préparée à 2% d’Alizarine-Red S pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C.
   7. Après cela, retirez la solution de coloration, lavez les cellules 2 fois avec ddH₂O et une fois avec PBS, puis observez la matrice extracellulaire riche en calcium colorée pour évaluer la différenciation ostéogénique au microscope.
3. Différenciation chondrogène
   1. Ensemencez 7,4 x 10³ cellules/puits (0,5 mL de milieu/puits) dans une plaque de 24 puits et incubez-les à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ en milieu complet (tel que décrit à l’étape 1.9.) pendant 3 jours pour atteindre près de 70 % de confluence.
   2. Lorsque la confluence souhaitée est atteinte, induire la différenciation chondrogène des cellules avec du DMEM/F12 sans sérum contenant du sélénium insulino-transferrine (ITS), un supplément chondrogène (fourni avec le kit), 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine²¹.
   3. Incuber les cellules avec le milieu chondrogène pendant 21 jours, tout en changeant le milieu de différenciation chondrogène tous les 3 jours.
   4. Préparez une solution de travail de teinture Alcian Blue 8GX comme suit: Tout d’abord, préparez une solution d’acide acétique glacial à 3% dans ddH₂O en ajoutant 3 mL d’acide acétique glacial à 97 mL de ddH₂O. Ensuite, préparez une solution de travail de teinture Alcian Blue 8GX en mélangeant 0,1 g dans 100 mL de solution d’acide glacial à 3% et éliminez les précipités par filtration à l’aide de papier filtre.
   5. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné à 10% (0,75 mL / puits) pendant 15 min. Ensuite, lavez les cellules 2 fois à l’aide de PBS (1 mL / puits). A chaque fois, incuber les cellules pendant 5 min.
   6. L’étape suivante consiste à incuber les cellules de la teinture Alcian Blue 8GX préparée à 0,1% dans de l’acide acétique glacial à 3% pendant 60 min à 37 °C. Lavez les cellules colorées 2 fois avec ddH₂O et une fois avec PBS, puis observez les protéoglycanes sulfatés colorés au microscope.

4. Différenciation des Ad-MSC en IPC

1. Au passage 3, divisez les Ad-MSC en utilisant Trypsin-EDTA. Tout d’abord, retirez le milieu, puis lavez les cellules tout en restant attachées dans la fiole de culture avec 5 mL de PBS. Ensuite, ajoutez 5 mL de trypsine-EDTA dans la fiole de 75 cm² et incubez à 37 °C pendant 3 à 10 min.
   REMARQUE: Essayez d’induire les cellules aux premiers passages, généralement entre P3 et P5, car les passages tardifs affectent négativement les propriétés et les capacités de différenciation des cellules^17,24.
2. Ensuite, inspectez les cellules pour le détachement et pour être une suspension à cellule unique. Ajouter 5 mL de milieu DMEM/F12 complet à la fiole pour inhiber l’action de la trypsine. Recueillez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube de 15 mL, puis ajoutez 5 mL supplémentaires de milieu DMEM/F12 complet au tube.
3. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 2 min pour granuler les cellules.
4. Lavez les cellules une fois avec du PBS, centrifugez à nouveau à 300 x g pendant 2 min, puis remettez en suspension la pastille de cellule dans 3 à 5 mL de milieu DMEM/F12 complet.
5. Comptez les cellules à l’aide d’un colorant d’exclusion bleu trypan et d’un hémocytomètre.
6. Ensuite, ensemencez les cellules dans des plaques de 6 puits (1 x 10⁶ cellules / plaque) et une plaque de 12 puits (pour le test GSIS; 1 x 10⁶ cellules / plaque) et incubez dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO₂ dans un milieu complet (comme décrit à l’étape 1.9.) pendant 3 jours pour atteindre près de 90% de confluence.
7. Le jour de l’induction, retirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS, puis pré-induisez les cellules pendant 2 jours par un milieu de pré-induction (DMEM/F12 complété par 10% fbS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 2 mM de L-glutamine, 10 mM de nicotinamide [NA] et 1mM de β-mercaptoéthanol [β-ME]).
8. Induire les cellules pendant 1 jour supplémentaire en utilisant un DMEM à haute teneur en glucose (HG-DMEM, 4,5 g / L de glucose) complété par 2,5% FBS, 100 U / mL pénicilline, 100 μg / mL streptomycine, 0,25 μg / mL amphotéricine B, 2 mM L-glutamine, 10 mM NA et 1mM β-mercaptoéthanol. Collecter des pastilles cellulaires à la fin de cette étape (cellules D3 désignées dans ce protocole).
9. Incuber les cellules pendant 7 jours supplémentaires dans le milieu d’induction de différenciation finale composé de HG-DMEM complété par 2,5% de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 2 mM de L-glutamine, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoéthanol et 10 nM d’exendine-4.
10. À la fin de la période spécifiée, recueillir les pastilles cellulaires (nommées Final dans ce protocole) et évaluer la différenciation réussie des cellules par coloration DTZ et test GSIS, comme suit dans ce protocole.
11. Évaluez les IPC générés en suivant les étapes 5 et 6 ci-dessous.

5. Coloration à la dithizone

1. Préparer la solution mère de teinture de dithizone (DTZ) comme suit : Dissoudre complètement 25 mg de DTZ dans 2,5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO), diviser en aliquotes et conserver à −20 °C dans l’obscurité jusqu’à utilisation.
2. Pour la coloration, préparer une solution de travail 1:100 (volume/volume) en diluant la solution mère dans un milieu de culture complet (HG-DMEM complété par 5% FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine). Ensuite, filtrez la solution de travail à travers un filtre à seringue de 0,2 μm.
3. Ensuite, pour les cellules de culture de coloration DTZ spécifiées dans une plaque de 6 puits et, après avoir aspiré le milieu de culture, lavez les cellules une fois avec DU PBS, puis ajoutez 2 mL de solution de travail DTZ dans chaque puits. Incuber pendant au moins 2 h à 37 °C dans l’incubateur à CO₂ .
4. Lavez soigneusement les cellules 2 fois avec PBS. Après le dernier lavage, ajouter 2 mL de PBS dans chaque puits. Ensuite, observez les IPC tachés de rouge cramoisi sous un microscope inversé. Utilisez des Ad-MSC non induits initialement cultivés dans un milieu de croissance complet (10% FBS - DMEM / F12) comme contrôle.

6. Expression génique des marqueurs β cellules par RT-qPCR

1. Extraction de l’ARN
   1. Après différenciation, recueillir les pastilles cellulaires et les conserver à −80 °C jusqu’à leur utilisation. Suspendre chaque pastille cellulaire (dérivée des six puits d’une plaque de 6 puits regroupée) dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN de thiocyanate de guanidium dans un tube sans nucléase de 1,5 mL, avec pipetage de haut en bas plusieurs fois. Incuber les échantillons lysés à température ambiante pendant 5 min pour permettre une dissociation complète des complexes nucléoprotéiques.
   2. Ajouter 200 μL de chloroforme pour 1 mL de réactif d’extraction d’ARN et boucher solidement les tubes pour les serrer vigoureusement à la main pendant 15 s. Ensuite, incuber pendant 3 min à température ambiante.
   3. Centrifuger les échantillons à 13 800 x g pendant 15 min à 4 °C. Cela conduira à la séparation du mélange en une phase chloroforme inférieure, une phase interphase et une phase aqueuse supérieure incolore, l’ARN restant dans la phase aqueuse.
   4. Placez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube, tout en évitant soigneusement de toucher l’interphase.
   5. Ajouter 600 μL d’isopropanol à 100% à la phase aqueuse (volume 1:1), puis bien mélanger les échantillons par inversion 25 fois, et incuber à température ambiante pendant 10 min.
   6. Centrifuger les échantillons à 18 800 x g pendant 30 min à 4 °C. L’ARN précipité forme une petite pastille en forme de gel du côté du tube.
   7. Retirez le surnageant et lavez les granulés avec 1 mL d’éthanol glacé à 80 %. Après avoir ajouté l’éthanol, effectuez lentement un pipetage multiple de la pastille d’ARN pendant 10 s.
   8. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 9 600 x g à 4 °C. Jetez le surnageant et laissez sécher les pastilles d’ARN à l’air libre pendant 5 à 10 minutes.
   9. Après séchage, dissoudre les pastilles d’ARN dans 25 à 100 μL d’eau sans RNase (selon la taille initiale de la pastille) en pipetant plusieurs fois de haut en bas jusqu’à la solubilisation complète dans des tubes sans nucléase de 1,5 mL. Évitez le séchage excessif de la pastille d’ARN.
      REMARQUE: Habituellement, la pastille devient transparente lorsqu’elle sèche. Cependant, une fois qu’il est clair, remettez-le rapidement en suspension pour éviter une sécheresse excessive de la pastille.
   10. Quantifier l’ARN en déterminant les densités optiques (OD) à 260 nm et 280 nm, en utilisant de l’eau sans nucléase comme blanc.
   11. Assurez-vous que les échantillons ont OD260/OD280 = 1,8-2,0.
2. Synthèse de l’ADNc
   1. Synthétisez l’ADNc à partir de l’ARN total isolé à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc.
   2. Effectuer la réaction de synthèse de l’ADNc selon les instructions du fabricant. Dans un tube PCR de 200 μL, ajouter un volume de solution d’ARN contenant 0,5 μg d’ARN total au mélange maître de réaction présenté dans le tableau 1.
   3. Après avoir ajouté l’ARN au mélange maître, entrez le mélange par un programme de cycle de 50 °C pendant 30 min pendant un cycle, suivi d’un cycle d’inactivation de 95 °C pendant 2 min, à l’aide d’un cycleur thermique.
   4. Diluer l’ADNc à l’aide d’eau sans nucléase jusqu’à une concentration finale de 2 ng/μL. Conserver à −20 °C pour une RT-qPCR ultérieure.
3. RT-qPCR utilisant SYBR Green Master Mix
   1. Effectuer la réaction RT-qPCR pour chaque gène cible à l’aide d’un modèle d’ADNc selon le mélange de réactions présenté dans le tableau 2. Faites toutes les mesures en trois exemplaires.
   2. Les ensembles d’amorces utilisés sont présentés dans le tableau 3. Effectuez toutes les procédures RT-qPCR sur la glace.
   3. Effectuez la réaction RT-qPCR à l’aide d’une machine PCR en temps réel sur les paramètres du programme par défaut. Les conditions de cycle thermique comprenaient une dénaturation initiale de 95 °C pendant 10 min, suivie de 45 cycles de dénaturation (95 °C, 15 s) et d’un recuit/extension combiné (60 °C, 1 min).
   4. Déterminer les valeurs C_t et détecter les niveaux d’expression conformément à ^2-ΔΔCt, avec β-actine comme contrôle interne.

Tableau 1 : Volumes de mélange maître de synthèse d’ADNc.

Tableau 2 : Mélange réactionnel RT-qPCR.

Tableau 3 : Séquences d’amorces avant et arrière.

7. Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose

1. Préparation du tampon de bicarbonate de Ringer (KRB) de Kreb
   1. Préparez la solution tampon de bicarbonate de Ringer (KRB) de Kreb avec des concentrations de glucose de 2 mM (faible teneur en glucose) et de 20 mM de glucose (glucose élevé) pour le test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). Les composants utilisés pour la préparation du tampon KRB sont donnés dans le tableau 4.
   2. Ajuster le pH du tampon à l’aide de 1 N HCl à environ 7,25-7,35 (c.-à-d. 0,1-0,2 unités en dessous du pH souhaité de 7,4, car il peut augmenter pendant la filtration).
   3. Ajouter l’albumine sérique bovine (BSA) fraîchement à une concentration de 0,1 % (poids/volume).
   4. Ajouter du glucose par la suite (18 mg pour 50 mL de KRB pour préparer le tampon KRB à faible teneur en glucose de 2 mM, et 180 mg pour 50 mL de KRB pour préparer le tampon KRB à haute teneur en glucose de 20 mM).
   5. Stériliser les tampons LG et HG KRB préparés par filtration à travers un filtre à seringue de 0,2 μm pour être prêt pour le test GSIS.
2. Essai GSIS
   1. Initialement, ensemencez 1 x 10⁵ cellules / puits dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits et induisez ces cellules en utilisant exactement le même protocole d’induction de différenciation.
   2. À la fin du protocole d’induction, lavez doucement les IPC générés (en plaque) 2 fois avec PBS et une fois avec LG-KRB.
   3. Ensuite, incuber les IPC avec 300 μL de LG-KRB/puits pendant 1 h, puis jeter ce tampon.
   4. Ensuite, incubez les IPC avec 300 μL de tampon KRB de 2 mM (LG) ou 20 mM (HG) pendant 1 h supplémentaire. À la fin de la période d’incubation, prélever le surnageant et le conserver à −80 °C pour le test d’insuline sécrété ultérieur à l’aide d’un kit ELISA commercial et en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE: Essayez d’être aussi doux que possible lors de l’aspiration ou de l’ajout du tampon PBS et KRB lors de l’exécution du test GSIS.

Tableau 4 : Composants utilisés pour la préparation du tampon KRB.

8. Analyse statistique

1. Exprimer toutes les données en moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM). Toutes les comparaisons ont été effectuées à l’aide de l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) et du test post-hoc de Tukey à l’aide d’un logiciel statistique. Les résultats avec des valeurs de p **p ≤ 0,01 et *p ≤ 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs.

Isolement et caractérisation des Ad-MSC
Comme le montre la figure 2, les cellules isolées du tissu adipeux ont montré une population hétérogène de cellules arrondies et ressemblant à des fibroblastes à partir du jour suivant de l’isolement (figure 2A). 4 jours après l’isolement, les cellules fibroblastiques ont commencé à augmenter en nombre et en taille et à croître en tant que population homogène au passage 1 (Figure 2B, C). Ces cellules ont continué à se développer en tant que cellules de type fibroblastique adhérentes au plastique, comme indiqué jusqu’au passage 3, remplissant le premier critère des caractéristiques du CSM (figure 2D). Ces Ad-MSC ont montré de très bonnes caractéristiques de culture, et ce protocole s’est avéré être un protocole pertinent, facile et relativement rapide pour isoler les Ad-MSC des coussinets de graisse épididymiques.

L’étape suivante consistait à caractériser les Ad-MSC isolés. Selon ISCT, les CSM devraient suivre les trois critères d’adhérence plastique, d’expression des CD mésenchymateux avec un manque de marqueurs hématopoïétiques et de la capacité de se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Comme le montre la figure 3A, l’analyse par cytométrie en flux a montré que la plupart de ces cellules exprimaient CD90 et CD105 (76,4 % et 73,6 %, respectivement). Pendant ce temps, ils étaient presque négatifs pour le CD34 (0,1 %).

De plus, lors de l’induction de la différenciation de ces cellules, elles ont montré la capacité de se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Comme le montre la figure 3B (panneau supérieur), les adipocytes ont montré une coloration rouge huile des vacuoles lipidiques par rapport aux cellules non induites de contrôle. Les ostéocytes ont montré une coloration rouge Alizarine caractéristique (Figure 3B, panneau du milieu) par rapport aux cellules témoins. Enfin, les cellules induites par les chondrocytes ont montré une coloration bleue de la matrice extracellulaire par rapport aux cellules témoins non induites (Figure 3B, panneau inférieur).

Ces données indiquent clairement que les cellules isolées du tissu adipeux présentent non seulement de bonnes caractéristiques de culture, mais présentent également tous les critères proposés pour les CSM.

Différenciation des Ad-MSC en cellules productrices d’insuline (IPC)
Comme le montre la figure 4A, nous avons utilisé un protocole relativement simple et court afin de différencier les Ad-MSC en IPC. Après l’induction de la différenciation, les IPC induits ont été évalués de plusieurs manières. Les cellules induites ont montré des changements morphologiques marqués. Comme le montre la figure 4B (panneau supérieur), les cellules induites ont montré une morphologie arrondie en forme de grappe par rapport à la morphologie fibroblastique normale des CSA ad-MSC. Fait intéressant, lors de la coloration avec du dithizone, ces grappes ont montré une tache pourpre, qui est une caractéristique des granules de zinc de la tache à cellules β (Figure 4B, panneau inférieur).

Par la suite, les IPC générés ont été génétiquement évalués pour l’expression des marqueurs spécifiques des cellules β par rapport aux cellules témoins non induites. Comme le montre la figure 5A-E, les cellules induites ont pu exprimer divers marqueurs spécifiques β cellules, indiquant leur capacité à générer des IPC. Quant à FOXA2 - un marqueur endodermique définitif (comme le montre la figure 5A)-, il a été fortement exprimé à la différenciation D3 par rapport au contrôle, atteignant près de 30 fois puis diminuant à seulement 10 fois le contrôle dans les cellules différenciées finales (D3: 28,37 ± 0,88; Finale: 12.10 ± 1.27; p < 0,05). Quant à Pdx-1 (qui est considéré comme un marqueur précoce des cellules β), il a été élevé à la fois dans les cellules différenciées D3 et finales, atteignant près de 20 fois par rapport aux cellules témoins non induites (D3: 22,39 ± 5,14; Finale: 17,13 ± 0,342; p < 0,05; Figure 5B). En ce qui concerne les autres marqueurs β cellules, à savoir NKX6.1, MafA et insuline-1 (Ins1), ils ont tous montré une élévation à partir de D3 jusqu’à la différenciation finale, atteignant près de 8 fois, 12 fois et 300 fois, respectivement, par rapport aux cellules non induites de contrôle (NKX6.1: D3: 1,94 ± 0,86, Final: 7,97 ± 1,34, p<0,05; MafA: D3: 6,59 ± 0,4, Finale: 11,54 ± 2,40, p < 0,05; et Ins1: D3: 27,29 ± 20,27, Finale: 318,20 ± 76,09, p < 0,05) (Figure 5C-E). Cela indique que ces Ad-MSC peuvent se différencier en IPC exprimant des marqueurs β cellules.

Enfin, ces cellules ont été évaluées pour la sécrétion d’insuline lorsqu’elles étaient confrontées à des concentrations croissantes de glucose. Comme le montre la figure 5F, l’insuline sécrétée dans le surnageant des IPC induits lorsqu’elle était confrontée à un défi avec 20 mM de glucose était significativement plus élevée que celle sécrétée lorsque les cellules étaient confrontées à un défi de 2 mM de glucose (HG: 390 pg / mL ± 33 pg / mL; LG : 234 pg/mL ± 32 pg/mL, p < 0,05 ; Figure 5F)

Ces données ont confirmé que le protocole utilisé a réussi à différencier les Ad-MSC en IPC, ce qui a été confirmé génétiquement et fonctionnellement.

Figure 1 : Présentation schématique des étapes du protocole utilisé pour l’isolation et la caractérisation des Ad-MSC. Généré par Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Photomicrographies montrant les CSA isolés. (A) Des cellules isolées présentant une morphologie semblable à celle des fibroblastes adhérents au plastique commencent à apparaître le lendemain de l’isolement. (B) Au fil du temps, ces Ad-MSC adhérents (avec une morphologie semblable à celle des fibroblastes) prolifèrent et augmentent en nombre, atteignant une population plus homogène de fibroblastes dans (C) P1 et (D) P3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation des CSAd. (A) L’analyse cytométrique en flux des CSAd montre que ces cellules sont presque négatives pour cd34 (panneau supérieur), tandis que la majorité des cellules expriment CD90 et CD105 (panneau inférieur). Les CSDD peuvent se différencier en trois lignées mésenchymateuses, à savoir (B) les adipocytes (où les gouttelettes d’huile sont colorées par le rouge d’huile), (C) les ostéocytes, colorés par le rouge alizarine, et (D) les chondrocytes, colorés par le bleu Alcian (par rapport aux cellules non induites témoins). Contrôle : cellules non induites, Diff : cellules différenciées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Différenciation des Ad-MSC en IPC. (A) Présentation schématique du protocole de différenciation utilisé pour générer des IPC à partir d’Ad-MSC, ainsi que des photomicrographies pour les cellules à chaque étape de l’induction de la différenciation vers les IPC. Lors de la différenciation, les cellules perdent leur morphologie fibroblastique et ont tendance à s’agréger en formant des grappes, qui ont tendance à se détacher et à se développer dans des milieux en suspension. (B) Les photomicrographies montrent des Ad-MSC et des IPC de contrôle générés par le protocole ci-dessus montrant des changements morphologiques de grappes rondes (panneau de droite) par rapport à la morphologie de type fibroblaste des Ad-MSC non induits (panneau de gauche), soit non colorés (panneau supérieur), soit colorés DTZ (panneau inférieur).
Contrôle: cellules non induites; IPC: cellules productrices d’insuline; NA: nicotinamide; β-ME: bêta-mercaptoéthanol; D3 : Cellules induites au jour 3 lors de l’induction de la différenciation vers les IPC ; D10: IPC différenciés finaux à la fin du protocole d’induction; Ex-4 : exendine-4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Niveaux d’expression relatifs des marqueurs β cellules et GSIS pour les IPC. Niveaux d’expression relatifs par qRT-PCR pour (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA et (E) Ins-1. (F) Niveaux d’insuline sécrétée dans le surnageant lors de la contestation des IPC générés avec 2mM de glucose (LG) ou 20mM de glucose (HG). Contrôle : Ad-MSC non induits, Jour-3 : cellules différenciées collectées à D3 ; Finale: IPC différenciés finaux; LG: faible taux de glucose; HG: glucose élevé. a: la moyenne est différente du contrôle à p < 0,05; b: la moyenne est différente du jour 3 à p < 0,05; *: la moyenne de LG est différente de HG à p < 0,05; la comparaison a été effectuée à l’aide d’un test t d’échantillons indépendants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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