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Medicine

使用台式流变仪快速表征气道粘液的粘弹性

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63876

Summary

粘液的粘弹性在粘膜纤毛清除中起关键作用。然而,传统的粘液流变技术需要复杂且耗时的方法。本研究为台式流变仪的使用提供了详细的方案,该流变仪可以快速可靠地进行粘弹性测量。

Abstract

在粘膜阻塞性肺疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化)和其他呼吸系统疾病(例如病毒/细菌感染)中,高脚杯细胞分泌过多、气道脱水、氧化应激和细胞外 DNA 的存在改变了粘液的生物物理性质。先前的研究表明,痰粘弹性与肺功能相关,影响痰流变学的治疗(例如,粘液溶解剂)可以产生显着的临床益处。通常,非牛顿流体的流变测量采用复杂、耗时的方法(例如,平行/锥板流变仪和/或微珠颗粒跟踪),需要大量的培训来执行测定和解释数据。该研究测试了Rheomuco的可靠性,再现性和灵敏度,Rheomuco是一种用户友好的台式设备,旨在使用剪切应变扫描的动态振荡进行快速测量,以在5分钟内为临床样品提供线性粘弹性模量(G',G“,G*和棕褐色δ)和凝胶点特性(γc和σc)。使用不同浓度的粘液模拟剂、8 MDa 聚环氧乙烷 (PEO) 和传统的本体流变测量来验证设备性能。然后以一式三份测量结果评估从插管哮喘持续状态(SA)患者身上采集的临床分离株,测量值之间的变异系数为<10%。在 SA 粘液上使用强效粘液还原剂 TCEP 的 离体 状态导致弹性模量降低 5 倍,并且总体上向更“液体样”的行为(例如,较高的棕褐色δ)转变。总之,这些结果表明,经过测试的台式流变仪可以在临床和研究环境中可靠地测量粘液粘弹性。总之,所描述的方案可用于在现场探索粘液活性药物(例如,rhDNase,N-乙酰半胱氨酸)的影响,以根据具体情况调整治疗,或在新化合物的临床前研究中。

Introduction

粘膜阻塞性气道疾病,包括哮喘、慢性阻塞性肺病 (COPD)、囊性纤维化 (CF) 和其他呼吸系统疾病,如病毒性和细菌性肺炎,是全世界普遍存在的健康问题。虽然每种疾病的病理生理学差异很大,但一个共同的关键特征是粘膜纤毛清除率异常。在健康的肺部,粘液排列在气道上皮上,以捕获吸入的颗粒并提供针对病原体的物理屏障。一旦分泌,由~97.5%的水,0.9%的盐,~1.1%的球状蛋白和~0.5%的粘蛋白组成的气道粘液通过纤毛12的协调跳动逐渐向声门运输。粘蛋白是大的O-连接的糖蛋白, 它们通过 非共价和共价键相互作用,以提供粘液的独特粘弹性,这是有效运输所必需的3。由离子转运改变、粘蛋白展开、静电相互作用、交联或组成变化引起的粘蛋白网络超微结构变化可显著影响粘液粘弹性并损害粘膜纤毛清除率45。因此,鉴定气道粘液的生物物理性质的变化对于了解疾病发病机制和测试新型粘液活性化合物6至关重要。

各种因素可导致肺部异常粘液的产生。在COPD中,由于杯状细胞化生,慢性吸入香烟烟雾会引发粘液分泌过多,以及 通过 囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)通道的下调而引发气道脱水,导致粘液过度浓缩和小气道阻塞78。同样,CF是一种与CFTR基因突变相关的遗传性疾病,其特征在于产生粘稠的粘附粘液,不足以运输89。简而言之,CFTR功能障碍诱导气道表面液体耗竭,聚合物粘蛋白缠结和生化相互作用增加,从而导致慢性炎症和细菌感染。此外,被困在静态粘液中的炎性细胞通过向凝胶基质中加入另一个大分子DNA,进一步加剧了粘液的粘弹性,使气道阻塞恶化5.粘液流变学对肺部整体健康的重要性的最好例子之一是重组人DNFase(rhDNase)在囊性纤维化患者治疗中的例子。首先证明了rhDNase对糜痰的 离体 作用,其显示在几分钟内从粘稠的粘液过渡到流动的液体1011。在CF患者中的临床试验表明,rhDNase吸入降低气道粘液粘弹性可降低肺部恶化的发生率,并改善肺功能和整体患者健康状况121314。因此,旨在促进清除的rhDNase吸入成为CF患者二十多年来的护理标准。使用吸入高渗盐水治疗CF粘液水合观察到类似的临床益处,这与流变学性质的变化相关,并导致粘膜纤毛清除加速和肺功能改善1516。因此,在临床环境中测量粘液粘弹性的快速可靠的方案对于优化治疗方法非常重要。

本文测试的台式流变仪为对粘液/痰液样品进行全面的粘弹性测量提供了一种快速方便的替代方案。该仪器使用具有受控角位移的动态振荡, 通过 一对可调节的平行板(例如,粗糙或光滑的几何形状)提供变形,以测量扭矩和位移,分辨率为15 nNm 和 150 nm,分别为 17。默认的标准化校准与适用于非流变学专家的用户指南相结合,可实现直接测量并降低操作员出错的风险。该器件产生一条应变扫描曲线,该曲线经过实时处理和分析(约5分钟内),并自动提供线性粘弹性(G',G“,G*和棕δ)和凝胶点(γc 和σc)特性(见 表1)。弹性或储能模量(G')描述了样品如何响应应力(即恢复到其原始形状的能力),而粘性或损耗模量(G“)描述了正弦变形的每个周期消散的能量(即,由于分子摩擦而损失的能量)。复数或动态模量(G*)是应力与应变的比值,它描述了响应剪切位移的内力积聚量(即整体粘弹性)。阻尼因子(棕褐色δ)是粘性模量与弹性模量的比值,表示样品耗散能量的能力(即,低棕褐色δ表示弹性主导/固体样行为,而高棕褐色δ表示粘性主导/液体样行为)。对于凝胶点特叉应变(γc)是剪切应变的量度,通过偏转路径与剪切间隙高度的比值计算,此时样品从固体状行为转变为类似液体的行为,并且根据定义,在G' = G“或tan δ = 1的振荡应变下发生。交越屈服应力(σc)是弹性模量和粘性模量交叉的器件所施加的应力量的量度。在健康的痰液中,弹性主导着对应变的机械反应(G'>G”)。在粘膜阻塞性疾病中,G'和G“由于病理性粘液变化而增加171819。该设备的操作简单性便于现场测量,并避免了样品储存/运输/运送到异地设施进行分析的需要,从而避免了时间和冻融对这些生物样品特性的影响。

在这项研究中,使用8种不同浓度(1%-3%)的MDa聚环氧乙烷(PEO)溶液来验证商用台式流变仪(材料表)的测量范围,并将获得的浓度依赖曲线直接与使用传统体积流变仪获得的测量值进行比较(材料表).然后使用支气管镜下从患有哮喘持续状态(SA)的插管患者中采集的粘液来评估流变学测量的可重复性,这是一种极端形式的哮喘急性发作,其特征在于支气管痉挛,嗜酸性粒细胞炎症和粘液对环境或感染因子的过度产生820.在这种情况下,SA患者因严重呼吸衰竭而插管,并且需要ECMO(体外膜肺氧合),因为尽管采用积极的标准哮喘治疗,但无法仅通过机械通气有效安全地支持患者。在临床指征的支气管镜检查肺叶塌陷期间,注意到厚实、透明、顽强的分泌物会阻塞支气管,并使用盐水冲洗液抽吸。收集后,立即从抽吸物中除去多余的盐水,并使用台式装置分析剩余SA样品的粘弹性。用还原剂三(2-羧乙基)盐酸膦(TCEP)处理其他样品等分试样,以确定该方案是否可用于表征 治疗化合物的离体疗效。

结果表明,该协议和台式设备可以在临床环境中有效使用。从PEO浓度依赖性曲线(图1A)确定的流变学特性在测试的台式设备和传统的平行板流变仪之间无法区分(图1B)。SA粘液的一式三份测量是可重复的,G*,G'和G“终点的变异系数为10%,并反映了在该患者病例中临床上明显的粘液粘弹性的实质性异常(图1D)。最后,用TCEP进行 体外 治疗导致G'和G“显着降低,棕褐色δ增加,通过改变粘蛋白网络来证明对治疗的反应(图2)。总之,使用台式流变仪的该方案提供了一种简单有效的方法来评估从诊所获得的粘液样品的粘弹性。这种能力可用于促进精准医疗护理方法,因为临床医生可以在现场测试批准的粘膜活性药物的疗效,这有助于确定替代治疗方案。此外,这种方法可用于临床试验,以检查研究药物的效果。

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Protocol

在本研究中,根据UNC机构审查委员会批准的方案获得知情同意后,在临床指征支气管镜检查期间收集样本。

1. 痰液/粘液的收集和储存

  1. 通过吸痰或支气管镜抽吸收集气道粘液。
    1. 通过自发祛痰收集痰液,或通过吸入 3% 高渗盐水诱导痰液。或者,在支气管镜检查过程中直接从气道抽吸粘液。
    2. 将收集的气道痰/粘液储存在无菌标本杯中。在痰的情况下,在收集后立即从样品中除去多余的唾液。
    3. 将样品放在冰上运输。将运输时间限制在4小时以内。
  2. 在收集时分析样品或储存在-80°C直至处理。
    1. 在储存之前,用正置换移液管或移液管轻轻上下移液三到五次,将粘液均匀化。
    2. 等分样品以≥500μL的体积储存,以确保足够的体积用于实验。
      注意:冷冻和解冻可能会影响样品的粘弹性。仅比较经历过类似冻融循环的样品。

2. 样品制备

  1. 直接移液新鲜和冷冻的痰液/粘液,或使用容积式移液器在等分试样前轻轻上下移液三到五次,使标本均质化。
    注意:对于含有可能影响再现性的厚塞子的样品,均质化非常重要。
  2. 将400-500μL样品等分到单独的微量离心管中。根据需要准备尽可能多的等分试样,以进行重复测量和/或用药理学试剂(例如,rhDNase,N-乙酰半胱氨酸)进行治疗。在测量前,将要在37°C下孵育要测试的等分试样至少5分钟。
  3. 对于药理学药物(可选)的测试,请使用高浓度的储备溶液以防止样品稀释。
    1. 将所需试剂(例如TCEP)的0.4%至10%体积(以尽量减少样品稀释)直接添加到样品上。确保没有化合物滴在管的侧面。
    2. 将样品在37°C下孵育所需的时间长度,以允许化学反应(<1小时以防止粘液的蛋白水解降解)。
    3. 通过每2分钟轻拂微量离心管的底部来混合粘液样品和试剂,以使试剂逐渐渗透到粘液样品中,而不会影响粘蛋白网络(例如,模仿纤毛跳动和粘膜纤毛清除)。比较多种药物试剂时,请确保孵育时间相似。

3. 仪器初始化和校准

  1. 打开机器(材料表)并初始化软件。
  2. 选择 “新建度量”。在 “度量 ID” 下输入示例标识号,在“运算符”下输入 操作员 的名称以继续。在 “注释”下输入其他信息或注释。
  3. 选择一个几何集(即粗糙或光滑的25 mm平行板),并仔细检查大板和小板,以确保板材干净且处于完美状态)。
    注意:原板设计用于大体积(350-500 μL),光滑板设计用于较小体积(250-350 μL)。使用低于或高于推荐值的样品量可能会导致测量不准确。
  4. 将大板牢牢地插入底部讲坛上。
  5. 将小板轻轻插入上讲坛上,然后稍微旋转以锁定板,直到听到“咔哒”声,这表明板已正确夹紧。请注意,上板的自由振荡是正常的。
  6. 等到温度达到37°C目标值。然后,根据软件的提示启动自动校准。
    注:在此过程中,请勿干扰机器或台面。

4. 样品装载

  1. 使用正置换式移液器,在大底板中心的250至500μL样品之间缓慢移液。一旦沉积在板上,粘性样品将采用圆顶形状,而高弹性样品可能需要物理切断(使用解剖剪刀)。
    注意:避免引入气泡。如果需要,用移液器吸头推开残留的气泡。
  2. 通过软件降低承载小板的测量头并观察样品。如果正确加载到底板上,样品将接触并在两个板之间居中。
  3. 为确保样品填充间隙(即,通过扩散到板的边缘),请使用 “减少间隙 ”功能,直到样品不再呈双凹形或与板的边缘对齐。“ 减小间隙” 功能以 0.1 mm 的增量降低测量头,并限制为 7 个增量。
    注意:仔细监测样品并逐步调整间隙以避免溢出。
    1. 如果在七个增量后仍有间隙,请单击“ 重做安装 ”以返回到初始位置并调整样品的位置和/或体积。
    2. 如果间隙极度减小(例如,双凸形),则通过沿上板边缘的圆周运动用刮刀除去多余的样品。确保轻轻修剪多余的样品,以避免剪切应力。
      注意:在此步骤结束时,样品的边缘应与上板的边缘对齐,如用户指南中所示。
  4. 降低保护盖,以避免在振荡过程中意外投射受污染的流体。

5. 启动生物物理测量

  1. 要启动测量,请单击“ 开始分析”。一个完整的周期需要4-7分钟。
    1. 在整个周期内,避免大声说话并触摸设备或工作台。在最初的2分钟内,安静的环境尤为重要。
      注意:在循环过程中,仪器执行标准化的应变扫描测试,该测试由连续的振荡步骤组成。每个步骤都是在恒定幅度和频率(1 Hz)下进行一系列10次振荡,在此期间实时测量相应的扭矩。应变和扭矩信号允许计算复数 (G*)、弹性 (G') 和粘性 (G“) 模量,以及每一步的阻尼比(tan δ)。振荡幅度逐渐增加,这加剧了施加在样品上的变形。

6. 样品去除

  1. 循环完成后,单击“ 下一步 ”抬起测量头并生成样品分析报告。
    注意:对于报告,软件计算记录的数据并自动绘制两条曲线,显示粘性和弹性模量相对于施加到样品上的变形的演变,并显示线性粘弹性状态(即低变形时的平台)(如果存在)。如果未检测到线性状态,则在0.05菌株下提取G',G“,G *和棕褐色δ的值。此外,在tan δ = 1下计算交叉应变和屈服应力(γc 和σc)。每个步骤的数据也以电子表格形式提供,以便进一步分析。
  2. 一旦测量头完全缩回,抬起保护盖,丢弃样品并小心地取下板。使用温水和肥皂对盘子进行清洁和消毒。
    注意:在重复使用之前,请彻底干燥设置的几何形状。

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Representative Results

图1 显示了使用粘弹性控制的浓度依赖性曲线(即聚环氧乙烷(PEO)溶液和哮喘状态(SA)粘液)进行流变测量的准确性和可重复性。在评估的台式流变仪和传统散装流变仪之间,直接比较了8种不同浓度(1%,1.5%,2.5%和3%)下8 MDa PEO的粘弹性特性的测量(材料表)。与SA粘液相比,PEO溶液在整个应变范围内以粘性为主(G“> G'),并且没有表现出交叉,因此呈现出固体样行为。此外,对1.5%PEO溶液和临床SA粘液样品进行的三重测量证实,对于从生物样品中获得的值,线性粘弹性特征(G*,G'和G“)具有高度可重复性(<10%变异系数)。

对 SA 患者肺叶塌陷的观察表明,粘液堵塞可能会使肺部机械通气的能力复杂化,并增加了考虑非标准粘液溶解疗法的可能性。在 图2中,本文描述的方案用于测量用粘液溶解剂处理后粘液的粘弹性性质的变化。虽然NAC已被批准用于COPD和CF,但它被证明具有缓慢的动力学和低效力作为还原剂21。TCEP已被证明在改变粘液22的生物物理性质方面非常有效。TCEP对SA粘液粘弹性的影响在临床环境中使用台式流变仪进行测试。粘液溶解处理导致样品更像流体,复合模量(G *)降低4.6倍,弹性模量(G')降低5.1倍,粘性模量(G“)减少1.9倍,交叉应变(γc)减少3.3倍,交叉屈服应力(σc)减少5.7倍,阻尼比(tan δ)增加2.8倍。

参数 象征 单位 定义 意义
线性粘弹性状态 (LVR) 复模量 G* 线性制度中的代表性粘弹性行为 分子网络的整体抗变形性
G* = σ/γ
弹性模量 G' 材料在线性状态下的弹性 静止时分子结构的刚性,与分子网络刚度有关
→0 : 软
→∞ : 僵硬
粘性模量 G" 线性状态下材料的粘度 当结构在非常低的应变下移动时,能量的不可逆损失
→0 : 纯固体
→∞ : 耗散性
阻尼系数 棕褐色δ 无单元 线性状态下的阻尼因子 能量耗散因子,与分子网络形态有关。任何变化都表明分子性质的变化。
棕褐色δ = G''/G' →0 : 纯固体
=1:脏污/液体过渡
→∞:纯液体
凝胶点 临界或交叉应变 γc  无单元 从凝胶行为切换到流动行为时的应变 凝胶的拉伸性,开始流动或破坏固体所需的总变形
→0 : 脆性
→∞: 灵活
临界或交叉屈服应力 σc 切换到流动行为时的压力 凝胶的强度,开始流动或破坏固体所需的力
→0 : 弱
→∞:强

表 1:通过台式流变仪测量的线性粘弹性模量和凝胶点特性。 该器件使用剪切应变扫描的动态振荡进行快速测量,以在约 5 分钟内提供线性粘弹性(G'、G“、G* 和棕褐色δ)模量和凝胶点特性(γc 和 σc)。提供了参数、符号、单位和测量的简要说明。

Figure 1
图1:PEO溶液和SA粘液的粘弹性特性的测量。 以1%、1.5%、2%、2.5%和3%的浓度制备8 MDa PEO的溶液。在支气管镜检查过程中收获SA粘液。对于使用台式流变仪的测量,使用25 mm粗糙板和500 μL样品。对于使用传统散装流变仪进行的测量,使用20 mm平行光滑板和30 μLPEO溶液。(A)从单周期获得的曲线分析1%,1.5%,2%,2.5%和3%8 MDa PEO,显示蓝色(i)中的弹性模量(G')和红色(ii)的粘性模量(G“)的演变。(B)比较弹性(i)和粘性模量(ii)的曲线,用于增加PEO溶液的浓度,通过台式和传统流变仪在5%的应变下进行分析。(C)曲线显示SA粘液的G'和G“的演变,通过台式流变仪测量。箭头表示交叉应变(γc),表示从软固体到液体样行为的转变D)图表分别显示了线性粘弹性状态(LVR)或5%应变中1.5%PEO(黑条)和SA粘液(灰色条)的(i)G*,(ii)G'和(iii)G“值的三个重复测量值。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2:TCEP处理对SA粘液粘弹性的影响。 在TCEP治疗(TCEP)之前(未处理或NT)和之后分析SA粘液。处理包括将2μL5mM TCEP溶液加入500μL等分试样中(最终TCEP浓度为20μM)。将NT和TCEP处理的样品在37°C下孵育20分钟,并在分析前每2分钟轻拂一次管底混合。(A)来自NT和TCEP处理的SA粘液的曲线显示(i)弹性(G')和(ii)粘性(G“)模量的演变。水平黑色虚线表示线性粘弹性状态 (LVR),垂直黑色虚线表示无法建立 LVR 时的 5% 应变参考。(B)从相应的曲线中得出NT和TCEP处理的粘液的复模量(G*),弹性模量(G'),粘性模量(G'),阻尼比(棕褐色δ),交叉应变(γc)和交叉屈服应力(σc)的比较。进行统计分析,并使用配对 t检验获取p值。所有图形的值都显示为 ±SEM. *p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001,****p < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

粘液独特的粘弹性特性对于维持健康的气道至关重要。内部和外部因素可改变气道粘液的生物物理性质,引起粘膜阻塞性疾病的临床并发症。因此,在评估疾病状态和探索降低粘液粘弹性的疗法时,可以考虑监测粘液粘弹性的变化。20 世纪 80 年代的实证研究表明,使用磁珠流变仪2324 的粘液流变学与气道清除率之间存在很强的相关性。近年来,流变学已经发展到利用几种技术来分析不同尺度的粘液。例如,微流变测定使用微观探针来描述基于磁性或荧光微米级颗粒运动的局部粘液特性。然而,由于该技术利用的样本量较小,因此可能难以获得描述非均质性样本(如痰液)的代表性数据。此外,微流变测定需要高分辨率显微镜,重要的计算技能和耗时的分析,因此不适合广泛的实验室或临床使用。

虽然微流变学和宏观流变学通常不具有可比性,但类似的局限性也适用于长期存在的设备,例如锥形/平行板块流变仪。宏观流变学是使用配备各种尺寸的旋转锥体,板,杯和/或转子的精密仪器进行的,以测量极小的扭矩和位移,直至sub nNm 和子 Å 范围。为了达到如此高的精度,大多数商用流变仪需要在无油、灰尘或噪音的环境中直接连接压缩空气供应和冷却系统,并控制环境温度和湿度,以防止形成伪影。此外,虽然传统的散装流变仪可以通过调整特定变量 测量各种材料,但这些仪器的校准需要花费大量时间,并且需要大量的培训。

相比之下,Rheomuco 台式流变仪专门设计用于测量粘液和痰液的粘弹性,需要一个校准步骤即可在几分钟内进行线性粘弹性和凝胶点测量。该台式设备采用简单明了的标准化协议,无需在仪器校准或流变学数据分析/计算方面进行大量培训,即可快速准确地进行粘弹性测量。该装置的工作原理是测量具有受控角位移的振荡后的扭矩和位移,以产生应变扫描曲线并建立线性粘弹性状态或LVR(对应变的均匀粘弹性响应区域, 如图2A中用水平虚线表示),然后到达样品屈服点。在大多数情况下,痰液样本在LVR范围内超过1%-10%的应变范围。当未检测到LVR时,通常参考5%应变处的值来报告样品的粘弹性特性。没有检测到LVR并不会使测量无效,而是反映样品的性质与大多数样品不同(更具塑性)。该仪器的灵敏度经过优化,以满足靠近粘液的粘性和弹性流体的需求,同时提供对机械噪声的高耐受性,这使其成为临床环境中生物流体研究的理想选择;然而,由于软件参数受限且无法操纵诸如板形状、表面、距离和旋转频率等变量,它可能不适合研究具有极低(例如唾液)或极高(例如煤焦油)弹性或粘性模量的其他粘弹性材料。PEO 8 MDa上的浓度依赖性流变测量(图1)允许估计该设备的灵敏度(即检测下限),其介于8 MDa PEO的0.3%至0.4%或G*的<0.05 Pa之间。然而,由于难以溶解高于3%的PEO浓度,因此无法确定上限。然而,该装置能够报告3%8 MDa PEO的G'和G“,这比SA粘液样品更具粘弹性(与SA相比,G'大约5倍,G大25倍),这表明粘液生物标本的相关动态范围。应该注意的是,为了在振荡期间获得准确的测量结果,必须在没有气泡的情况下将适当体积的样品放置在板的中心。在样品上样过程中,体积不足、气泡和/或偏心放置将导致与板的接触不足,从而导致记录值降低。相反,样品溢出会由于额外的阻力25而产生过大的剪切应力。

本研究描述了如何在收集后立即处理,储存和处理厚粘液样本。痰流变学研究面临的主要挑战之一是这些样品的异质性以及标准化测量方法的发展。痰是一种祛痰物质,通常被唾液污染,唾液中含有细菌和消化酶,可迅速改变粘蛋白网络并影响粘液粘弹性。因此,在收集痰液样本后立即和/或匀浆之前去除唾液至关重要。从本质上讲,粘液具有粘性且难以处理,但是使用正置换移液器有助于在不影响粘蛋白网络的情况下进行均质化,从而实现准确的等分试样制备,并简化样品上样。根据实验的不同,可能不需要样品均质化,但可以最大限度地减少重复之间的变异性。虽然建议在收集后立即处理痰液,但气道粘液在冷冻和解冻后保持独特的生物物理特性。然而,冷冻和解冻会影响样品的整体流变性。因此,只有经历过类似冻融循环的样品才应相互比较。在测试粘膜活性剂的作用时,初始样品均质化对于优化化合物扩散非常重要。 通过 吸入将药物递送到肺部限制了进入靶标(即粘液塞)的体积,但是纤毛的不断跳动与粘膜纤毛运输相结合会产生药物和靶标的一些混合。为了模拟 体内 处理,可以直接将少量药理剂施用于样品,并在整个孵育期间通过定期搅拌逐渐混合。然而,可以研究其他治疗方法(例如,在培养皿中的样品上进行药物雾化)。孵育期间轻柔的搅拌将确保进行性药物渗透,而不会因机械破坏(例如,涡旋或超声处理)而损害粘蛋白网络。目前,TCEP未用于临床环境,但其他粘液活性试剂,如NAC,rhDNase,P-2119,ARINA-1和PAAG正在研究各种粘膜阻塞性疾病21262728。为了进行概念验证,已经证明该协议可用于检测哮喘粘液对TCEP治疗的显着变化。通过用还原剂处理产生更像液体的粘液,从较低的线性粘弹性和凝胶点标记物中可以明显看出,这表明清除能力有所改善。虽然rhDNase在CF中产生了巨大的临床益处,但它通常不用于其他粘膜阻塞性疾病,可能是由于细胞外DNA浓度长期降低。然而,在急性病毒和细菌感染期间,强烈的炎症反应可暂时导致细胞外DNA浓度高并降低气道清除率。因此,根据具体情况对rhDNase疗效进行快速 离体 检测可以为治疗病毒和细菌诱发的肺炎提供指导。在由呼吸道病毒SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行中,这可能特别有价值。

综上所述,所述装置提供了可行、快速、准确的流变测量。这些特征为研究和监测气道疾病的状态以及测试新型粘液活性化合物的作用提供了潜力。测量的快速性和简单性允许在不引起与冷冻和/或长期储存或运输的时间效应相关的并发症的情况下进行测定,同时使这些测定在各种环境中可行。最终,可以探索这种方法,从一组选项中选择个性化疗法,从而允许实时定制患者治疗。

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Disclosures

没有

Acknowledgments

本文得到了Vertex Pharmaceuticals(Ehre RIA奖)和CFF支持的研究EHRE20XX0的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Pistons Tips Gilson CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3 TA Instruments DHR-3 Bulk Rheometer manufactured
by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software GraphPad Prism GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube Costar 3621
Peltier plate TA Instruments Temperature control system manufactured
by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide Sigma 372838 8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette Gilson M1000 Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco Rheonova Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries Rheonova D-1811-007 25mm Diameter
Rough Upper Geometries Rheonova U-1811-007 25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate TA Instruments 20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine Sigma 646547-10X1ML TCEP: Potent reducing agent.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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使用台式流变仪快速表征气道粘液的粘弹性
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Wykoff, J. A., Shaffer, K. M.,More

Wykoff, J. A., Shaffer, K. M., Araba, K. C., Markovetz, M. R., Patarin, J., Robert de Saint Vincent, M., Donaldson, S. H., Ehre, C. Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer. J. Vis. Exp. (182), e63876, doi:10.3791/63876 (2022).

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