Summary
Slimets viskoelastiske egenskaber spiller en kritisk rolle i mucociliær clearance. Imidlertid kræver traditionelle slimrologiske teknikker komplekse og tidskrævende tilgange. Denne undersøgelse giver en detaljeret protokol til brug af et benchtop reometer, der hurtigt og pålideligt kan udføre viskoelastiske målinger.
Abstract
Ved slimhindestruktive lungesygdomme (f.eks. astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, cystisk fibrose) og andre luftvejssygdomme (f.eks. virale/bakterielle infektioner) ændres slimets biofysiske egenskaber ved bægercellehypersekretion, luftvejsdehydrering, oxidativ stress og tilstedeværelsen af ekstracellulært DNA. Tidligere undersøgelser viste, at sputumviskoelasticitet korrelerede med lungefunktionen, og at behandlinger, der påvirker sputumreologi (f.eks. Mucolytika), kan resultere i bemærkelsesværdige kliniske fordele. Generelt anvender reologiske målinger af ikke-newtonske væsker udførlige, tidskrævende tilgange (f.eks. Parallelle / keglepladereometre og / eller mikroperlepartikelsporing), der kræver omfattende træning for at udføre analysen og fortolke dataene. Denne undersøgelse testede pålideligheden, reproducerbarheden og følsomheden af Rheomuco, en brugervenlig stationær enhed, der er designet til at udføre hurtige målinger ved hjælp af dynamisk svingning med en forskydningsbelastningsfejning for at tilvejebringe lineære viskoelastiske moduler (G', G", G * og tan δ) og gelpunktegenskaber (γc og σc) til kliniske prøver inden for 5 minutter. Enhedens ydeevne blev valideret ved hjælp af forskellige koncentrationer af en slimsimulator, 8 MDa polyethylenoxid (PEO) og i forhold til traditionelle bulkreologimålinger. Et klinisk isolat høstet fra en intuberet patient med status astmaticus (SA) blev derefter vurderet i tredobbelte målinger, og variationskoefficienten mellem målingerne er <10%. Ex vivo brug af et potent slimreducerende middel, TCEP, på SA-slim resulterede i et femdoblet fald i elastisk modul og en ændring i retning af en mere "væskelignende" adfærd generelt (f.eks. Højere tan δ). Tilsammen viser disse resultater, at det testede benchtop reometer kan foretage pålidelige målinger af slimviskoselasticitet i kliniske og forskningsmæssige omgivelser. Sammenfattende kan den beskrevne protokol bruges til at undersøge virkningerne af mukoaktive lægemidler (f.eks. rhDNase, N-acetylcystein) på stedet for at tilpasse behandlingen fra sag til sag eller i prækliniske undersøgelser af nye forbindelser.
Introduction
Muco-obstruktive luftvejssygdomme, herunder astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), cystisk fibrose (CF) og andre luftvejssygdomme, såsom viral og bakteriel lungebetændelse, er udbredte sundhedsmæssige bekymringer over hele verden. Mens patofysiologien varierer meget mellem hver tilstand, er et fælles nøgletræk unormal mucociliær clearance. I sunde lunger linjer slim luftvejsepitelet for at fange indåndede partikler og tilvejebringe en fysisk barriere mod patogener. Når det er udskilt, transporteres luftvejsslim, der består af ~ 97,5% vand, 0,9% salt, ~ 1,1% kugleformede proteiner og ~ 0,5% muciner, gradvist mod glottis ved den koordinerede slag af cilia 1,2. Slimhinder er store O-bundne glycoproteiner, der interagerer via ikke-kovalente og kovalente bindinger for at tilvejebringe slimets forskellige viskoelastiske egenskaber, hvilket er nødvendigt for effektiv transport3. Ændringer i slimhinnetværkets ultrastruktur forårsaget af ændret iontransport, mucinudfoldning, elektrostatiske interaktioner, tværbinding eller ændringer i sammensætning kan påvirke slimviskosiciteten betydeligt og forringe slimhindeclearance 4,5. Derfor er det afgørende at identificere ændringer i luftvejsslimets biofysiske egenskaber for at forstå sygdomspatogenese og teste nye mukoaktive forbindelser6.
Forskellige faktorer kan føre til produktion af afvigende slim i lungerne. Ved KOL udløser kronisk indånding af cigaretrøg slimhypersekretion som følge af bægercellemetaplasi samt luftvejsdehydrering via nedregulering af cystisk fibrose transmembrankonduktansregulator (CFTR) kanal, hvilket forårsager slimhyperkoncentration og små luftvejsobstruktion 7,8. Tilsvarende er CF, en genetisk lidelse forbundet med mutationer i CFTR-genet, karakteriseret ved produktion af tyktflydende, klæbende slim, der er utilstrækkeligt til transport 8,9. Kort fortalt inducerer CFTR-dysfunktion væskeudtømning af luftvejene, polymer mucinindfiltring og øgede biokemiske interaktioner, hvilket resulterer i kronisk inflammation og bakterielle infektioner. Derudover forværrer inflammatoriske celler fanget i statisk slim yderligere slimets viskoelasticitet ved at tilføje et andet stort molekyle, DNA, i gelmatrixen, hvilket forværrer luftvejsobstruktion5. Et af de bedste eksempler på slimreologiens betydning for lungernes generelle sundhed er tilvejebragt af eksemplet med rekombinant human DNFase (rhDNase) til behandling af cystisk fibrose patienter. Virkningerne af rhDNase blev først demonstreret ex vivo på ekspektoreret sputum, som viste en overgang fra viskøst slim til en flydende væske inden for få minutter10,11. Kliniske forsøg med CF-patienter viste, at reduktion af luftvejsslim viskoelasticitet med rhDNase-indånding reducerede hastigheden af lungeforværringer og forbedrede lungefunktionen og det generelle patienttrangid 12,13,14. Som følge heraf blev rhDNase-indånding med det formål at lette clearance standarden for pleje af CF-patienter i mere end to årtier. Lignende kliniske fordele blev observeret ved anvendelse af inhaleret hypertonisk saltvand til slimhydrering i CF, hvilket korrelerede med ændringer i reologiske egenskaber og resulterede i mucociliær clearance acceleration og forbedret lungefunktion 15,16. Derfor er en hurtig og pålidelig protokol til måling af slimviskoselastiske egenskaber i kliniske omgivelser vigtig for at optimere terapeutiske tilgange.
Det bordreometer, der testes heri, er et hurtigt og bekvemt alternativ til at udføre omfattende viskoelastiske målinger af slim/sputumprøver. Ved hjælp af dynamiske svingninger med kontrolleret vinkelforskydning tilvejebringer instrumentet deformation via et par justerbare parallelle plader (f.eks. Ru eller glatte geometrier) til måling af drejningsmoment og forskydning med opløsninger på 15 nN. m og 150 nm, henholdsvis17. En standard standardiseret kalibrering kombineret med brugerretningslinjer tilpasset ikke-reologispecialister giver mulighed for enkle målinger og reducerer risikoen for operatørfejl. Enheden producerer en belastningsfejningskurve, der behandles og analyseres i realtid (inden for ~ 5 minutter) og automatisk giver både lineære viskoelastiske (G', G", G * og tan δ) og gelpunkt (γc og σc) egenskaber (se tabel 1). Det elastiske modul eller lagringsmodulet (G') beskriver, hvordan en prøve reagerer på stress (dvs. evnen til at vende tilbage til sin oprindelige form), mens det viskøse eller tabsmodul (G") beskriver den energi, der spredes pr. Cyklus af sinusformet deformation (dvs. den energi, der går tabt på grund af friktion af molekyler). Det komplekse eller dynamiske modul (G*) er forholdet mellem spænding og belastning, som beskriver mængden af intern kraftopbygning som reaktion på en forskydningsforskydning (dvs. de samlede viskoelastiske egenskaber). Dæmpningsfaktoren (tan δ) er forholdet mellem det viskøse modul og det elastiske modul, hvilket indikerer en prøves evne til at sprede energi (dvs. en lav solbrun δ indikerer en elastisk dominerende / faststoflignende adfærd, mens en høj tan δ indikerer en viskøs dominerende / væskelignende adfærd). For gelpunktskarakteristika er crossover-stammen (γc) målestokken for forskydningsstammen, beregnet ved forholdet mellem afbøjningsvejen og forskydningsgabshøjden, hvor prøven overgår fra en faststoflignende til en væskelignende adfærd og pr. definition forekommer ved svingningsstamme, hvor G' = G" eller tan δ = 1. Crossover-udbyttespændingen (σc) er et mål for mængden af stress, der påføres af den enhed, hvor den elastiske og viskøse moduli krydser. I sund sputa dominerer elasticitet den mekaniske reaktion på belastning (G '> G"). Ved slimhindestruktive sygdomme øges både G 'og G" som følge af patologiske slimændringer 17,18,19. Enhedens operationelle enkelhed letter målinger på stedet og omgår behovet for prøveopbevaring/transport/forsendelse til en offsite-facilitet til analyse, hvorved tids- og fryse-optøningsvirkningerne på disse biologiske prøvers egenskaber undgås.
I denne undersøgelse blev 8 MDa polyethylenoxidopløsninger (PEO) med forskellige koncentrationer (1%-3%) anvendt til at validere måleområdet for et kommercielt bordreometer (Table of Materials), og den opnåede koncentrationsafhængige kurve blev direkte sammenlignet med målinger erhvervet med et traditionelt bulkreometer (Table of Materials) ). Repeterbarheden af reologiske målinger blev derefter vurderet ved hjælp af bronkoskopisk høstet slim fra en intuberet patient, der lider af status astmaticus (SA), en ekstrem form for astmaforværring karakteriseret ved bronkospasme, eosinofil inflammation og slimhyperproduktion som reaktion på et miljø- eller infektiøst middel 8,20 . I dette tilfælde var SA-patienten blevet intuberet for svær respirationssvigt og krævede ECMO (ekstrakorporeal membraniltning) på grund af manglende evne til at støtte patienten effektivt og sikkert med mekanisk ventilation alene på trods af aggressive standard astmabehandlinger. Under en klinisk indiceret bronkoskopi for lobarkollaps blev tykke, klare, vedholdende sekreter noteret for at hindre lobar bronkier og blev aspireret ved hjælp af saltvandsvask. Umiddelbart efter indsamlingen blev overskydende saltvand fjernet fra aspiraten, og de viskoelastiske egenskaber af den resterende SA-prøve blev analyseret ved anvendelse af bordpladeindretningen. Yderligere prøvealikvoter blev behandlet med et reduktionsmiddel, tris (2-carboxylethyl) phosphinhydrochlorid (TCEP), for at afgøre, om denne protokol kunne anvendes til at karakterisere terapeutisk forbindelses effektivitet ex vivo.
Resultaterne viste, at denne protokol og benchtop-enheden kan bruges effektivt i en klinisk indstilling. De reologiske egenskaber bestemt ud fra PEO-koncentrationsafhængige kurver (figur 1A) kunne ikke skelnes mellem den testede stationære enhed og et traditionelt parallelt pladereometer (figur 1B). Tredobbelte målinger af SA-slimet kunne gentages med en variationskoefficient på 10 % for G*-, G-, G- og G-endepunkterne og afspejlede de betydelige abnormiteter i slimviskoselasticitet, der var klinisk synlige i denne patients tilfælde (figur 1D). Endelig resulterede ex vivo-behandling med TCEP i en signifikant reduktion i G' og G" og en stigning i tan δ, hvilket viste lydhørhed over for behandlingen ved ændringer i mucinnetværket (figur 2). Afslutningsvis giver denne protokol ved hjælp af et benchtop reometer en enkel og effektiv tilgang til vurdering af viskoelastiske egenskaber af slimprøver opnået fra klinikken. Denne kapacitet kan bruges til at lette præcisionsmedicinske tilgange til pleje, da klinikere kan teste effekten af godkendte mukoaktive lægemidler på stedet, hvilket kan hjælpe med at identificere alternative behandlingsmuligheder. Derudover kan denne tilgang anvendes i kliniske forsøg til at undersøge virkningerne af forsøgslægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I den foreliggende undersøgelse blev prøver indsamlet under en klinisk indiceret bronkoskopi efter at have opnået informeret samtykke i henhold til en protokol godkendt af UNC Institutional Review Board.
1. Opsamling og opbevaring af sputum/slim
- Saml luftvejsslim via sputumopsamling eller bronkoskopi aspiration.
- Saml sputum enten via spontan ekspektorering eller inducer sputum ved 3% hypertonisk saltvandsindånding. Alternativt aspirerer slim direkte fra luftvejene under en bronkoskopiprocedure.
- Opbevar opsamlet luftvejssputum/slim i sterile prøvekopper. I tilfælde af sputum fjernes overskydende spyt fra prøven straks efter indsamling.
- Anbring prøverne på is til transport. Begræns transporttiden til mindre end 4 timer.
- Prøverne analyseres på indsamlingstidspunktet eller opbevares ved -80 °C, indtil de er forarbejdet.
- Før opbevaring homogeniseres slimet ved forsigtigt at pipettere op og ned tre til fem gange med en positiv forskydningspipette eller pipette direkte ind i mikrocentrifugerørene.
- Aliquot prøverne til opbevaring i mængder ≥500 μL for at sikre tilstrækkelig volumen til forsøg.
BEMÆRK: Frysning og optøning kan påvirke prøvens viskoelastiske egenskaber. Sammenlign kun prøver, der har gennemgået lignende fryse-/optøningscyklusser.
2. Prøveforberedelse
- Pipette frisk og frossen sputa/slim direkte eller homogenisere prøver ved hjælp af en positiv forskydningspipette ved forsigtigt at pipettere op og ned tre til fem gange før alicitatering.
BEMÆRK: Homogenisering er vigtig for prøver, der indeholder tykke stik, der kan påvirke reproducerbarheden. - Aliquot 400-500 μL af prøven i separate mikrocentrifugerør. Forbered så mange alikvoter som nødvendigt til gentagne målinger og/eller behandling med farmakologiske reagenser (f.eks. rhDNase, N-acetylcystein). Inkuber de alikvoter, der skal testes ved 37 °C, i mindst 5 minutter før målingen.
- Til test af farmakologiske agenser (valgfrit) skal der anvendes høje koncentrationer af stamopløsninger for at forhindre prøvefortynding.
- Der tilsættes mellem 0,4 % og 10 % volumen (for at minimere prøvefortyndingen) af det ønskede reagens (f.eks. TCEP) direkte på prøven. Sørg for, at ingen dråbe af forbindelsen forbliver på siden af røret.
- Inkubere prøverne ved 37 °C i den ønskede tid for at muliggøre en kemisk reaktion (<1 time for at forhindre proteolytisk nedbrydning af slimet).
- Bland slimprøven og reagenset ved at svirpe bunden af mikrocentrifugerøret hvert andet minut for at tillade progressiv indtrængning af reagenset i slimprøven uden at gå på kompromis med slimnetværket (f.eks. efterligning af ciliary beating og slimhindeclearance). Når du sammenligner flere lægemiddelreagenser, skal du sikre dig, at inkubationstiden er ens.
3. Initialisering og kalibrering af instrument
- Tænd for maskinen (Table of Materials), og initialiser softwaren.
- Vælg Ny måling. Angiv prøveidentifikationsnummeret under Målings-id og navnet på den operatør, der skal fortsætte, under Operator to continue. Angiv yderligere oplysninger eller kommentarer under Kommentarer.
- Vælg et geometrisæt (dvs. ru eller glatte 25 mm parallelle plader) og inspicer store og små plader omhyggeligt for at sikre, at pladerne er rene og i perfekt stand).
BEMÆRK: Ru plader er designet til store volumener (350-500 μL), og glatte plader er designet til mindre volumener (250-350 μL). Brug af en lavere eller højere prøvevolumen end anbefalet kan forårsage unøjagtige målinger. - Sæt den store plade fast på den nederste prædikestol.
- Indsæt den lille plade forsigtigt på den øverste prædikestol og lås pladen ved let at rotere, indtil du hører et "klik", hvilket indikerer, at pladen er korrekt fastspændt. Bemærk, at fri svingning af den øverste plade er normal.
- Vent, indtil temperaturen når målværdien på 37 °C. Start derefter automatisk kalibrering som bedt om af softwaren.
BEMÆRK: Forstyr ikke maskinens eller bænkens overflade under denne proces.
4. Prøveindlæsning
- Ved hjælp af en positiv forskydningspipette pipetter du langsomt mellem 250 og 500 μL af prøven på midten af den store bundplade. Når de er deponeret på pladen, vil viskøse prøver vedtage en kuppelform, mens meget elastiske prøver kan kræve fysisk afskæring (brug dissekeringssaks).
BEMÆRK: Undgå at indføre luftbobler. Fjern om nødvendigt resterende bobler ved at skubbe væk med en pipettespids. - Sænk målehovedet, der bærer den lille plade via softwaren, og observer prøven. Hvis prøven lægges korrekt på bundpladen, vil den komme i kontakt og være centreret mellem de to plader.
- For at sikre, at prøven udfylder hullet (dvs. ved at sprede sig til pladernes kanter), skal du bruge funktionen Reducer mellemrum, indtil prøven ikke længere er i biconcave form eller er justeret med kanten af pladerne. Funktionen Reducer mellemrum sænker målehovedet i trin på 0,1 mm og er begrænset til syv trin.
BEMÆRK: Overvåg prøven omhyggeligt, og juster afstanden gradvist for at undgå overspild.- Hvis der er et hul tilbage efter syv trin, skal du klikke på Gentag installation for at vende tilbage til startpositionen og justere prøvens position og/eller volumen.
- Hvis afstanden er overordentlig reduceret (f.eks. bikonveks form), fjernes den overskydende prøve med en spatel ved hjælp af en cirkulær bevægelse langs kanten af den øverste plade. Sørg for at trimme den overskydende prøve forsigtigt for at undgå forskydningsspænding.
BEMÆRK: I slutningen af dette trin skal kanten af prøven justeres med kanten af den øverste plade som vist i brugerretningslinjerne.
- Sænk beskyttelsesdækslet for at undgå utilsigtet fremspring af forurenede væsker under svingning.
5. Igangsæt biofysisk måling
- For at starte måling skal du klikke på Start analyse. En fuld cyklus tager 4-7 minutter.
- Undgå at tale højt og røre ved enheden eller bænken i hele cyklussens længde. Et roligt miljø er særligt vigtigt i de første 2 minutter.
BEMÆRK: Under cyklussen udfører instrumentet en standardiseret belastningsfejningstest, som består af successive oscillerende trin. Hvert trin er en serie på 10 svingninger ved konstant amplitude og frekvens (1 Hz), hvor det tilsvarende drejningsmoment måles i realtid. Belastnings- og momentsignalerne muliggør beregning af det komplekse (G*), elastiske (G') og viskøse (G") modul samt dæmpningsforholdet (tan δ) ved hvert trin. Oscillationer øges gradvist i amplitude, hvilket intensiverer deformationen, der pålægges prøven.
- Undgå at tale højt og røre ved enheden eller bænken i hele cyklussens længde. Et roligt miljø er særligt vigtigt i de første 2 minutter.
6. Fjernelse af prøve
- Når cyklussen er afsluttet, skal du klikke på Næste for at hæve målehovedet og generere prøveanalyserapporten.
BEMÆRK: For rapporten beregner softwaren de registrerede data og tegner automatisk to kurver, der viser udviklingen af det viskøse og det elastiske modul i forhold til den deformation, der udøves på prøven, og viser det lineære viskoelastiske regime (dvs. et plateau ved lav deformation), hvis det er til stede. Hvis der ikke påvises noget lineært regime, ekstraheres værdierne for G', G", G* og tan δ ved 0,05 stamme. Derudover beregnes crossover-stammen og udbyttespændingen (γc og σc) ved tan δ = 1. Data leveres også i regneark for hvert trin til yderligere analyse. - Når målehovedet er trukket helt tilbage, skal du hæve beskyttelsesdækslet, kassere prøven og forsigtigt fjerne pladerne. Rengør og desinficer pladerne med varmt vand og sæbe.
BEMÆRK: Tør geometrisættet grundigt inden gentagen brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser nøjagtigheden og repeterbarheden af reologiske målinger ved hjælp af koncentrationsafhængige kurver for viskoelastisk kontrol, dvs. polyethylenoxidopløsning (PEO) og status asthmaticus (SA) slim. Målinger af viskoelastiske egenskaber ved 8 MDa PEO i fem forskellige koncentrationer (1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3%) blev direkte sammenlignet mellem det evaluerede benchtop reometer og et traditionelt bulkreometer (Table of Materials). I modsætning til SA-slim var PEO-opløsninger tyktflydende dominerede (G "> G') i hele stammeområdet og udviste ikke crossover og præsenterede derfor en solid-lignende adfærd. Desuden bekræftede tredobbelte målinger udført på 1,5 % PEO-opløsning og klinisk SA-slimprøve, at lineære viskoelastiske egenskaber (G*, G' og G") var meget repeterbare (<10 % variationskoefficient) for de værdier, der blev opnået fra den biologiske prøve.
Observationen af lobarkollaps hos SA-patienten foreslog, at slimpropper kunne komplicere evnen til mekanisk at ventilere lungerne og øgede muligheden for, at ikke-standardiserede, mucolytiske terapier kunne overvejes. I figur 2 blev protokollen beskrevet heri anvendt til at måle ændringer i slimets viskoelastiske egenskaber efter behandling med et mucolytisk middel. Mens NAC er blevet godkendt til brug med KOL og CF, viste det sig at have langsom kinetik og lav styrke som reduktionsmiddel21. TCEP har vist sig at være yderst effektiv til at ændre de biofysiske egenskaber af slim22. Virkningerne af TCEP på SA slim viskoelasticitet blev testet i en klinisk indstilling ved hjælp af benchtop reometeret. Mucolytisk behandling resulterede i en mere væskelignende prøve med et fald i det komplekse modul (G *) med 4,6 gange, elastisk modul (G') med 5,1 gange, viskøst modul (G") med 1,9 gange, crossover-belastning (γc) med 3,3 gange og crossover-udbyttespænding (σc) med 5,7 gange og en stigning i dæmpningsforholdet (tan δ) med 2,8 gange.
| Zone | Parameter | Symbol | Enhed | Definition | Betydning | ||||
| Lineært viskoelastisk regime (LVR) | Komplekst modul | G* | Pa | Repræsentativ viskoelastisk adfærd i det lineære regime | Samlet modstand mod deformation af det molekylære netværk | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| Elastisk modul | G' | Pa | Materialets elasticitet i det lineære regime | Stivhed af den molekylære struktur i hvile, relateret til molekylær netværksstivhed | |||||
| →0 : blød →∞ : stiv |
|||||||||
| Viskøst modul | G" | Pa | Viskositet af materialet i det lineære regime | Irreversibelt tab af energi, mens strukturen bevæger sig under meget lav belastning | |||||
| →0 : rent fast stof →∞ : dissipativ |
|||||||||
| Dæmpningsfaktor | solbrun δ | Enhedsløs | Dæmpningsfaktor i det lineære regime | Energiafledningsfaktor, relateret til den molekylære netværksmorfologi. Enhver ændring indikerer en ændring i molekylær natur. | |||||
| tan δ= G''/G' | →0 : rent fast stof =1: snavset/flydende overgang →∞ : ren væske |
||||||||
| Gel Point | Kritisk eller crossover-belastning | γc | Enhedsløs | Stamme, når du skifter fra gel til flowadfærd | Gelens strækbarhed, den totale deformation, der er nødvendig for at starte en strøm eller bryde et fast stof | ||||
| →0 : skør →∞ : fleksibel |
|||||||||
| Kritisk eller crossover udbyttestress | σc | Pa | Stress, når du skifter til flowadfærd | Gelens styrke, mængden af kraft, der er nødvendig for at starte en strøm eller bryde et fast stof | |||||
| →0 : svag →∞ : stærk |
|||||||||
Tabel 1: Lineære viskoelastiske moduler og gelpunktsegenskaber målt ved bordreometeret. Enheden udfører hurtige målinger ved hjælp af dynamisk svingning med en forskydningsbelastningsfejning for at tilvejebringe lineær viskoelastisk (G', G", G * og tan δ) moduler og gelpunktegenskaber (γc og σc) inden for ~ 5 minutter. Parametre, symboler, enheder og en kort beskrivelse af målingerne leveres.
Figur 1: Målinger af de viskoelastiske egenskaber ved PEO-opløsninger og SA-slim. Opløsninger af 8 MDa PEO blev fremstillet i koncentrationer 1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3%. SA slim blev høstet under en bronkoskopi procedure. Til målinger ved hjælp af bordreometeret blev der anvendt 25 mm ru plader og 500 μL af prøven. Til målingerne ved hjælp af det traditionelle bulkreometer blev der anvendt 20 mm parallelle glatte plader og 30 μL PEO-opløsninger. Begge målinger blev kørt med en frekvens på 1 Hz. (A) Kurver opnået fra en enkelt cyklus, der analyserede 1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3% 8 MDa PEO, der viser udviklingen af det elastiske modul (G') i blåt (i) og viskøst modul (G") i rødt (ii). (B) Kurver, der sammenligner elastisk (i) og viskøs moduler (ii) for at øge koncentrationerne af PEO-opløsninger, analyseret ved bordplade og traditionelle reometre ved 5% belastning. C) Kurver, der viser udviklingen af G' og G" af SA-slim målt ved hjælp af bordreometeret. Pil angiver crossover-stamme (γc), som betegner en overgang fra blødt fast til væskelignende adfærd. (D) Grafer, der viser tre replikatmålinger af (i) G *, (ii) G 'og (iii) G " værdier for henholdsvis 1,5% PEO (sorte bjælker) og SA slim (grå bjælker) i det lineære viskoelastiske regime (LVR) eller ved 5% belastning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Virkninger af TCEP-behandling på viskoelasticiteten af SA-slim. SA-slim blev analyseret før (ikke-behandlet eller NT) og efter TCEP-behandling (TCEP). Behandlingen bestod i at tilsætte 2 μL 5 mM TCEP-opløsning til 500 μL-alikvoter (endelig TCEP-koncentration på 20 μM). NT- og TCEP-behandlede prøver blev inkuberet i 20 minutter ved 37 °C og blandet ved at svirpe bunden af røret hvert andet minut før analysen. Målingerne blev udført under oscillerende belastning ved en frekvens på 1 Hz. (A) Kurver fra NT- og TCEP-behandlet SA-slim, der viser udviklingen af (i) elastisk (G') og (ii) viskøs (G") moduli. Den vandrette sorte stiplede linje angiver det lineære viskoelastiske regime (LVR), og den lodrette sorte stiplede linje angiver 5% belastningsreferencen i tilfælde af, at en LVR ikke kunne etableres. B) Sammenligning af det komplekse modul (G*), det elastiske modul (G'), det viskøse modul (G), dæmpningsforholdet (tan δ), crossover-stammen (γc) og crossover-udbyttespændingen (σc) for NT- og TCEP-behandlet slim afledt af de tilsvarende kurver. Statistisk analyse blev udført, og p-værdier blev erhvervet ved hjælp af parrede t-tests. Værdier for alle grafer vises som ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Slimets unikke viskoelastiske egenskaber er afgørende for at opretholde sunde luftveje. Interne og eksterne faktorer kan ændre luftvejsslim biofysiske egenskaber, hvilket forårsager kliniske komplikationer, der er karakteristiske for muco-obstruktive sygdomme. Derfor kan overvågning af ændringer i slimviskoselasticitet overvejes under vurderinger af sygdomsstatus og udforskning af terapier, der reducerer slimviskoselasticitet. Empiriske undersøgelser fra 1980'erne viste en stærk sammenhæng mellem slimreologi og luftvejsclearance ved hjælp af magnetiske perlereometre 23,24. I de senere år har reologi udviklet sig til at drage fordel af flere teknikker, der analyserer slim i forskellige skalaer. For eksempel bruger mikrorheologiske assays mikroskopiske sonder til at beskrive lokale slimegenskaber baseret på bevægelsen af magnetiske eller fluorescerende mikrometerstørrelsespartikler. Men fordi denne teknik anvender små prøvevolumener, kan det være vanskeligt at opnå repræsentative data, der beskriver heterogene prøver såsom sputum. Desuden kræver mikrorheologiassays mikroskoper i høj opløsning, betydelige beregningsfærdigheder og tidskrævende analyser og er derfor dårligt egnede til udbredt laboratorie- eller klinikbrug.
Mens mikrorheologi og makrorheologi typisk ikke er sammenlignelige, gælder lignende begrænsninger for veletablerede enheder, såsom kegle / parallelle pladebulktometre. Makrorheologi udføres ved hjælp af præcisionsinstrumenter udstyret med roterende kegler, plader, kopper og / eller rotorer af forskellige dimensioner for at måle ekstremt små drejningsmomenter og forskydninger ned til sub nN. m og sub Å intervaller. For at opnå en så høj præcision kræver de fleste kommercielle reometre en direkte forbindelse med et tryklufttilførsels- og kølesystem i et miljø fri for olie, støv eller støj og med en kontrolleret omgivelsestemperatur og fugtighed for at forhindre artefaktdannelse. Derudover, mens traditionelle bulkreometre kan måle en bred vifte af materialer via justering af specifikke variabler, tager kalibrering af disse instrumenter betydelig tid og kræver omfattende træning.
I modsætning hertil er Rheomuco benchtop reometer specielt designet til at måle de viskoelastiske egenskaber af slim og sputum og kræver et enkelt kalibreringstrin for at udføre lineære viskoelastiske og gelpunktsmålinger inden for få minutter. Denne stationære enhed bruger en ligetil og standardiseret protokol til at producere hurtige og nøjagtige viskoelastiske målinger uden behov for omfattende træning i instrumentkalibrering eller reologisk dataanalyse / beregning. Anordningen fungerer ved at måle drejningsmoment og forskydning efter svingninger med kontrolleret vinkelforskydning for at frembringe en belastningsfejningskurve og etablere et lineært viskoelastisk regime eller LVR (et område med ensartet viskoelastisk reaktion på belastning, angivet med en vandret stiplet linje i figur 2A), inden den når det punkt, hvor prøven giver. I de fleste tilfælde er sputumprøver inden for LVR over belastningsområdet 1% -10%. Når der ikke påvises en LVR, henvises der almindeligvis til værdien ved 5 % belastning for at rapportere om prøvens viskoelastiske egenskaber. Fraværet af en påvist LVR ugyldiggør ikke målingen, men afspejler snarere en prøve, hvis egenskaber er forskellige (mere plastiske) fra de fleste prøver. Følsomheden af dette instrument er optimeret til at matche behovene hos viskøse og elastiske væsker tæt på slim, samtidig med at det giver høj tolerance over for mekanisk støj, hvilket gør det ideelt til undersøgelse af biologiske væsker i kliniske omgivelser; Det er dog muligvis ikke egnet til at studere andre viskoelastiske materialer med ekstremt lavt (f.eks. spyt) eller ekstremt højt (f.eks. kultjære) elastisk eller tyktflydende moduler som følge af begrænsede softwareparametre og manglende evne til at manipulere variabler såsom pladeform, overflade, afstand og rotationsfrekvens. De koncentrationsafhængige reologiske målinger på PEO 8 MDa (figur 1) gjorde det muligt at estimere følsomheden (dvs. den nedre detektionsgrænse) for denne anordning, som er mellem 0,3 % og 0,4 % af 8 MDa PEO eller <0,05 Pa for G*. Der kunne imidlertid ikke fastsættes en øvre grænse på grund af vanskeligheden ved at opløse PEO-koncentrationer på over 3 %. Ikke desto mindre var enheden i stand til at rapportere G 'og G "for 3% 8 MDa PEO, hvilket er mere viskoelastisk end SA-slimprøver (~ 5 gange større G 'og 25 gange større G " sammenlignet med SA), hvilket tyder på et relevant dynamisk område for slimbioprøver. Det skal bemærkes, at for at opnå nøjagtige målinger under svingninger skal et passende volumen af prøven placeres i midten af pladen uden tilstedeværelse af bobler. Under prøvebelastning vil utilstrækkelig volumen, luftbobler og / eller off-center placering skabe utilstrækkelig kontakt med pladerne, hvilket resulterer i lavere registrerede værdier. Omvendt vil prøveoverløb skabe overdreven forskydningsspænding på grund af yderligere trækkraft25.
Denne undersøgelse beskriver, hvordan man behandler, opbevarer og behandler tykke slimprøver umiddelbart efter indsamling. En af de største udfordringer, der konfronterer undersøgelser af sputumreologi, er den heterogene karakter af disse prøver og udviklingen af standardiserede målemetoder. Sputum er et ekspektoreret stof, der ofte er forurenet med spyt, der indeholder bakterier og fordøjelsesenzymer, der hurtigt kan ændre slimnetværket og påvirke slimviskoselasticiteten. Derfor er det vigtigt at fjerne spyt fra sputumprøver umiddelbart efter indsamling og/eller før homogenisering. Slim er af natur klæbrigt og vanskeligt at håndtere, men brugen af positive forskydningspipetter letter homogenisering uden at gå på kompromis med mucinnetværket, muliggør nøjagtig alikvotforberedelse og forenkler prøvebelastningen. Afhængigt af eksperimentet er prøvehomogenisering muligvis ikke påkrævet, men kan minimere variabiliteten mellem replikater. Under behandling af sputum umiddelbart efter opsamling anbefales, opretholder luftvejsslim unikke biofysiske egenskaber efter frysning og optøning. Frysning og optøning kan dog påvirke den samlede reologi af en prøve. Derfor bør kun prøver, der har gennemgået lignende fryse-/optøningscyklusser, sammenlignes med hinanden. Ved test af virkningerne af mukoaktive midler er indledende prøvehomogenisering vigtig for at optimere forbindelsens diffusion. Lægemiddellevering til lungerne via indånding begrænser de mængder, der får adgang til målet (dvs. slimproppen), men den konstante slag af cilierne kombineret med mucociliær transport genererer en vis blanding af lægemidlet og målet. For at simulere in vivo-behandling kan små mængder af et farmakologisk middel påføres direkte på prøver og blandes gradvist ved regelmæssig omrøring gennem inkubationstiden. Andre behandlingsmetoder (f.eks. lægemiddelforstøvning på prøven i en petriskål) kan dog undersøges. Blid agitation under inkubation vil sikre progressiv lægemiddelindtrængning uden at gå på kompromis med mucinnetværket på grund af mekanisk forstyrrelse (f.eks. Hvirvel eller sonikering). I øjeblikket anvendes TCEP ikke i kliniske indstillinger, men andre mukoaktive reagenser, såsom NAC, rhDNase, P-2119, ARINA-1 og PAAG undersøges for en lang række muco-obstruktive tilstande 21,26,27,28. Til konceptvalidering blev det påvist, at denne protokol kan bruges til at detektere signifikante ændringer i astmatisk slim som reaktion på TCEP-behandling. Et mere væskelignende slim blev produceret ved behandling med et reduktionsmiddel, hvilket fremgår af de nedre lineære viskoelastiske og gelpunktmarkører, hvilket tyder på en forbedring af clearanceevnen. Selvom rhDNase producerede enorme kliniske fordele i CF, anvendes det typisk ikke til andre muco-obstruktive sygdomme, sandsynligvis på grund af kronisk lavere ekstracellulære DNA-koncentrationer. Under en akut viral og bakteriel infektion kan et stærkt inflammatorisk respons imidlertid midlertidigt forårsage høj ekstracellulær DNA-koncentration og reducere luftvejsclearance. Derfor kan hurtig ex vivo-test af rhDNase-effekten fra sag til sag give vejledning til behandling af viral- og bakterieinduceret lungebetændelse. Dette kan være særligt værdifuldt midt i COVID-19-pandemien, som er forårsaget af luftvejsvirussen, SARS-CoV-2.
Sammenfattende giver den beskrevne enhed gennemførlige, hurtige og nøjagtige reologiske foranstaltninger. Disse egenskaber giver mulighed for at undersøge og overvåge status for luftvejssygdomme samt teste virkningerne af nye mukoaktive forbindelser. Målingernes hurtighed og enkelhed gør det muligt at udføre assays uden at pådrage sig komplikationer i forbindelse med frysning og/eller tidsmæssige virkninger af langvarig opbevaring eller transport, samtidig med at disse assays gøres mulige i en lang række forskellige indstillinger. I sidste ende kunne denne tilgang undersøges for udvælgelsen af personlige terapier fra et panel af muligheder, hvilket giver mulighed for skræddersyning af patientbehandling i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Dette papir er støttet af bevillinger fra Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) og CFF-støttet forskning EHRE20XX0.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
References
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
- Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
- Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
- Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
- Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
- Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
- Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
- Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
- Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
- Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
- Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
- Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
- Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
- Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
- Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
- Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
- Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
- Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
- Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
- Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
- Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).
