Summary
De visco-elastische eigenschappen van slijm spelen een cruciale rol bij de mucociliaire klaring. Traditionele slijmreologische technieken vereisen echter complexe en tijdrovende benaderingen. Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een benchtop rheometer die snel en betrouwbaar visco-elastische metingen kan uitvoeren.
Abstract
Bij muco-obstructieve longziekten (bijv. Astma, chronische obstructieve longziekte, cystische fibrose) en andere ademhalingsaandoeningen (bijv. Virale / bacteriële infecties), worden de biofysische eigenschappen van slijm veranderd door hypersecretie van bokaalcellen, uitdroging van de luchtwegen, oxidatieve stress en de aanwezigheid van extracellulair DNA. Eerdere studies toonden aan dat sputumvisco-elasticiteit correleerde met de longfunctie en dat behandelingen die de sputumreologie beïnvloeden (bijv. Mucolytica) kunnen resulteren in opmerkelijke klinische voordelen. Over het algemeen maken reologische metingen van niet-Newtoniaanse vloeistoffen gebruik van uitgebreide, tijdrovende benaderingen (bijv. parallelle / kegelplaatreometers en / of microbead-deeltjestracering) die uitgebreide training vereisen om de test uit te voeren en de gegevens te interpreteren. Deze studie testte de betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid en gevoeligheid van Rheomuco, een gebruiksvriendelijk benchtop-apparaat dat is ontworpen om snelle metingen uit te voeren met behulp van dynamische oscillatie met een schuif-rekveeg om lineaire visco-elastische moduli (G', G", G * en tan δ) en gelpuntkenmerken (γc en σc) te bieden voor klinische monsters binnen 5 minuten. De prestaties van het apparaat werden gevalideerd met behulp van verschillende concentraties van een slijmsimulant, 8 MDa polyethyleenoxide (PEO), en tegen traditionele bulkreologiemetingen. Een klinisch isolaat geoogst van een geïntubeerde patiënt met status asthmaticus (SA) werd vervolgens beoordeeld in drievoudige metingen en de variatiecoëfficiënt tussen metingen is <10%. Ex vivo gebruik van een krachtig slijmverlagend middel, TCEP, op SA-slijm resulteerde in een vijfvoudige afname van de elastische modulus en een verandering in de richting van een meer "vloeistofachtig" gedrag in het algemeen (bijv. Hogere bruining δ). Samen tonen deze resultaten aan dat de geteste benchtop-reometer betrouwbare metingen van slijmvisco-elasticiteit kan maken in klinische en onderzoeksomgevingen. Samenvattend kan het beschreven protocol worden gebruikt om de effecten van mucoactieve geneesmiddelen (bijv. RhDNase, N-acetylcysteïne) ter plaatse te onderzoeken om de behandeling per geval aan te passen, of in preklinische studies van nieuwe verbindingen.
Introduction
Muco-obstructieve luchtwegaandoeningen, waaronder astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), cystische fibrose (CF) en andere ademhalingsaandoeningen, zoals virale en bacteriële pneumonie, zijn wereldwijd veel voorkomende gezondheidsproblemen. Hoewel de pathofysiologie sterk varieert tussen elke aandoening, is een gemeenschappelijk belangrijk kenmerk abnormale mucociliaire klaring. In gezonde longen bekleedt slijm het luchtwegepitheel om ingeademde deeltjes op te vangen en een fysieke barrière tegen ziekteverwekkers te bieden. Eenmaal uitgescheiden, wordt luchtwegslijm, bestaande uit ~ 97,5% water, 0,9% zout, ~ 1,1% bolvormige eiwitten en ~ 0,5% mucines, geleidelijk naar de glottis getransporteerd door het gecoördineerde kloppen van trilharen 1,2. Mucines zijn grote O-gebonden glycoproteïnen die interageren via niet-covalente en covalente bindingen om de verschillende visco-elastische eigenschappen van slijm te bieden, wat nodig is voor efficiënt transport3. Veranderingen in de ultrastructuur van het mucinenetwerk veroorzaakt door veranderd ionentransport, mucine-ontvouwen, elektrostatische interacties, cross-linking of veranderingen in samenstelling kunnen de visco-elasticiteit van slijm aanzienlijk beïnvloeden en de mucociliaire klaring aantasten 4,5. Daarom is het identificeren van veranderingen in de biofysische eigenschappen van luchtwegslijm essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van ziekten en het testen van nieuwe mucoactieve verbindingen6.
Verschillende factoren kunnen leiden tot de productie van afwijkend slijm in de longen. Bij COPD veroorzaakt chronische inademing van sigarettenrook slijmhypersecretie als gevolg van gobletcelmetaplasie, evenals luchtweguitdroging via de downregulatie van het cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) kanaal, waardoor slijm hyperconcentratie en kleine luchtwegobstructie 7,8. Evenzo wordt CF, een genetische aandoening geassocieerd met mutaties in het CFTR-gen, gekenmerkt door de productie van viskeus, aanhangend slijm dat onvoldoende is voor transport 8,9. Kortom, CFTR-disfunctie induceert uitputting van luchtwegoppervlakvloeistof, polymere mucineverstrengeling en verhoogde biochemische interacties, die resulteren in chronische ontsteking en bacteriële infecties. Bovendien verergeren ontstekingscellen gevangen in statisch slijm de visco-elasticiteit van slijm verder door een ander groot molecuul, DNA, aan de gelmatrix toe te voegen, waardoor de luchtwegobstructie wordt verergerd5. Een van de beste voorbeelden van het belang van slijmreologie voor de algehele gezondheid van de longen wordt gegeven door het voorbeeld van recombinant humaan DNFase (rhDNase) bij de behandeling van patiënten met cystische fibrose. De effecten van rhDNase werden voor het eerst ex vivo aangetoond op slijmoplossend sputum, dat binnen enkele minuten een overgang van stroperig slijm naar een stromende vloeistof liet zien10,11. Klinische studies bij CF-patiënten toonden aan dat het verminderen van de visco-elasticiteit van luchtwegslijm met rhDNase-inhalatie de snelheid van pulmonale exacerbaties verminderde en de longfunctie en het algehele welzijn van de patiënt verbeterde 12,13,14. Als gevolg hiervan werd rhDNase-inhalatie gericht op het vergemakkelijken van de klaring al meer dan twee decennia de standaardzorg voor CF-patiënten. Vergelijkbare klinische voordelen werden waargenomen bij het gebruik van geïnhaleerde hypertone zoutoplossing voor slijmhydratatie bij CF, die correleerde met veranderingen in reologische eigenschappen en resulteerde in mucociliaire klaringsversnelling en verbeterde longfunctie15,16. Daarom is een snel en betrouwbaar protocol om slijmvisco-elastische eigenschappen in klinische omgevingen te meten belangrijk om therapeutische benaderingen te optimaliseren.
De benchtop rheometer die hierin wordt getest, biedt een snel en handig alternatief voor het uitvoeren van uitgebreide visco-elastische metingen van slijm/ sputummonsters. Met behulp van dynamische oscillaties met gecontroleerde hoekverplaatsing zorgt het instrument voor vervorming via een paar verstelbare parallelle platen (bijv. Ruwe of vloeiende geometrieën) om het koppel en de verplaatsing te meten met resoluties van 15 nN. m en 150 nm, respectievelijk17. Een standaard gestandaardiseerde kalibratie in combinatie met gebruikersrichtlijnen die zijn aangepast voor niet-reologiespecialisten maakt eenvoudige metingen mogelijk en vermindert het risico op bedieningsfouten. Het apparaat produceert een rekveegcurve die in realtime (binnen ~ 5 minuten) wordt verwerkt en geanalyseerd en biedt automatisch zowel lineaire visco-elastische (G', G", G * en tan δ) als gelpunt (γc en σc) kenmerken (zie tabel 1). De elastische of opslagmodulus (G') beschrijft hoe een monster reageert op stress (d.w.z. het vermogen om terug te keren naar zijn oorspronkelijke vorm), terwijl de viskeuze of verliesmodulus (G") de energie beschrijft die wordt gedissipeerd per cyclus van sinusoïdale vervorming (d.w.z. de energie die verloren gaat door de wrijving van moleculen). De complexe of dynamische modulus (G*) is de verhouding tussen spanning en spanning, die de hoeveelheid interne krachtopbouw beschrijft als reactie op een schuifverplaatsing (d.w.z. de totale visco-elastische eigenschappen). De dempingsfactor (tan δ) is de verhouding van de viskeuze modulus tot de elastische modulus, die het vermogen van een monster aangeeft om energie af te voeren (d.w.z. een lage tan δ duidt op een elastisch-dominant / solide-achtig gedrag, terwijl een hoge tan-δ duidt op een viskeus-dominant / vloeistofachtig gedrag). Voor gelpuntkenmerken is de crossover-spanning (γc) de maat van de afschuifspanning, berekend door de verhouding van het afbuigingspad tot de hoogte van de afschuifspleet, waarbij het monster overgaat van een vast naar een vloeistofachtig gedrag en per definitie optreedt bij oscillatiestam waarbij G' = G" of tan δ = 1. De crossover-vloeigrens (σc) is een maat voor de hoeveelheid spanning die wordt uitgeoefend door het apparaat waarbij de elastische en viskeuze moduli elkaar kruisen. Bij gezonde sputa domineert elasticiteit de mechanische reactie op spanning (G' > G"). Bij muco-obstructieve ziekten nemen zowel G' als G" toe als gevolg van pathologische slijmveranderingen 17,18,19. De operationele eenvoud van het apparaat vergemakkelijkt metingen ter plaatse en omzeilt de noodzaak van monsteropslag / transport / verzending naar een externe faciliteit voor analyse, waardoor de tijd- en vriesdooieffecten op de eigenschappen van deze biologische monsters worden vermeden.
In deze studie werden 8 MDa polyethyleenoxide (PEO) oplossingen van verschillende concentraties (1%-3%) gebruikt om het meetbereik van een commerciële benchtop rheometer (Table of Materials) te valideren en de verkregen concentratieafhankelijke curve werd direct vergeleken met metingen verkregen met een traditionele bulk rheometer (Table of Materials) ). De herhaalbaarheid van reologische metingen werd vervolgens beoordeeld met behulp van bronchoscopisch geoogst slijm van een geïntubeerde patiënt die lijdt aan status asthmaticus (SA), een extreme vorm van astma-exacerbatie gekenmerkt door bronchospasmen, eosinofiele ontsteking en slijmhyperproductie als reactie op een omgevings- of infectieus agens 8,20 . In dit geval was de SA-patiënt geïntubeerd voor ernstige respiratoire insufficiëntie en had ECMO (extracorporale membraanoxygenatie) nodig vanwege het onvermogen om de patiënt effectief en veilig te ondersteunen met mechanische beademing alleen, ondanks agressieve standaard astmatherapieën. Tijdens een klinisch geïndiceerde bronchoscopie voor lobaire collaps werden dikke, heldere, vasthoudende secreties waargenomen die lobaire bronchiën belemmerden en werden aangezogen met behulp van zoutoplossingsingen. Onmiddellijk na het verzamelen werd overtollige zoutoplossing uit het aspiraat verwijderd en werden de visco-elastische eigenschappen van het resterende SA-monster geanalyseerd met behulp van het benchtop-apparaat. Aanvullende monsteraliquots werden behandeld met een reductiemiddel, tris (2-carboxylethyl) fosfinehydrochloride (TCEP), om te bepalen of dit protocol kan worden gebruikt om de werkzaamheid van therapeutische verbindingen ex vivo te karakteriseren.
De resultaten toonden aan dat dit protocol en het benchtop-apparaat effectief kunnen worden gebruikt in een klinische setting. De reologische eigenschappen bepaald aan de hand van PEO-concentratieafhankelijke curven (figuur 1A) waren niet te onderscheiden tussen de geteste tafelinrichting en een traditionele parallelle plaatreometer (figuur 1B). Drievoudige metingen van het SA-slijm waren herhaalbaar, met een variatiecoëfficiënt van 10% voor G*-, G'- en G"-eindpunten en weerspiegelden de substantiële afwijkingen in slijmvisco-elasticiteit die klinisch duidelijk waren in het geval van deze patiënt (figuur 1D). Ten slotte resulteerde ex vivo behandeling met TCEP in een significante vermindering van G' en G", en een toename van tan δ, wat een responsiviteit op de behandeling aantoont door veranderingen in het mucinenetwerk (figuur 2). Kortom, dit protocol met behulp van een benchtop rheometer biedt een eenvoudige en effectieve aanpak om visco-elastische eigenschappen van slijmmonsters verkregen uit de kliniek te beoordelen. Deze mogelijkheid kan worden gebruikt om precisiegeneeskundebenaderingen van zorg te vergemakkelijken, omdat clinici de werkzaamheid van goedgekeurde mucoactieve geneesmiddelen ter plaatse kunnen testen, wat kan helpen bij het identificeren van alternatieve behandelingsopties. Bovendien kan deze aanpak worden gebruikt in klinische onderzoeken om de effecten van onderzoeksgeneesmiddelen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In de huidige studie werden monsters verzameld tijdens een klinisch geïndiceerde bronchoscopie na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming onder een protocol dat is goedgekeurd door de UNC Institutional Review Board.
1. Sputum/slijm verzamelen en bewaren
- Verzamel luchtwegslijm via sputumverzameling of bronchoscopie-aspiratie.
- Verzamel sputum via spontane slijmoplossen of induceer sputum met 3% hypertone zoutoplossinginhalatie. Als alternatief kunt u slijm rechtstreeks uit de luchtwegen aspirateren tijdens een bronchoscopieprocedure.
- Bewaar verzameld luchtwegsputum/slijm in steriele monsterbekers. In het geval van sputum, verwijder overtollig speeksel onmiddellijk na het verzamelen uit het monster.
- Plaats de monsters op ijs voor transport. Beperk de transporttijd tot minder dan 4 uur.
- Analyseer de monsters op het moment van verzamelen of bewaar ze bij -80 °C totdat ze zijn verwerkt.
- Homogeniseer het slijm vóór opslag door drie tot vijf keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een pipet met positieve verplaatsing of pipet rechtstreeks in de microcentrifugebuizen.
- Vul de monsters voor opslag in volumes ≥500 μL om voldoende volume voor experimenten te garanderen.
OPMERKING: Invriezen en ontdooien kan de visco-elastische eigenschappen van het monster beïnvloeden. Vergelijk alleen monsters die vergelijkbare vries-/dooicycli hebben ondergaan.
2. Monstervoorbereiding
- Pipetteer verse en bevroren sputa/slijm direct of homogeniseer monsters met behulp van een verdringerpipet door drie tot vijf keer voorzichtig op en neer te pipetteren voordat ze worden gehydrateerd.
OPMERKING: Homogenisatie is belangrijk voor monsters die dikke pluggen bevatten die de reproduceerbaarheid kunnen beïnvloeden. - Aliquot 400-500 μL van het monster in afzonderlijke microcentrifugebuizen. Bereid zoveel aliquots voor als nodig is voor herhaalde metingen en / of behandeling met farmacologische reagentia (bijv. RhDNase, N-acetylcysteïne). Incubeer de te testen aliquots bij 37 °C gedurende ten minste 5 minuten voorafgaand aan de meting.
- Gebruik voor het testen van farmacologische middelen (optioneel) hoge concentraties stamoplossingen om verdunning van het monster te voorkomen.
- Voeg tussen 0,4% en 10% volume (om de verdunning van het monster te minimaliseren) van het gewenste reagens (bijv. TCEP) rechtstreeks aan het monster toe. Zorg ervoor dat er geen druppel van de verbinding aan de zijkant van de buis blijft.
- Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende de gewenste tijdsduur om een chemische reactie mogelijk te maken (<1 uur om de proteolytische afbraak van het slijm te voorkomen).
- Meng het slijmmonster en het reagens door elke 2 minuten over de bodem van de microcentrifugebuis te vegen om progressieve penetratie van het reagens in het slijmmonster mogelijk te maken zonder het mucinenetwerk in gevaar te brengen (bijv. ciliaire kloppen en mucociliaire klaring nabootsen). Wanneer u meerdere geneesmiddelreagentia vergelijkt, moet u ervoor zorgen dat de incubatietijd vergelijkbaar is.
3. Instrumentinitialisatie en kalibratie
- Schakel het apparaat in (Tabel met materialen) en initialiseer de software.
- Selecteer Nieuwe meting. Voer het monsteridentificatienummer in onder Maatregel-ID en de naam van de exploitant onder Operator om door te gaan. Voer aanvullende informatie of opmerkingen in onder Opmerkingen.
- Selecteer een geometrieset (d.w.z. ruwe of gladde 25 mm parallelle platen) en inspecteer grote en kleine platen zorgvuldig om ervoor te zorgen dat platen schoon en in perfecte staat zijn).
OPMERKING: Ruwe platen zijn ontworpen voor grote volumes (350-500 μL) en gladde platen zijn ontworpen voor kleinere volumes (250-350 μL). Het gebruik van een lager of hoger monstervolume dan aanbevolen kan onnauwkeurige metingen veroorzaken. - Plaats de grote plaat stevig op de onderste preekstoel.
- Plaats de kleine plaat voorzichtig op de bovenste preekstoel en vergrendel de plaat door licht te draaien totdat u een "klik" hoort, wat aangeeft dat de plaat goed is geklemd. Merk op dat vrije oscillatie van de bovenste plaat normaal is.
- Wacht tot de temperatuur de streefwaarde van 37 °C bereikt. Start vervolgens de automatische kalibratie zoals gevraagd door de software.
OPMERKING: Verstoor de machine of het oppervlak van de tafel niet tijdens dit proces.
4. Monster laden
- Pipetteer met behulp van een positieve verplaatsingsppet langzaam tussen 250 en 500 μL van het monster op het midden van de grote bodemplaat. Eenmaal op de plaat afgezet, zullen viskeuze monsters een koepelvorm aannemen, terwijl zeer elastische monsters fysieke scheiding kunnen vereisen (gebruik een ontleedschaar).
OPMERKING: Vermijd het introduceren van luchtbellen. Verwijder indien nodig resterende bubbels door weg te duwen met een pipetpunt. - Laat de meetkop met de kleine plaat via de software zakken en observeer het monster. Indien correct geladen op de bodemplaat, zal het monster contact maken en worden gecentreerd tussen de twee platen.
- Om ervoor te zorgen dat het monster de opening vult (d.w.z. door zich uit te spreiden naar de randen van de platen), gebruikt u de functie Reduce Gap totdat het monster niet langer in een biconcave vorm is of is uitgelijnd met de rand van de platen. De reduce gap-functie verlaagt de meetkop in stappen van 0,1 mm en is beperkt tot zeven stappen.
OPMERKING: Controleer het monster zorgvuldig en pas de opening geleidelijk aan om overspill te voorkomen.- Als er na zeven stappen een tussenruimte overblijft, klikt u op Installatie opnieuw uitvoeren om terug te keren naar de beginpositie en de positie en/of het volume van het monster aan te passen.
- Als de opening buitengewoon is verkleind (bijv. biconvexe vorm), verwijdert u het overtollige monster met een spatel door een cirkelvormige beweging langs de rand van de bovenste plaat. Zorg ervoor dat u het overtollige monster voorzichtig bijsnijdt om schuifspanning te voorkomen.
OPMERKING: Aan het einde van deze stap moet de rand van het monster worden uitgelijnd met de rand van de bovenste plaat, zoals weergegeven in de gebruikersrichtlijnen.
- Laat de beschermkap zakken om te voorkomen dat verontreinigde vloeistoffen per ongeluk worden geprojecteerd tijdens oscillatie.
5. Start biofysische metingen
- Om de meting te starten, klikt u op Analyse starten. Een volledige cyclus duurt 4-7 minuten.
- Vermijd luid praten en het apparaat of de bank aanraken gedurende de gehele duur van de cyclus. Een rustige omgeving is vooral belangrijk voor de eerste 2 minuten.
OPMERKING: Tijdens de cyclus voert het instrument een gestandaardiseerde spanningsveegtest uit, die bestaat uit opeenvolgende oscillerende stappen. Elke stap is een reeks van 10 oscillaties bij constante amplitude en frequentie (1 Hz), waarbij het bijbehorende koppel in realtime wordt gemeten. De spannings- en koppelsignalen maken berekening van de complexe (G *), elastische (G) en viskeuze (G") moduli mogelijk, evenals de dempingsverhouding (tan δ) bij elke stap. Oscillaties nemen geleidelijk toe in amplitude, wat de vervorming die aan het monster wordt opgelegd, intensiveert.
- Vermijd luid praten en het apparaat of de bank aanraken gedurende de gehele duur van de cyclus. Een rustige omgeving is vooral belangrijk voor de eerste 2 minuten.
6. Verwijdering van monsters
- Zodra de cyclus is voltooid, klikt u op Volgende om de meetkop te verhogen en het monsteranalyserapport te genereren.
OPMERKING: Voor het rapport berekent de software de geregistreerde gegevens en geeft automatisch twee curven weer die de evolutie van de viskeuze en de elastische moduli weergeven in relatie tot de vervorming die op het monster wordt uitgeoefend en geeft het lineaire visco-elastische regime weer (d.w.z. een plateau bij lage vervorming) indien aanwezig. Als er geen lineair regime wordt gedetecteerd, worden de waarden van G', G", G* en tan δ geëxtraheerd bij 0,05 stam. Bovendien worden de crossover-spanning en vloeigrens (γc en σc) berekend bij tan δ = 1. Gegevens worden ook verstrekt in spreadsheets voor elke stap voor verdere analyse. - Zodra de meetkop volledig is ingetrokken, tilt u de beschermkap op, gooit u het monster weg en verwijdert u de platen voorzichtig. Reinig en desinfecteer de platen met warm water en zeep.
OPMERKING: Droog de geometrie grondig voor herhaald gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de nauwkeurigheid en herhaalbaarheid van reologische metingen met behulp van concentratieafhankelijke curven van visco-elastische controle, d.w.z. polyethyleenoxide (PEO) -oplossing en status asthmaticus (SA) slijm. Metingen van visco-elastische kenmerken van 8 MDa PEO bij vijf verschillende concentraties (1%, 1,5%, 2%, 2,5% en 3%) werden direct vergeleken tussen de geëvalueerde benchtop rheometer en een traditionele bulkreometer (Tabel van materialen). In tegenstelling tot SA-slijm waren PEO-oplossingen viskeus gedomineerd (G" > G') in het hele rekbereik en vertoonden ze geen crossover en vertoonden daarom een solide gedrag. Bovendien bevestigden drievoudige metingen uitgevoerd op 1,5% PEO-oplossing en klinisch SA-slijmmonster dat lineaire visco-elastische kenmerken (G *, G', en G") zeer herhaalbaar waren (<10% variatiecoëfficiënt) voor de waarden verkregen uit het biologische monster.
De observatie van lobaire collaps bij de SA-patiënt suggereerde dat slijmverstopping het vermogen om de longen mechanisch te ventileren zou kunnen bemoeilijken en verhoogde de mogelijkheid dat niet-standaard, mucolytische therapieën konden worden overwogen. In figuur 2 werd het hierin beschreven protocol gebruikt om veranderingen in de visco-elastische eigenschappen van slijm te meten na behandeling met een mucolytisch middel. Hoewel NAC is goedgekeurd voor gebruik met COPD en CF, bleek het een langzame kinetiek en lage potentie te hebben als een reductiemiddel21. Tcep is zeer effectief gebleken in het modificeren van de biofysische eigenschappen van slijm22. De effecten van TCEP op SA-slijmvisco-elasticiteit werden getest in een klinische setting met behulp van de benchtop-reometer. Mucolytische behandeling resulteerde in een meer vloeistofachtig monster met een afname van de complexe modulus (G *) met 4,6-voudige, elastische modulus (G') met 5,1-voudige, viskeuze modulus (G") met 1,9-voudige, crossover-spanning (γc) met 3,3-voudige en crossover-vloeispanning (σc) met 5,7-voudig, en een toename van de dempingsverhouding (tan δ) met 2,8-voudig.
| Zone | Parameter | Symbool | Eenheid | Definitie | Betekenis | ||||
| Lineair visco-elastisch regime (LVR) | Complexe Modulus | G* | Pa | Representatief visco-elastisch gedrag in het lineaire regime | Algemene weerstand tegen vervorming van het moleculaire netwerk | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| Elastische Modulus | G' | Pa | Elasticiteit van het materiaal in het lineaire regime | Stijfheid van de moleculaire structuur in rust, gerelateerd aan moleculaire netwerkstijfheid | |||||
| →0 : zacht →∞ : stijf |
|||||||||
| Viskeuze Modulus | G" | Pa | Viscositeit van het materiaal in het lineaire regime | Onomkeerbaar energieverlies terwijl de structuur onder zeer lage belasting beweegt | |||||
| →0 : zuivere vaste stof →∞ : dissipatief |
|||||||||
| Dempingsfactor | bruin δ | Unitless | Dempingsfactor in het lineaire regime | Energiedissipatiefactor, gerelateerd aan de moleculaire netwerkmorfologie. Elke verandering duidt op een verandering in de moleculaire aard. | |||||
| tan δ= G''/G' | →0 : zuivere vaste stof =1: bevuilde/vloeibare overgang →∞ : zuivere vloeistof |
||||||||
| Gelpunt | Kritische of crossover-spanning | γc | Unitless | Spanning bij het overschakelen van gel naar flow gedrag | Rekbaarheid van de gel, de totale vervorming die nodig is om een stroom te starten of een vaste stof te breken | ||||
| →0 : broos →∞ : flexibel |
|||||||||
| Kritieke of crossover-opbrengststress | σc | Pa | Stress bij het overschakelen naar flowgedrag | Sterkte van de gel, de hoeveelheid kracht die nodig is om een stroom te starten of een vaste stof te breken | |||||
| →0 : zwak →∞ : sterk |
|||||||||
Tabel 1: Lineaire visco-elastische moduli en gelpuntkenmerken gemeten met de benchtop rheometer. Het apparaat voert snelle metingen uit met behulp van dynamische oscillatie met een schuif-rekveeg om lineaire visco-elastische (G', G", G *, G * en tan δ) moduli en gelpuntkenmerken (γc en σc) binnen ~ 5 minuten te bieden. Parameters, symbolen, eenheden en een korte beschrijving van de metingen worden gegeven.
Figuur 1: Metingen van de visco-elastische eigenschappen van PEO-oplossingen en SA-slijm. Oplossingen van 8 MDa PEO werden bereid in concentraties 1%, 1,5%, 2%, 2,5% en 3%. SA-slijm werd geoogst tijdens een bronchoscopieprocedure. Voor metingen met behulp van de benchtop rheometer werden 25 mm ruwe platen en 500 μL van het monster gebruikt. Voor de metingen met behulp van de traditionele bulkreometer werden 20 mm parallelle gladde platen en 30 μL PEO-oplossingen gebruikt. Beide metingen werden uitgevoerd met een frequentie van 1 Hz. (A) Curven verkregen uit een enkele cyclus die 1%, 1,5%, 2%, 2,5% en 3% 8 MDa PEO analyseerde, die de evolutie van de elastische modulus (G') in blauw (i) en viskeuze modulus (G") in rood (ii) lieten zien. (B) Curven die elastische (i) en viskeuze moduli (ii) vergelijken voor het verhogen van concentraties peo-oplossingen, geanalyseerd door benchtop en traditionele rheometers bij 5% spanning. (C) Curven die de evolutie van G' en G" van SA-slijm weergeven, gemeten door de benchtop-reometer. Pijl geeft crossover-stam (γc) aan, wat een overgang aangeeft van zachtvast naar vloeistofachtig gedrag. (D) Grafieken met drie replicatiemetingen van (i) G*, (ii) G' en (iii) G" waarden voor respectievelijk 1,5% PEO (zwarte staven) en SA-slijm (grijze balken) in het lineaire visco-elastische regime (LVR) of bij 5% spanning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effecten van TCEP-behandeling op de visco-elasticiteit van SA-slijm. SA-slijm werd geanalyseerd vóór (niet-behandeld of NT) en na TCEP-behandeling (TCEP). De behandeling bestond uit het toevoegen van 2 μL van 5 mM TCEP-oplossing in 500 μL aliquots (uiteindelijke TCEP-concentratie van 20 μM). Met NT en TCEP behandelde monsters werden gedurende 20 minuten bij 37 °C geïncubeerd en gemengd door vóór de analyse elke 2 minuten over de bodem van de buis te vegen. Metingen werden uitgevoerd onder oscillerende spanning met een frequentie van 1 Hz. (A) Curven van NT en TCEP-behandeld SA-slijm die de evolutie van (i) elastische (G') en (ii) viskeuze (G") moduli laten zien. De horizontale zwarte stippellijn geeft het lineaire visco-elastische regime (LVR) aan en de verticale zwarte stippellijn geeft de 5% spanningsreferentie aan in het geval dat een LVR niet kon worden vastgesteld. (B) Vergelijking van de complexe modulus (G*), elastische modulus (G), viskeuze modulus (G), dempingsverhouding (tan δ), crossover-spanning (γc) en crossover-vloeigrens (σc) van met NT en TCEP behandeld slijm afgeleid van de overeenkomstige curven. Statistische analyse werd uitgevoerd en p-waarden werden verkregen met behulp van gepaarde t-tests. Waarden voor alle grafieken worden weergegeven als ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De unieke visco-elastische eigenschappen van slijm zijn essentieel voor het behoud van gezonde luchtwegen. Interne en externe factoren kunnen de biofysische eigenschappen van luchtwegslijm veranderen, waardoor klinische complicaties ontstaan die kenmerkend zijn voor muco-obstructieve ziekten. Daarom kan het monitoren van veranderingen in de visco-elasticiteit van slijm worden overwogen tijdens beoordelingen van de ziektestatus en verkenning van therapieën die de visco-elasticiteit van slijm verminderen. Empirische studies uit de jaren 1980 toonden een sterke correlatie aan tussen slijmreologie en luchtwegklaring met behulp van magnetische kraalreometers23,24. In de afgelopen jaren is de reologie geëvolueerd om te profiteren van verschillende technieken die slijm op verschillende schalen analyseren. Microrheologische testen gebruiken bijvoorbeeld microscopische sondes om lokale slijmeigenschappen te beschrijven op basis van de beweging van magnetische of fluorescerende deeltjes van micrometergrootte. Omdat deze techniek echter kleine steekproefvolumes gebruikt, kan het moeilijk zijn om representatieve gegevens te verkrijgen die heterogene monsters zoals sputum beschrijven. Verder vereisen microrheology-assays microscopen met een hoge resolutie, aanzienlijke rekenvaardigheden en tijdrovende analyses en zijn daarom slecht geschikt voor wijdverbreid laboratorium- of kliniekgebruik.
Hoewel microrheologie en macrorheologie doorgaans niet vergelijkbaar zijn, zijn vergelijkbare beperkingen van toepassing op reeds lang bestaande apparaten, zoals kegel / parallelle plaat bulkreometers. Macrorheologie wordt uitgevoerd met behulp van precisie-instrumenten die zijn uitgerust met roterende kegels, platen, bekers en / of rotors van verschillende afmetingen om extreem kleine koppels en verplaatsingen tot aan de sub nN te meten. m en sub Å bereiken. Om zo'n hoge precisie te bereiken, vereisen de meeste commerciële rheometers een directe verbinding met een persluchttoevoer- en koelsysteem in een omgeving die vrij is van olie, stof of geluid en met een gecontroleerde omgevingstemperatuur en vochtigheid om artefactvorming te voorkomen. Bovendien, terwijl traditionele bulkreometers een breed scala aan materialen kunnen meten via de aanpassing van specifieke variabelen, kost de kalibratie van deze instrumenten veel tijd en vereist uitgebreide training.
De Rheomuco benchtop rheometer is daarentegen speciaal ontworpen om de visco-elastische eigenschappen van slijm en sputum te meten en vereist een enkele kalibratiestap om binnen enkele minuten lineaire visco-elastische en gelpuntmetingen uit te voeren. Dit tafelapparaat maakt gebruik van een eenvoudig en gestandaardiseerd protocol om snelle en nauwkeurige visco-elastische metingen te produceren zonder de noodzaak van uitgebreide training in instrumentkalibratie of reologische gegevensanalyse / berekening. Het apparaat werkt door koppel en verplaatsing na oscillaties met gecontroleerde hoekverplaatsing te meten om een rekveegcurve te produceren en een lineair visco-elastisch regime of LVR (een gebied met een uniforme visco-elastische respons op spanning, aangegeven met een horizontale stippellijn in figuur 2A) vast te stellen voordat het punt wordt bereikt waar het monster ontstaat. In de meeste gevallen bevinden sputummonsters zich binnen de LVR boven het rekbereik van 1% -10%. Wanneer een LVR niet wordt gedetecteerd, wordt gewoonlijk verwezen naar de waarde bij 5% spanning om te rapporteren over de visco-elastische kenmerken van het monster. De afwezigheid van een gedetecteerde LVR maakt de meting niet ongeldig, maar weerspiegelt eerder een monster waarvan de eigenschappen verschillen (meer plastic) van die van de meeste monsters. De gevoeligheid van dit instrument is geoptimaliseerd om te voldoen aan de behoeften van viskeuze en elastische vloeistoffen dicht bij slijm, terwijl het een hoge tolerantie biedt voor mechanische ruis, waardoor het ideaal is voor de studie van biologische vloeistoffen in klinische omgevingen; het is echter mogelijk niet geschikt om andere visco-elastische of viskeuze materialen met extreem lage (bijv. speeksel) of extreem hoge (bijv. koolteer) elastische of viskeuze moduli te bestuderen als gevolg van beperkte softwareparameters en het onvermogen om variabelen zoals plaatvorm, oppervlak, afstand en rotatiefrequentie te manipuleren. De concentratieafhankelijke reologische metingen op PEO 8 MDa (figuur 1) maakten de schatting van de gevoeligheid (d.w.z. de ondergrens van detectie) van dit apparaat mogelijk, die tussen 0,3% en 0,4% van 8 MDa PEO of <0,05 Pa voor G* ligt. Een bovengrens kon echter niet worden vastgesteld omdat het moeilijk was PEO-concentraties van meer dan 3% op te lossen. Niettemin was het apparaat in staat om G ' en G " te rapporteren voor 3% 8 MDa PEO, wat meer visco-elastisch is dan SA-slijmmonsters (~ 5-voudig grotere G 'en 25-voudig grotere G" in vergelijking met SA), wat een relevant dynamisch bereik voor slijmbiospecimens suggereert. Opgemerkt moet worden dat om nauwkeurige metingen tijdens oscillaties te verkrijgen, een geschikt volume van het monster in het midden van de plaat moet worden geplaatst zonder de aanwezigheid van bellen. Tijdens het laden van het monster zullen onvoldoende volume, luchtbellen en /of plaatsing buiten het midden onvoldoende contact met de platen veroorzaken, wat resulteert in lagere geregistreerde waarden. Omgekeerd zal monsteroverloop overmatige schuifspanning veroorzaken als gevolg van extra weerstandskracht25.
Deze studie beschrijft hoe dikke slijmmonsters onmiddellijk na het verzamelen kunnen worden verwerkt, opgeslagen en behandeld. Een van de belangrijkste uitdagingen waarmee studies van sputumreologie worden geconfronteerd, is de heterogene aard van deze monsters en de ontwikkeling van gestandaardiseerde meetbenaderingen. Sputum is een slijmoplossende stof die vaak besmet is met speeksel en die bacteriën en spijsverteringsenzymen bevat die het mucinenetwerk snel kunnen veranderen en de visco-elasticiteit van slijm kunnen beïnvloeden. Daarom is het van cruciaal belang om speeksel uit sputummonsters onmiddellijk na het verzamelen en / of vóór homogenisatie te verwijderen. Van nature is slijm kleverig en moeilijk te hanteren, maar het gebruik van verdringerpipetjes vergemakkelijkt homogenisatie zonder het mucinenetwerk in gevaar te brengen, maakt nauwkeurige aliquotvoorbereiding mogelijk en vereenvoudigt het laden van monsters. Afhankelijk van het experiment is monsterhomogenisatie mogelijk niet vereist, maar kan de variabiliteit tussen replicaties worden geminimaliseerd. Hoewel het verwerken van sputum onmiddellijk na het verzamelen wordt aanbevolen, behoudt luchtwegslijm unieke biofysische eigenschappen na bevriezing en ontdooiing. Bevriezing en ontdooien kunnen echter de algehele reologie van een monster beïnvloeden. Daarom mogen alleen monsters die vergelijkbare vries-/dooicycli hebben ondergaan, met elkaar worden vergeleken. Bij het testen van de effecten van mucoactieve stoffen is initiële monsterhomogenisatie belangrijk om de verspreiding van verbindingen te optimaliseren. Medicijnafgifte aan de longen via inhalatie beperkt de volumes die toegang hebben tot het doelwit (d.w.z. slijmprop), maar het constante kloppen van de trilharen in combinatie met mucociliair transport genereert enige vermenging van het medicijn en het doelwit. Om in vivo behandeling te simuleren, kunnen kleine volumes van een farmacologisch middel rechtstreeks op monsters worden aangebracht en geleidelijk worden gemengd door regelmatige agitatie gedurende de incubatietijd. Andere behandelingsmethoden (bijv. verneveling van geneesmiddelen op het monster in een petrischaal) kunnen echter worden onderzocht. Zachte agitatie tijdens incubatie zorgt voor progressieve medicijnpenetratie zonder het mucinenetwerk in gevaar te brengen als gevolg van mechanische verstoring (bijv. Vortexing of ultrasoonapparaat). Momenteel wordt TCEP niet gebruikt in klinische omgevingen, maar andere mucoactieve reagentia, zoals NAC, rhDNase, P-2119, ARINA-1 en PAAG worden onderzocht voor een breed scala aan muco-obstructieve aandoeningen 21,26,27,28. Voor conceptvalidatie werd aangetoond dat dit protocol kan worden gebruikt om significante veranderingen in astmatisch slijm te detecteren als reactie op TCEP-behandeling. Een meer vloeistofachtig slijm werd geproduceerd door behandeling met een reductiemiddel, wat blijkt uit de lagere lineaire visco-elastische en gelpuntmarkers, wat een verbetering van het klaringsvermogen suggereert. Hoewel rhDNase enorme klinische voordelen bij CF opleverde, wordt het meestal niet gebruikt voor andere muco-obstructieve ziekten, waarschijnlijk als gevolg van chronisch lagere extracellulaire DNA-concentraties. Tijdens een acute virale en bacteriële infectie kan een sterke ontstekingsreactie echter tijdelijk een hoge extracellulaire DNA-concentratie veroorzaken en de luchtwegklaring verminderen. Daarom zou een snelle ex vivo test van de werkzaamheid van rhDNase van geval tot geval een leidraad kunnen bieden voor de behandeling van virale en bacteriële geïnduceerde pneumonie. Dit kan vooral waardevol zijn te midden van de COVID-19-pandemie, die wordt veroorzaakt door het respiratoire virus SARS-CoV-2.
Samenvattend biedt het beschreven apparaat haalbare, snelle en nauwkeurige reologische maatregelen. Deze kenmerken bieden het potentieel om de status van luchtwegaandoeningen te onderzoeken en te controleren, evenals de effecten van nieuwe mucoactieve stoffen te testen. De snelheid en eenvoud van metingen maken het mogelijk om assays uit te voeren zonder complicaties op te lopen die verband houden met bevriezing en / of temporele effecten van langdurige opslag of transport, terwijl deze assays haalbaar zijn in een breed scala aan omgevingen. Uiteindelijk zou deze aanpak kunnen worden onderzocht voor de selectie van gepersonaliseerde therapieën uit een panel van opties, waardoor real-time afstemming van de behandeling van de patiënt mogelijk is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
Dit artikel wordt ondersteund door subsidies van Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) en CFF-ondersteund onderzoek EHRE20XX0.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
References
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
- Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
- Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
- Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
- Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
- Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
- Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
- Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
- Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
- Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
- Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
- Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
- Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
- Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
- Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
- Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
- Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
- Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
- Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
- Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
- Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).
