Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Caractérisation viscoélastique rapide du mucus des voies respiratoires à l’aide d’un rhéomètre de paillasse

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63876

Summary

Les propriétés viscoélastiques du mucus jouent un rôle essentiel dans la clairance mucociliaire. Cependant, les techniques rhéologiques traditionnelles du mucus nécessitent des approches complexes et chronophages. Cette étude fournit un protocole détaillé pour l’utilisation d’un rhéomètre de paillasse capable d’effectuer rapidement et de manière fiable des mesures viscoélastiques.

Abstract

Dans les maladies pulmonaires muco-obstructives (p. ex. asthme, maladie pulmonaire obstructive chronique, fibrose kystique) et d’autres affections respiratoires (p. ex., infections virales/bactériennes), les propriétés biophysiques du mucus sont altérées par l’hypersécrétion des cellules gobelets, la déshydratation des voies respiratoires, le stress oxydatif et la présence d’ADN extracellulaire. Des études antérieures ont montré que la viscoélasticité des expectorations était en corrélation avec la fonction pulmonaire et que les traitements affectant la rhéologie des expectorations (par exemple, les mucolytiques) peuvent entraîner des avantages cliniques remarquables. En général, les mesures rhéologiques des fluides non newtoniens utilisent des approches élaborées et chronophages (p. ex., rhéomètres parallèles/à plaques coniques et/ou suivi des particules de microbilles) qui nécessitent une formation approfondie pour effectuer le test et interpréter les données. Cette étude a testé la fiabilité, la reproductibilité et la sensibilité de Rheomuco, un dispositif de paillasse convivial conçu pour effectuer des mesures rapides en utilisant l’oscillation dynamique avec un balayage cisaillement-déformation afin de fournir des modules viscoélastiques linéaires (G', G », G* et tan δ) et des caractéristiques de point de gel (γc et σc) pour les échantillons cliniques dans les 5 minutes. Les performances de l’appareil ont été validées à l’aide de différentes concentrations d’un simulant de mucus, l’oxyde de polyéthylène (PEO) de 8 MDa, et par rapport aux mesures traditionnelles de rhéologie en vrac. Un isolat clinique prélevé sur un patient intubé atteint d’asthme (SA) a ensuite été évalué en trois mesures et le coefficient de variation entre les mesures est <10%. L’utilisation ex vivo d’un puissant agent réducteur de mucus, le TCEP, sur le mucus SA a entraîné une diminution de cinq fois du module élastique et un changement vers un comportement global plus « liquide » (par exemple, un bronzage plus élevé δ). Ensemble, ces résultats démontrent que le rhéomètre de paillasse testé peut effectuer des mesures fiables de la viscoélasticité du mucus dans les milieux cliniques et de recherche. En résumé, le protocole décrit pourrait être utilisé pour explorer les effets des médicaments mucoactifs (p. ex. rhDNase, N-acétyl cystéine) sur place pour adapter le traitement au cas par cas, ou dans des études précliniques de nouveaux composés.

Introduction

Les maladies des voies respiratoires muco-obstructives, y compris l’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la fibrose kystique (FK) et d’autres affections respiratoires, telles que la pneumonie virale et bactérienne, sont des problèmes de santé répandus dans le monde entier. Bien que la physiopathologie varie considérablement d’une affection à l’autre, une caractéristique clé commune est une clairance mucociliaire anormale. Dans les poumons sains, le mucus tapisse l’épithélium des voies respiratoires pour piéger les particules inhalées et fournir une barrière physique contre les agents pathogènes. Une fois sécrété, le mucus des voies respiratoires, composé d’environ 97,5% d’eau, de 0,9% de sel, d’environ 1,1% de protéines globulaires et d’environ 0,5% de mucines, est progressivement transporté vers la glotte par le battement coordonné des cils 1,2. Les mucines sont de grandes glycoprotéines liées à l’O qui interagissent via des liaisons non covalentes et covalentes pour fournir les propriétés viscoélastiques distinctes du mucus, ce qui est nécessaire pour un transport efficace3. Les changements dans l’ultrastructure du réseau de mucine causés par une altération du transport ionique, le déploiement de la mucine, les interactions électrostatiques, la réticulation ou des changements de composition peuvent affecter de manière significative la viscoélasticité du mucus et altérer la clairance mucociliaire 4,5. Par conséquent, l’identification des changements dans les propriétés biophysiques du mucus des voies respiratoires est essentielle pour comprendre la pathogenèse de la maladie et tester de nouveaux composés mucoactifs6.

Divers facteurs peuvent conduire à la production de mucus aberrant dans les poumons. Dans la MPOC, l’inhalation chronique de fumée de cigarette déclenche une hypersécrétion de mucus à la suite de la métaplasie des cellules de gobelet, ainsi qu’une déshydratation des voies respiratoires via la régulation négative du canal régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR), provoquant une hyperconcentration du mucus et une obstruction des petites voies respiratoires 7,8. De même, la mucoviscidose, une maladie génétique associée à des mutations du gène CFTR, se caractérise par la production de mucus visqueux et adhérent inadéquat pour le transport 8,9. En bref, le dysfonctionnement du CFTR induit l’épuisement des liquides de surface des voies respiratoires, l’enchevêtrement de mucine polymère et une augmentation des interactions biochimiques, ce qui entraîne une inflammation chronique et des infections bactériennes. En outre, les cellules inflammatoires piégées dans le mucus statique exacerbent encore la viscoélasticité du mucus en ajoutant une autre grosse molécule, l’ADN, dans la matrice du gel, aggravant l’obstruction des voies respiratoires5. L’un des meilleurs exemples de l’importance de la rhéologie du mucus sur la santé globale des poumons est fourni par l’exemple de la DNFase humaine recombinante (rhDNase) dans le traitement des patients atteints de mucoviscidose. Les effets de la rhDNase ont d’abord été démontrés ex vivo sur les expectorations expectorées, qui ont montré une transition du mucus visqueux à un liquide qui s’écoule enquelques minutes 10,11. Les essais cliniques chez les patients atteints de mucoviscidose ont démontré que la réduction de la viscoélasticité du mucus des voies respiratoires avec l’inhalation de rhDNase diminuait le taux d’exacerbations pulmonaires et améliorait la fonction pulmonaire et le bien-être général du patient 12,13,14. En conséquence, l’inhalation de rhDNase visant à faciliter la clairance est devenue la norme de soins pour les patients atteints de mucoviscidose pendant plus de deux décennies. Des avantages cliniques similaires ont été observés avec l’utilisation d’une solution saline hypertonique inhalée pour l’hydratation du mucus dans la mucoviscidose, ce qui était en corrélation avec des changements dans les propriétés rhéologiques et entraînait une accélération de la clairance mucociliaire et une amélioration de la fonction pulmonaire15,16. Par conséquent, un protocole rapide et fiable pour mesurer les propriétés viscoélastiques du mucus en milieu clinique est important pour optimiser les approches thérapeutiques.

Le rhéomètre de paillasse testé ici offre une alternative rapide et pratique pour effectuer des mesures viscoélastiques complètes d’échantillons de mucus / expectorations. En utilisant des oscillations dynamiques avec déplacement angulaire contrôlé, l’instrument fournit une déformation via une paire de plaques parallèles réglables (par exemple, des géométries rugueuses ou lisses) pour mesurer le couple et le déplacement avec des résolutions de 15 nN. m et 150 nm, respectivement17. Un étalonnage standardisé par défaut combiné à des directives d’utilisation adaptées aux spécialistes non rhéologiques permet des mesures simples et réduit le risque d’erreurs de l’opérateur. L’appareil produit une courbe de balayage de déformation qui est traitée et analysée en temps réel (dans un délai d’environ 5 minutes) et fournit automatiquement des caractéristiques viscoélastiques linéaires (G', G », G* et tan δ) et de point de gel (γc et σc) (voir tableau 1). Le module élastique ou de stockage (G') décrit comment un échantillon réagit au stress (c.-à-d. la capacité de revenir à sa forme d’origine), tandis que le module visqueux ou de perte (G) décrit l’énergie dissipée par cycle de déformation sinusoïdale (c.-à-d. l’énergie perdue en raison du frottement des molécules). Le module complexe ou dynamique (G*) est le rapport de la contrainte à la déformation, qui décrit la quantité d’accumulation de force interne en réponse à un déplacement de cisaillement (c.-à-d. les propriétés viscoélastiques globales). Le facteur d’amortissement (tan δ) est le rapport entre le module visqueux et le module élastique, ce qui indique la capacité d’un échantillon à dissiper l’énergie (c’est-à-dire qu’un faible bronzage δ indique un comportement élastique dominant / solide, tandis qu’un bronzage élevé δ indique un comportement visqueux dominant / liquide). Pour les caractéristiques du point de gel, la déformation croisée (γc) est la mesure de la déformation de cisaillement, calculée par le rapport entre le chemin de déviation et la hauteur de l’écart de cisaillement, à laquelle l’échantillon passe d’un comportement de type solide à un comportement de type liquide et se produit, par définition, à une déformation d’oscillation où G' = G » ou tan δ = 1. La limite d’élasticité croisée (σc) est une mesure de la quantité de contrainte appliquée par le dispositif auquel les modules élastiques et visqueux se croisent. Dans une sputa saine, l’élasticité domine la réponse mécanique à la déformation (G' > G »). Dans les maladies muco-obstructives, G' et G » augmentent à la suite de changements pathologiques de mucus 17,18,19. La simplicité opérationnelle de l’appareil facilite les mesures sur site et contourne le besoin d’entreposage, de transport et d’expédition des échantillons vers une installation hors site pour analyse, évitant ainsi les effets de temps et de gel-dégel sur les propriétés de ces échantillons biologiques.

Dans cette étude, des solutions d’oxyde de polyéthylène (PEO) de 8 MDa de différentes concentrations (1% -3%) ont été utilisées pour valider la plage de mesure d’un rhéomètre de paillasse commercial (Table des matériaux) et la courbe dépendante de la concentration obtenue a été directement comparée aux mesures acquises avec un rhéomètre en vrac traditionnel (Table des matériaux) ). La répétabilité des mesures rhéologiques a ensuite été évaluée à l’aide de mucus prélevé bronchoscopiquement sur un patient intubé souffrant d’asthme (AS), une forme extrême d’exacerbation de l’asthme caractérisée par un bronchospasme, une inflammation éosinophile et une hyperproduction de mucus en réponse à un agent environnemental ou infectieux 8,20 . Dans ce cas, le patient SA avait été intubé pour insuffisance respiratoire sévère et avait besoin d’ECMO (oxygénation par membrane extracorporelle) en raison de l’incapacité de soutenir le patient efficacement et en toute sécurité avec une ventilation mécanique seule, malgré des traitements agressifs standard contre l’asthme. Au cours d’une bronchoscopie cliniquement indiquée pour l’effondrement lobaire, des sécrétions épaisses, claires et tenaces ont été notées comme obstruant les bronches lobaires et ont été aspirées à l’aide de lavages salins. Immédiatement après le prélèvement, l’excès de solution saline a été retiré de l’aspiration et les propriétés viscoélastiques de l’échantillon SA restant ont été analysées à l’aide du dispositif de paillasse. D’autres aliquotes d’échantillons ont été traitées avec un agent réducteur, le chlorhydrate de phosphine de tris (2-carboxyléthyle) (TCEP), afin de déterminer si ce protocole pouvait être utilisé pour caractériser l’efficacité des composés thérapeutiques ex vivo.

Les résultats ont montré que ce protocole et le dispositif de paillasse peuvent être utilisés efficacement en milieu clinique. Les propriétés rhéologiques déterminées à partir des courbes dépendantes de la concentration de PEO (figure 1A) étaient impossibles à distinguer entre le dispositif de paillasse testé et un rhéomètre à plaques parallèles traditionnel (figure 1B). Les mesures triplicates du mucus SA étaient reproductibles, avec un coefficient de variation de 10 % pour les critères d’évaluation G*, G' et G » et reflétaient les anomalies substantielles de la viscoélasticité du mucus qui étaient cliniquement apparentes dans le cas de ce patient (Figure 1D). Enfin, le traitement ex vivo par TCEP a entraîné une réduction significative de G' et G » et une augmentation de la δ bronzée, démontrant une réactivité au traitement par des altérations du réseau de mucine (Figure 2). En conclusion, ce protocole utilisant un rhéomètre de paillasse fournit une approche simple et efficace pour évaluer les propriétés viscoélastiques des échantillons de mucus obtenus en clinique. Cette capacité peut être utilisée pour faciliter les approches de médecine de précision en matière de soins, car les cliniciens peuvent tester l’efficacité des médicaments mucoactifs approuvés sur place, ce qui peut aider à identifier d’autres options de traitement. De plus, cette approche peut être utilisée dans les essais cliniques pour examiner les effets des médicaments expérimentaux.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dans la présente étude, des échantillons ont été prélevés lors d’une bronchoscopie cliniquement indiquée après avoir obtenu le consentement éclairé en vertu d’un protocole approuvé par le Comité d’examen institutionnel de l’UNC.

1. Collecte et stockage des expectorations et du mucus

  1. Recueillir le mucus des voies respiratoires par prélèvement d’expectorations ou aspiration par bronchoscopie.
    1. Prélever les expectorations soit par expectoration spontanée, soit induire des expectorations par inhalation saline hypertonique à 3%. Alternativement, aspirer directement le mucus des voies respiratoires pendant une procédure de bronchoscopie.
    2. Conservez les expectorations et le mucus des voies respiratoires recueillis dans des gobelets stériles. Dans le cas des expectorations, retirer l’excès de salive de l’échantillon immédiatement après le prélèvement.
    3. Placez les échantillons sur de la glace pour le transport. Limitez le temps de transport à moins de 4 h.
  2. Analyser les échantillons au moment de la collecte ou les conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités.
    1. Avant le stockage, homogénéiser le mucus en pipetant doucement de haut en bas trois à cinq fois avec une pipette à déplacement positif ou une pipette directement dans les tubes de microcentrifugation.
    2. Aliquoter les échantillons à stocker dans des volumes ≥500 μL afin d’assurer un volume suffisant pour les expériences.
      REMARQUE: La congélation et la décongélation peuvent affecter les propriétés viscoélastiques de l’échantillon. Comparez uniquement les échantillons qui ont subi des cycles de gel/dégel similaires.

2. Préparation de l’échantillon

  1. Pipettez directement les sputa/mucus frais et congelés ou homogénéisez les échantillons à l’aide d’une pipette à déplacement positif en pipetant doucement de haut en bas trois à cinq fois avant de les aliquoter.
    REMARQUE: L’homogénéisation est importante pour les échantillons qui contiennent des bouchons épais qui peuvent affecter la reproductibilité.
  2. Aliquote 400-500 μL de l’échantillon dans des tubes de microcentrifugation séparés. Préparer autant d’aliquotes que nécessaire pour des mesures répétées et/ou un traitement avec des réactifs pharmacologiques (p. ex. rhDNase, N-acétyl cystéine). Incuber les aliquotes à tester à 37 °C pendant au moins 5 minutes avant la mesure.
  3. Pour tester les agents pharmacologiques (facultatif), utiliser des concentrations élevées de solutions mères pour éviter la dilution de l’échantillon.
    1. Ajouter entre 0,4 % et 10 % de volume (pour minimiser la dilution de l’échantillon) du réactif souhaité (p. ex. TCEP) directement sur l’échantillon. Assurez-vous qu’aucune goutte du composé ne reste sur le côté du tube.
    2. Incuber les échantillons à 37 °C pendant la durée souhaitée pour permettre une réaction chimique (<1 h pour empêcher la dégradation protéolytique du mucus).
    3. Mélanger l’échantillon de mucus et le réactif en agitant le fond du tube de microcentrifugation toutes les 2 minutes pour permettre une pénétration progressive du réactif dans l’échantillon de mucus sans compromettre le réseau de mucine (par exemple, en imitant le battement ciliaire et la clairance mucociliaire). Lorsque vous comparez plusieurs réactifs médicamenteux, assurez-vous que le temps d’incubation est similaire.

3. Initialisation et étalonnage de l’instrument

  1. Allumez la machine (Table des matériaux) et initialisez le logiciel.
  2. Sélectionnez Nouvelle mesure. Entrez le numéro d’identification de l’échantillon sous ID de mesure et le nom de l’opérateur sous Opérateur pour continuer. Entrez des informations ou des commentaires supplémentaires sous Commentaires.
  3. Choisissez un jeu de géométrie (c.-à-d. des plaques parallèles rugueuses ou lisses de 25 mm) et inspectez soigneusement les grandes et les petites plaques pour vous assurer que les plaques sont propres et en parfait état).
    REMARQUE: Les plaques rugueuses sont conçues pour les grands volumes (350-500 μL) et les plaques lisses sont conçues pour les petits volumes (250-350 μL). L’utilisation d’un volume d’échantillon inférieur ou supérieur à celui recommandé peut entraîner des mesures inexactes.
  4. Insérez fermement la grande plaque sur la chaire inférieure.
  5. Insérez doucement la petite plaque sur la chaire supérieure et verrouillez la plaque en la tournant légèrement jusqu’à entendre un « clic », ce qui indique que la plaque est correctement serrée. Notez que l’oscillation libre de la plaque supérieure est normale.
  6. Attendez que la température atteigne la valeur cible de 37 °C. Ensuite, lancez l’étalonnage automatique à l’invite du logiciel.
    REMARQUE: Ne dérangez pas la machine ou la surface de paillasse pendant ce processus.

4. Chargement de l’échantillon

  1. À l’aide d’une pipette à déplacement positif, pipettez lentement entre 250 et 500 μL de l’échantillon au centre de la grande plaque inférieure. Une fois déposés sur la plaque, les échantillons visqueux adopteront une forme de dôme alors que les échantillons très élastiques peuvent nécessiter une séparation physique (utilisez des ciseaux à disséquer).
    REMARQUE: Évitez d’introduire des bulles d’air. Si nécessaire, enlevez les bulles résiduelles en les repoussant avec une pointe de pipette.
  2. Abaissez la tête de mesure transportant la petite plaque via le logiciel et observez l’échantillon. S’il est correctement chargé sur la plaque inférieure, l’échantillon entrera en contact et sera centré entre les deux plaques.
  3. Pour vous assurer que l’échantillon comble l’espace (c.-à-d. en s’étalant sur les bords des plaques), utilisez la fonction Réduire l’écart jusqu’à ce que l’échantillon ne soit plus en forme de biconcave ou qu’il soit aligné avec le bord des plaques. La fonction Réduire l’écart abaisse la tête de mesure par incréments de 0,1 mm et est limitée à sept incréments.
    REMARQUE: Surveillez attentivement l’échantillon et ajustez progressivement l’écart pour éviter les débordements.
    1. S’il reste un espace après sept incréments, cliquez sur Rétablir l’installation pour revenir à la position initiale et ajuster la position et/ou le volume de l’échantillon.
    2. Si l’écart est excessivement réduit (p. ex., forme biconvexe), prélever l’échantillon excédentaire à l’aide d’une spatule par un mouvement circulaire le long du bord de la plaque supérieure. Assurez-vous de couper doucement l’excès d’échantillon pour éviter les contraintes de cisaillement.
      REMARQUE : À la fin de cette étape, le bord de l’échantillon doit être aligné avec le bord de la plaque supérieure, comme indiqué dans les instructions de l’utilisateur.
  4. Abaissez le couvercle de protection pour éviter toute projection accidentelle de fluides contaminés pendant l’oscillation.

5. Initier la mesure biophysique

  1. Pour lancer la mesure, cliquez sur Démarrer l’analyse. Un cycle complet prendra 4-7 min.
    1. Évitez de parler fort et de toucher l’appareil ou le banc pendant toute la durée du cycle. Un environnement calme est particulièrement important pour les 2 premières minutes.
      REMARQUE: Pendant le cycle, l’instrument effectue un test de balayage de déformation standardisé, qui consiste en des étapes oscillantes successives. Chaque étape est une série de 10 oscillations à amplitude et fréquence constantes (1 Hz), au cours desquelles le couple correspondant est mesuré en temps réel. Les signaux de déformation et de couple permettent de calculer les modules complexes (G*), élastiques (G') et visqueux (G), ainsi que le rapport d’amortissement (tan δ) à chaque étape. Les oscillations augmentent progressivement en amplitude, ce qui intensifie la déformation imposée à l’échantillon.

6. Retrait de l’échantillon

  1. Une fois le cycle terminé, cliquez sur Suivant pour augmenter la tête de mesure et générer le rapport d’analyse de l’échantillon.
    REMARQUE: Pour le rapport, le logiciel calcule les données enregistrées et trace automatiquement deux courbes montrant l’évolution des modules visqueux et élastiques par rapport à la déformation exercée sur l’échantillon et affiche le régime viscoélastique linéaire (c’est-à-dire un plateau à faible déformation) s’il est présent. Si aucun régime linéaire n’est détecté, les valeurs de G', G », G* et tan δ sont extraites à 0,05 déformation. De plus, la déformation croisée et la limite d’élasticité (γc et σc) sont calculées à tan δ = 1. Les données sont également fournies dans des feuilles de calcul pour chaque étape pour une analyse plus approfondie.
  2. Une fois la tête de mesure complètement rétractée, soulevez le couvercle de protection, jetez l’échantillon et retirez soigneusement les plaques. Nettoyez et désinfectez les assiettes à l’eau tiède et au savon.
    REMARQUE: Séchez soigneusement la géométrie définie avant une utilisation répétée.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figure 1 montre la précision et la répétabilité des mesures rhéologiques à l’aide de courbes dépendantes de la concentration de contrôle viscoélastique, c’est-à-dire la solution d’oxyde de polyéthylène (PEO) et le mucus asthmatique (SA). Les mesures des caractéristiques viscoélastiques de 8 MDa PEO à cinq concentrations différentes (1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 % et 3 %) ont été directement comparées entre le rhéomètre de paillasse évalué et un rhéomètre en vrac traditionnel (Table des matériaux). Contrairement au mucus SA, les solutions de PEO étaient à dominance visqueuse (G » > G') dans toute la gamme de souches et ne présentaient pas de croisement et, par conséquent, présentaient un comportement de type solide. De plus, les mesures triples effectuées sur une solution de PEO à 1,5 % et un échantillon clinique de mucus SA ont confirmé que les caractéristiques viscoélastiques linéaires (G*, G' et G ») étaient hautement reproductibles (coefficient de variation <10 %) pour les valeurs obtenues à partir de l’échantillon biologique.

L’observation d’un collapsus lobaire chez le patient ATTEINT a suggéré que le colmatage du mucus pourrait compliquer la capacité de ventiler mécaniquement les poumons et a soulevé la possibilité que des thérapies mucolytiques non standard puissent être envisagées. Dans la figure 2, le protocole décrit ici a été utilisé pour mesurer les changements dans les propriétés viscoélastiques du mucus après un traitement avec un agent mucolytique. Bien que le NAC ait été approuvé pour une utilisation avec la MPOC et la FK, il a été démontré qu’il avait une cinétique lente et une faible puissance en tant qu’agent réducteur21. TcEP s’est avéré très efficace pour modifier les propriétés biophysiques du mucus22. Les effets du TCEP sur la viscoélasticité du mucus SA ont été testés dans un cadre clinique à l’aide du rhéomètre de paillasse. Le traitement mucolytique a donné un échantillon plus fluide avec une diminution du module complexe (G*) de 4,6 fois, du module élastique (G') de 5,1 fois, du module visqueux (G ») de 1,9 fois, de la déformation croisée (γc) de 3,3 fois et de la contrainte d’élasticité croisée (σc) de 5,7 fois, et une augmentation du rapport d’amortissement (bronzage δ) de 2,8 fois.

Zone Paramètre Symbole Unité Définition Signification
Régime viscoélastique linéaire (LVR) Module complexe G* Papa Comportement viscoélastique représentatif dans le régime linéaire Résistance globale à la déformation du réseau moléculaire
G* = σ/γ
Module élastique G' Papa Élasticité du matériau dans le régime linéaire Rigidité de la structure moléculaire au repos, liée à la rigidité du réseau moléculaire
→0 : doux
→∞ : rigide
Module visqueux G" Papa Viscosité du matériau dans le régime linéaire Perte irréversible d’énergie pendant que la structure se déplace sous une très faible contrainte
→0 : solide pur
→∞ : dissipatif
Facteur d’amortissement δ bronzage Sans unité Facteur d’amortissement dans le régime linéaire Facteur de dissipation d’énergie, lié à la morphologie du réseau moléculaire. Tout changement indique un changement dans la nature moléculaire.
tan δ= G''/G' →0 : solide pur
=1 : transition salie/liquide
→∞ : liquide pur
Gel Point Souche critique ou croisée γc  Sans unité Filtrer lors du passage du gel au comportement d’écoulement Extensibilité du gel, la déformation totale nécessaire pour démarrer un écoulement ou casser un solide
→0 : cassant
→∞ : flexible
Contrainte d’élasticité critique ou croisée σc Papa Stress lors du passage au comportement d’écoulement Force du gel, la quantité de force nécessaire pour démarrer un écoulement ou casser un solide
→0 : faible
→∞ : fort

Tableau 1 : Caractéristiques des modules viscoélastiques linéaires et des points de gel mesurés par le rhéomètre de paillasse. L’appareil effectue des mesures rapides en utilisant l’oscillation dynamique avec un balayage de déformation de cisaillement pour fournir des caractéristiques viscoélastiques linéaires (G', G « , G * et tan δ) et des caractéristiques de point de gel (γc et σc) dans un délai d’environ 5 minutes. Les paramètres, les symboles, les unités et une brève description des mesures sont fournis.

Figure 1
Figure 1 : Mesures des propriétés viscoélastiques des solutions PEO et du mucus SA. Des solutions de PEO de 8 MDa ont été préparées à des concentrations de 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 % et 3 %. Le mucus SA a été prélevé lors d’une procédure de bronchoscopie. Pour les mesures à l’aide du rhéomètre de paillasse, des plaques rugueuses de 25 mm et 500 μL de l’échantillon ont été utilisées. Pour les mesures utilisant le rhéomètre en vrac traditionnel, des plaques lisses parallèles de 20 mm et 30 μL de solutions PEO ont été utilisées. Les deux mesures ont été effectuées à une fréquence de 1 Hz. (A) Courbes obtenues à partir d’un seul cycle analysant 1%, 1,5%, 2%, 2,5% et 3% 8 MDa PEO, montrant l’évolution du module élastique (G') en bleu (i) et du module visqueux (G ») en rouge (ii). (B) Courbes comparant les modules élastiques (i) et visqueux (ii) pour augmenter les concentrations de solutions peO, analysées par des rhéomètres de paillasse et traditionnels à une déformation de 5%. (C) Courbes montrant l’évolution de G' et G » du mucus SA, mesurées par le rhéomètre de paillasse. La flèche indique la déformation croisée (γc), qui indique une transition d’un comportement solide mou à un comportement semblable à un comportement liquide. (D) Graphiques montrant trois mesures répliquées des valeurs (i) G*, (ii) G' et (iii) G » pour 1,5% peO (barres noires) et SA mucus (barres grises) dans le régime viscoélastique linéaire (LVR) ou à 5% de déformation, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Effets du traitement TCEP sur la viscoélasticité du mucus SA. Le mucus SA a été analysé avant (non traité ou NT) et après le traitement TCEP (TCEP). Le traitement consistait à ajouter 2 μL de solution de TCEP de 5 mM dans des aliquotes de 500 μL (concentration finale de TCEP de 20 μM). Les échantillons traités au NT et au TCEP ont été incubés pendant 20 min à 37 °C et mélangés en effleurant le fond du tube toutes les 2 minutes avant l’analyse. Des mesures ont été effectuées sous déformation oscillante à une fréquence de 1 Hz. (A) Courbes du mucus SA traité par NT et TCEP montrant l’évolution des modules (i) élastiques (G') et (ii) visqueux (G). La ligne pointillée noire horizontale indique le régime viscoélastique linéaire (LVR) et la ligne pointillée noire verticale indique la référence de déformation de 5 % dans le cas où une LVR ne pourrait pas être établie. (B) Comparaison du module complexe (G*), du module élastique (G'), du module visqueux (G), du rapport d’amortissement (tan δ), de la déformation croisée (γc) et de la limite d’élasticité croisée (σc) du mucus traité NT et TCEP dérivé des courbes correspondantes. Une analyse statistique a été effectuée et les valeurs p ont été acquises à l’aide de tests t appariés. Les valeurs de tous les graphiques sont indiquées comme ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Les propriétés viscoélastiques uniques du mucus sont essentielles au maintien de voies respiratoires saines. Des facteurs internes et externes peuvent altérer les propriétés biophysiques du mucus des voies respiratoires, entraînant des complications cliniques caractéristiques des maladies muco-obstructives. Par conséquent, la surveillance des changements dans la viscoélasticité du mucus pourrait être envisagée lors de l’évaluation de l’état de la maladie et de l’exploration de thérapies qui réduisent la viscoélasticité du mucus. Des études empiriques des années 1980 ont démontré une forte corrélation entre la rhéologie du mucus et la clairance des voies respiratoires à l’aide de rhéomètres à billes magnétiques23,24. Au cours des dernières années, la rhéologie a évolué pour tirer parti de plusieurs techniques qui analysent le mucus à différentes échelles. Par exemple, les essais microrhéologiques utilisent des sondes microscopiques pour décrire les propriétés locales du mucus en fonction du mouvement de particules magnétiques ou fluorescentes de taille micrométrique. Cependant, étant donné que cette technique utilise de petits volumes d’échantillons, il peut être difficile d’obtenir des données représentatives décrivant des échantillons hétérogènes tels que les expectorations. En outre, les tests de microrhéologie nécessitent des microscopes à haute résolution, des compétences de calcul importantes et des analyses chronophages, et sont donc mal adaptés à une utilisation généralisée en laboratoire ou en clinique.

Bien que la microrhéologie et la macrorhéologie ne soient généralement pas comparables, des limitations similaires s’appliquent aux dispositifs établis de longue date, tels que les rhéomètres en vrac à cône / plaque parallèle. La macrorhéologie est réalisée à l’aide d’instruments de précision équipés de cônes rotatifs, de plaques, de coupelles et / ou de rotors de différentes dimensions pour mesurer des couples et des déplacements extrêmement faibles jusqu’au sub nN. Gammes m et sub Å. Pour atteindre une telle précision, la plupart des rhéomètres commerciaux nécessitent une connexion directe avec un système d’alimentation en air comprimé et de refroidissement dans un environnement exempt d’huile, de poussière ou de bruit et avec une température ambiante et une humidité ambiantes contrôlées pour empêcher la formation d’artefacts. De plus, alors que les rhéomètres en vrac traditionnels peuvent mesurer une large gamme de matériaux via l’ajustement de variables spécifiques, l’étalonnage de ces instruments prend beaucoup de temps et nécessite une formation approfondie.

En revanche, le rhéomètre de paillasse Rheomuco a été spécialement conçu pour mesurer les propriétés viscoélastiques du mucus et des expectorations et nécessite une seule étape d’étalonnage pour effectuer des mesures viscoélastiques linéaires et des points de gel en quelques minutes. Cet appareil de paillasse utilise un protocole simple et standardisé pour produire des mesures viscoélastiques rapides et précises sans avoir besoin d’une formation approfondie en étalonnage d’instruments ou en analyse / calcul de données rhéologiques. Le dispositif fonctionne en mesurant le couple et le déplacement à la suite d’oscillations à déplacement angulaire contrôlé pour produire une courbe de balayage de déformation et établir un régime viscoélastique linéaire ou LVR (une région de réponse viscoélastique uniforme à la déformation, indiquée par une ligne pointillée horizontale à la figure 2A), avant d’atteindre le point où l’échantillon cède. Dans la plupart des cas, les échantillons d’expectorations se trouvent dans la LVR sur la plage de déformation de 1 % à 10 %. Lorsqu’une LVR n’est pas détectée, la valeur à 5 % de la souche est couramment référencée pour rendre compte des caractéristiques viscoélastiques de l’échantillon. L’absence d’un LVR détecté n’invalide pas la mesure, mais reflète plutôt un échantillon dont les propriétés sont distinctes (plus plastiques) de celles de la plupart des échantillons. La sensibilité de cet instrument est optimisée pour répondre aux besoins des fluides visqueux et élastiques proches du mucus tout en offrant une grande tolérance au bruit mécanique, ce qui le rend idéal pour l’étude des fluides biologiques en milieu clinique; toutefois, il peut ne pas être adapté à l’étude d’autres matériaux viscoélastiques ayant des modules élastiques ou visqueux extrêmement faibles (p. ex. salive) ou extrêmement élevés (p. ex., goudron de houille) en raison de paramètres logiciels restreints et de l’incapacité de manipuler des variables telles que la forme de la plaque, la surface, la distance et la fréquence de rotation. Les mesures rhéologiques dépendantes de la concentration sur PEO 8 MDa (Figure 1) ont permis d’estimer la sensibilité (c’est-à-dire la limite inférieure de détection) de cet appareil, qui se situe entre 0,3 % et 0,4 % de 8 MDa PEO ou <0,05 Pa pour G*. Une limite supérieure n’a toutefois pas pu être établie en raison de la difficulté de solubiliser des concentrations de PEO supérieures à 3 %. Néanmoins, l’appareil a été en mesure de signaler G' et G » pour 3% 8 MDa PEO, ce qui est plus viscoélastique que les échantillons de mucus SA (~ 5 fois plus grand G' et 25 fois plus G » par rapport à SA), suggérant une plage dynamique pertinente pour les biospécènes de mucus. Il convient de noter que pour obtenir des mesures précises lors des oscillations, un volume approprié de l’échantillon doit être placé au centre de la plaque sans la présence de bulles. Pendant le chargement de l’échantillon, un volume insuffisant, des bulles d’air et/ou un placement décentré créeront un contact inadéquat avec les plaques, ce qui entraînera des valeurs enregistrées plus faibles. Inversement, le débordement de l’échantillon créera une contrainte de cisaillement excessive en raison de la force de traînée supplémentaire25.

Cette étude décrit comment traiter, stocker et traiter des échantillons de mucus épais immédiatement après le prélèvement. L’un des principaux défis auxquels sont confrontées les études de rhéologie des expectorations est la nature hétérogène de ces échantillons et le développement d’approches de mesure standardisées. Les expectorations sont une substance expectorée souvent contaminée par la salive qui contient des bactéries et des enzymes digestives qui peuvent rapidement modifier le réseau de mucine et affecter la viscoélasticité du mucus. Par conséquent, il est essentiel d’éliminer la salive des échantillons d’expectorations immédiatement après le prélèvement et/ou avant l’homogénéisation. Par nature, le mucus est collant et difficile à manipuler, mais l’utilisation de pipettes à déplacement positif facilite l’homogénéisation sans compromettre le réseau de mucine, permet une préparation précise des aliquotes et simplifie le chargement des échantillons. Selon l’expérience, l’homogénéisation de l’échantillon peut ne pas être nécessaire, mais peut minimiser la variabilité entre les réplications. Bien qu’il soit recommandé de traiter les expectorations immédiatement après la collecte, le mucus des voies respiratoires conserve des propriétés biophysiques uniques après la congélation et la décongélation. Cependant, la congélation et la décongélation peuvent affecter la rhéologie globale d’un échantillon. Par conséquent, seuls les échantillons qui ont subi des cycles de congélation/dégel similaires doivent être comparés les uns aux autres. Lors de l’essai des effets des agents mucoactifs, l’homogénéisation initiale de l’échantillon est importante pour optimiser la diffusion des composés. L’administration de médicaments aux poumons par inhalation limite les volumes qui accèdent à la cible (c.-à-d. bouchon de mucus), mais le battement constant des cils combiné au transport mucociliaire génère un certain mélange du médicament et de la cible. Pour simuler un traitement in vivo, de petits volumes d’un agent pharmacologique peuvent être appliqués directement sur des échantillons et progressivement mélangés par agitation régulière tout au long du temps d’incubation. Cependant, d’autres méthodes de traitement (p. ex., la nébulisation de médicaments sur l’échantillon dans une boîte de Pétri) peuvent être étudiées. Une agitation douce pendant l’incubation assurera une pénétration progressive du médicament sans compromettre le réseau de mucine en raison d’une perturbation mécanique (p. ex., vortex ou sonication). Actuellement, le TCEP n’est pas utilisé en milieu clinique, mais d’autres réactifs mucoactifs, tels que le NAC, la rhDNase, le P-2119, l’ARINA-1 et le PAAG, sont à l’étude pour un large éventail de conditions muco-obstructives 21,26,27,28. Pour la validation du concept, il a été démontré que ce protocole peut être utilisé pour détecter des changements significatifs dans le mucus asthmatique en réponse au traitement TCEP. Un mucus plus fluide a été produit par traitement avec un agent réducteur, ce qui est apparent à partir des marqueurs viscoélastiques linéaires inférieurs et des points de gel, suggérant une amélioration de la capacité de clairance. Bien que la rhDNase ait produit d’énormes avantages cliniques dans la FK, elle n’est généralement pas utilisée pour d’autres maladies obstructives des muqueuses, probablement en raison de concentrations d’ADN extracellulaire chroniquement plus faibles. Cependant, lors d’une infection virale et bactérienne aiguë, une forte réponse inflammatoire peut temporairement provoquer une concentration élevée d’ADN extracellulaire et réduire la clairance des voies respiratoires. Par conséquent, des tests ex vivo rapides de l’efficacité de la rhDNase au cas par cas pourraient fournir des conseils pour le traitement de la pneumonie virale et bactérienne. Cela pourrait être particulièrement utile dans le contexte de la pandémie de COVID-19, causée par le virus respiratoire, le SARS-CoV-2.

En résumé, le dispositif décrit fournit des mesures rhéologiques réalisables, rapides et précises. Ces caractéristiques offrent la possibilité d’étudier et de surveiller l’état des maladies des voies respiratoires, ainsi que de tester les effets de nouveaux composés mucoactifs. La rapidité et la simplicité des mesures permettent d’effectuer des essais sans encourir de complications liées à la congélation et/ou aux effets temporels d’un stockage ou d’un transport prolongé tout en rendant ces essais réalisables dans une grande variété de contextes. En fin de compte, cette approche pourrait être explorée pour la sélection de thérapies personnalisées à partir d’un panel d’options, permettant une adaptation en temps réel du traitement des patients.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun

Acknowledgments

Cet article est soutenu par des subventions de Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) et de research EHRE20XX0 soutenue par CFF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Pistons Tips Gilson CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3 TA Instruments DHR-3 Bulk Rheometer manufactured
by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software GraphPad Prism GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube Costar 3621
Peltier plate TA Instruments Temperature control system manufactured
by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide Sigma 372838 8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette Gilson M1000 Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco Rheonova Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries Rheonova D-1811-007 25mm Diameter
Rough Upper Geometries Rheonova U-1811-007 25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate TA Instruments 20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine Sigma 646547-10X1ML TCEP: Potent reducing agent.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
  2. Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
  3. Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
  4. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
  5. Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
  6. Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
  7. Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
  8. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  9. Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
  10. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  11. Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
  12. Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
  13. Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
  14. Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
  15. Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
  16. Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
  17. Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
  18. Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
  19. Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
  20. Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
  21. Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
  22. Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
  23. Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
  24. Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
  25. Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
  26. Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
  27. Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
  28. Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).

Tags

Médecine Numéro 182 Voies respiratoires Respiratoires Mucus Expectorations Muco-Obstructive Asthme BPCO Fibrose kystique Rhéologie Rhéomètre Viscoélastique Mesures biophysiques
Caractérisation viscoélastique rapide du mucus des voies respiratoires à l’aide d’un rhéomètre de paillasse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wykoff, J. A., Shaffer, K. M.,More

Wykoff, J. A., Shaffer, K. M., Araba, K. C., Markovetz, M. R., Patarin, J., Robert de Saint Vincent, M., Donaldson, S. H., Ehre, C. Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer. J. Vis. Exp. (182), e63876, doi:10.3791/63876 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter