Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

एक बेंचटॉप रिओमीटर का उपयोग करके वायुमार्ग बलगम के तेजी से व्हिस्कोइलिस्टिक लक्षण वर्णन

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63876
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1,4
1Marsico Lung Institute / CF Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Rheonova, 3Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Pediatric, Pediatric Pulmonology Division, The University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

बलगम के विस्कोइलिस्टिक गुण म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, पारंपरिक बलगम rheological तकनीकों को जटिल और समय लेने वाले दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। यह अध्ययन एक बेंचटॉप रिओमीटर के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है जो तेजी से और मज़बूती से व्हिस्कोइलिस्टिक माप कर सकता है।

Abstract

म्यूको-ऑब्सट्रक्टिव फेफड़ों के रोगों (जैसे, अस्थमा, क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज, सिस्टिक फाइब्रोसिस) और अन्य श्वसन स्थितियों (जैसे, वायरल / बैक्टीरियल संक्रमण) में, बलगम बायोफिजिकल गुणों को गोब्लेट सेल हाइपरसेक्रेशन, वायुमार्ग निर्जलीकरण, ऑक्सीडेटिव तनाव और बाह्य कोशिकीय डीएनए की उपस्थिति से बदल दिया जाता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि थूक viscoelasticity फुफ्फुसीय समारोह के साथ सहसंबद्ध है और थूक rheology (जैसे, mucolytics) को प्रभावित करने वाले उपचार के परिणामस्वरूप उल्लेखनीय नैदानिक लाभ हो सकते हैं। सामान्य तौर पर, गैर-न्यूटोनियन तरल पदार्थों के rheological माप विस्तृत, समय लेने वाले दृष्टिकोण (जैसे, समानांतर / शंकु-प्लेट rheometers और / या माइक्रोबीड कण ट्रैकिंग) को नियोजित करते हैं जिन्हें परख करने और डेटा की व्याख्या करने के लिए व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन ने Rheomuco की विश्वसनीयता, पुनरुत्पादन और संवेदनशीलता का परीक्षण किया, जो एक उपयोगकर्ता के अनुकूल बेंचटॉप डिवाइस है जिसे 5 मिनट के भीतर नैदानिक नमूनों के लिए रैखिक व्हिस्कोइलिस्टिक मोडुली (जी,जी", जी *, और टैन δ) और जेल पॉइंट विशेषताओं (γसी और σसी) प्रदान करने के लिए कतरनी-तनाव स्वीप के साथ गतिशील दोलन का उपयोग करके तेजी से माप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। डिवाइस के प्रदर्शन को बलगम सिमुलेंट, 8 एमडीए पॉलीइथिलीन ऑक्साइड (पीईओ) की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके मान्य किया गया था, और पारंपरिक थोक rheology माप के खिलाफ। स्थिति दमा (एसए) के साथ एक intubated रोगी से काटा एक नैदानिक पृथक तो तीन गुना माप में मूल्यांकन किया गया था और माप के बीच भिन्नता का गुणांक <10% है। एसए बलगम पर एक शक्तिशाली बलगम को कम करने वाले एजेंट, टीसीईपी के पूर्व विवो उपयोग के परिणामस्वरूप लोचदार मापांक में पांच गुना कमी आई और समग्र रूप से अधिक "तरल-जैसे" व्यवहार की ओर एक परिवर्तन हुआ (उदाहरण के लिए, उच्च तन δ)। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि परीक्षण किए गए बेंचटॉप रिओमीटर नैदानिक और अनुसंधान सेटिंग्स में बलगम व्हिस्कोइलिस्टिसिटी के विश्वसनीय उपाय कर सकते हैं। संक्षेप में, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग म्यूकोएक्टिव दवाओं (जैसे, rhDNase, N-acetyl cysteine) के प्रभावों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, ताकि मामले-दर-मामले के आधार पर उपचार को अनुकूलित किया जा सके, या उपन्यास यौगिकों के प्रीक्लिनिकल अध्ययन में।

Introduction

अस्थमा, क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी), सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ), और अन्य श्वसन स्थितियों, जैसे वायरल और बैक्टीरियल निमोनिया सहित म्यूको-ऑब्सट्रक्टिव वायुमार्ग रोग, दुनिया भर में प्रचलित स्वास्थ्य चिंताएं हैं। जबकि पैथोफिजियोलॉजी प्रत्येक स्थिति के बीच बहुत भिन्न होती है, एक आम प्रमुख विशेषता असामान्य म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस है। स्वस्थ फेफड़ों में, बलगम वायुमार्ग उपकला को साँस के कणों को फंसाने और रोगजनकों के खिलाफ एक भौतिक बाधा प्रदान करने के लिए लाइनों। एक बार स्रावित होने के बाद, वायुमार्ग बलगम, ~ 97.5% पानी, 0.9% नमक, ~ 1.1% गोलाकार प्रोटीन, और ~ 0.5% म्यूकिन्स से बना होता है, धीरे-धीरे सिलिया 1,2 की समन्वित पिटाई से ग्लोटिस की ओर ले जाया जाता है। म्यूकिन्स बड़े ओ-लिंक्ड ग्लाइकोप्रोटीन हैं जो बलगम के अलग-अलग विस्कोइलिस्टिक गुणों को प्रदान करने के लिए गैर-सहसंयोजक और सहसंयोजक बांड के माध्यम से बातचीत करते हैं, जो कुशल परिवहन के लिए आवश्यक है3। परिवर्तित आयन परिवहन, म्यूसिन खुलासा, इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन, क्रॉस-लिंकिंग, या संरचना में परिवर्तन के कारण म्यूसिन नेटवर्क की अल्ट्रास्ट्रक्चर में परिवर्तन बलगम व्हिस्कोइलिस्टिसिटी को काफी प्रभावित कर सकते हैं और म्यूकोसिलियरीक्लियरेंस 4,5 को खराब कर सकते हैं। इसलिए, वायुमार्ग बलगम के बायोफिजिकल गुणों में परिवर्तन की पहचान करना रोग रोगजनन को समझने और उपन्यास म्यूकोएक्टिव यौगिकों का परीक्षण करनेके लिए आवश्यक है।

विभिन्न कारकों से फेफड़ों में अनियमित बलगम का उत्पादन हो सकता है। सीओपीडी में, सिगरेट के धुएं की पुरानी साँस लेना गोब्लेट सेल मेटाप्लासिया के परिणामस्वरूप बलगम हाइपरसेक्रेटेशन को ट्रिगर करता है, साथ ही सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) चैनल के डाउनरेगुलेशन के माध्यम से वायुमार्ग निर्जलीकरण, जिससे बलगम हाइपरकॉन्सन्ट्रेशन और छोटे वायुमार्ग रुकावट 7,8 हो जाते हैं। इसी तरह, सीएफटीआर जीन में उत्परिवर्तन से जुड़ा एक आनुवंशिक विकार सीएफटीआर जीन में उत्परिवर्तन से जुड़ा एक आनुवंशिक विकार, चिपचिपा, अनुयायी बलगम के उत्पादन की विशेषता है जोपरिवहन 8,9 के लिए अपर्याप्त है। संक्षेप में, सीएफटीआर शिथिलता वायुमार्ग की सतह तरल कमी, बहुलक म्यूसिन उलझन, और जैव रासायनिक इंटरैक्शन में वृद्धि को प्रेरित करती है, जिसके परिणामस्वरूप पुरानी सूजन और जीवाणु संक्रमण होता है। इसके अलावा, स्थैतिक बलगम में फंसी भड़काऊ कोशिकाएं जेल मैट्रिक्स में एक और बड़े अणु, डीएनए को जोड़कर बलगम की विस्कोलिस्टिकिटी को और बढ़ाती हैं, जिससे वायुमार्ग की रुकावट 5 बिगड़ जातीहै। फेफड़ों के समग्र स्वास्थ्य पर बलगम rheology के महत्व के सबसे अच्छे उदाहरणों में से एक सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के उपचार में पुनः संयोजक मानव DNFase (rhDNase) के उदाहरण द्वारा प्रदान किया जाता है। rhDNase के प्रभावों को पहली बार expectorated थूक पर पूर्व विवो का प्रदर्शन किया गया था, जिसने चिपचिपा बलगम सेमिनटों 10,11 के भीतर एक बहते हुए तरल में संक्रमण दिखाया था। सीएफ रोगियों में नैदानिक परीक्षणों से पता चला है कि rhDNase साँस लेने के साथ वायुमार्ग बलगम viscoelasticity को कम करने से फुफ्फुसीय तीव्रता की दर में कमी आई है, और फेफड़ों के कार्य और समग्र रोगी कल्याणमें सुधार हुआ है 12,13,14। नतीजतन, निकासी की सुविधा के उद्देश्य से rhDNase साँस लेना दो दशकों से अधिक समय तक सीएफ रोगियों के लिए देखभाल का मानक बन गया। सीएफ में बलगम जलयोजन के लिए साँस हाइपरटोनिक खारा के उपयोग के साथ इसी तरह के नैदानिक लाभ देखे गए थे, जो कि रियोलॉजिकल गुणों में परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध थे और इसके परिणामस्वरूप म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस त्वरण और फेफड़ों के कार्य में सुधारहुआ 15,16। इसलिए, नैदानिक सेटिंग्स में बलगम व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों को मापने के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय प्रोटोकॉल चिकित्सीय दृष्टिकोण को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

यहां परीक्षण किया गया बेंचटॉप रिओमीटर बलगम / थूक के नमूनों के व्यापक व्हिस्कोइलिस्टिक मापन करने के लिए एक तेज और सुविधाजनक विकल्प प्रदान करता है। नियंत्रित कोणीय विस्थापन के साथ गतिशील दोलनों का उपयोग करते हुए, उपकरण समायोज्य समानांतर प्लेटों (जैसे, किसी न किसी या चिकनी ज्यामिति) की एक जोड़ी के माध्यम से विरूपण प्रदान करता है ताकि 15 nN के संकल्पों के साथ टोक़ और विस्थापन को मापा जा सके। m और 150 nm, क्रमशः17. गैर-rheology विशेषज्ञों के लिए अनुकूलित उपयोगकर्ता दिशानिर्देशों के साथ संयुक्त एक डिफ़ॉल्ट मानकीकृत अंशांकन सीधे माप के लिए अनुमति देता है और ऑपरेटर त्रुटियों के जोखिम को कम करता है। डिवाइस एक तनाव स्वीप वक्र का उत्पादन करता है जिसे वास्तविक समय (~ 5 मिनट के भीतर) में संसाधित और विश्लेषण किया जाता है और स्वचालित रूप से रैखिक व्हिस्कोइलिस्टिक (जी', जी ", जी *, और टैन δ) और जेल बिंदु (γसी, और σसी) विशेषताओं (तालिका 1 देखें) दोनों प्रदान करता है। लोचदार या भंडारण मापांक (जी') वर्णन करता है कि एक नमूना तनाव का जवाब कैसे देता है (यानी, अपने मूल आकार में लौटने की क्षमता), जबकि चिपचिपा या हानि मापांक (जी ") साइनसोइडल विरूपण के प्रति चक्र में विलुप्त ऊर्जा का वर्णन करता है (यानी, अणुओं के घर्षण के कारण खोई गई ऊर्जा)। जटिल या गतिशील मापांक (जी *) तनाव के लिए तनाव का अनुपात है, जो कर्तन विस्थापन (यानी, समग्र व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों) के जवाब में आंतरिक बल बिल्डअप की मात्रा का वर्णन करता है। अवमंदन कारक (टैन δ) लोचदार मापांक के लिए चिपचिपा मापांक का अनुपात है, जो ऊर्जा को नष्ट करने के लिए एक नमूने की क्षमता को इंगित करता है (यानी, एक कम तन δ एक लोचदार-प्रमुख / ठोस-जैसे व्यवहार को इंगित करता है, जबकि एक उच्च तन δ एक चिपचिपा-प्रमुख / तरल जैसे व्यवहार को इंगित करता है)। जेल बिंदु विशेषताओं के लिए, क्रॉसओवर स्ट्रेन (γसी) कतरनी तनाव का माप है, जिसकी गणना कतरनी अंतराल ऊंचाई के लिए विक्षेपण पथ के अनुपात से की जाती है, जिस पर नमूना एक ठोस-जैसे तरल जैसे व्यवहार से तरल जैसे व्यवहार में संक्रमण करता है और परिभाषा के अनुसार दोलन तनाव पर होता है जहां जी = जी " या तन δ = 1। क्रॉसओवर उपज तनाव (σसी) डिवाइस द्वारा लागू तनाव की मात्रा का एक उपाय है जिस पर लोचदार और चिपचिपा मोडुली पार करता है। स्वस्थ स्पुटा में, लोच तनाव के लिए यांत्रिक प्रतिक्रिया पर हावी होती है (जी '> जी")। म्यूको-ऑब्सट्रक्टिव बीमारियों में, जी और जी दोनों "पैथोलॉजिकल बलगमपरिवर्तनों के परिणामस्वरूप 17,18,19 बढ़ जाते हैं। डिवाइस की परिचालन सादगी ऑनसाइट माप की सुविधा प्रदान करती है और विश्लेषण के लिए एक ऑफसाइट सुविधा के लिए नमूना भंडारण / परिवहन / शिपमेंट की आवश्यकता को दरकिनार करती है, इस प्रकार इन जैविक नमूनों के गुणों पर समय और फ्रीज-पिघलने वाले प्रभावों से बचती है।

इस अध्ययन में, विभिन्न सांद्रता (1%-3%) के 8 एमडीए पॉलीथीन ऑक्साइड (पीईओ) समाधानों का उपयोग वाणिज्यिक बेंचटॉप रिओमीटर (सामग्री की तालिका) की मापने की सीमा को मान्य करने के लिए किया गया था और प्राप्त एकाग्रता-निर्भर वक्र की तुलना सीधे पारंपरिक थोक रिओमीटर (सामग्री की तालिका) के साथ प्राप्त मापों से की गई थी। ). rheological माप की repeatability तो एक intubated रोगी की स्थिति दमा (एसए) से पीड़ित से bronchoscopically काटा बलगम का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था, अस्थमा की तीव्रता का एक चरम रूप bronchospasm, eosinophilic सूजन, और बलगम hyperproduction की विशेषता एक पर्यावरणीय या संक्रामक एजेंट 8,20 के जवाब में . इस मामले में, एसए रोगी को गंभीर श्वसन विफलता के लिए प्रेरित किया गया था और आक्रामक मानक अस्थमा उपचारों के बावजूद अकेले यांत्रिक वेंटिलेशन के साथ रोगी को प्रभावी ढंग से और सुरक्षित रूप से समर्थन करने में असमर्थता के कारण ईसीएमओ (एक्स्ट्राकॉर्पोरियल झिल्ली ऑक्सीजनेशन) की आवश्यकता थी। लोबार पतन के लिए एक नैदानिक रूप से इंगित ब्रोंकोस्कोपी के दौरान, मोटे, स्पष्ट, दृढ़ स्राव को लोबार ब्रांकाई को बाधित करने के लिए नोट किया गया था और खारा धोने का उपयोग करके एस्पिरेटेड किया गया था। संग्रह के तुरंत बाद, अतिरिक्त खारा एस्पिरेट से हटा दिया गया था और शेष एसए नमूने के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों का विश्लेषण बेंचटॉप डिवाइस का उपयोग करके किया गया था। अतिरिक्त नमूना एलीकोट को कम करने वाले एजेंट, ट्राइस (2-कार्बोक्सिलिथाइल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड (टीसीईपी) के साथ इलाज किया गया था, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इस प्रोटोकॉल का उपयोग चिकित्सीय यौगिक प्रभावकारिता पूर्व विवो को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है।

परिणामों से पता चला है कि इस प्रोटोकॉल और बेंचटॉप डिवाइस का उपयोग नैदानिक सेटिंग में प्रभावी ढंग से किया जा सकता है। पीईओ एकाग्रता-निर्भर वक्र (चित्रा 1 ए) से निर्धारित rheological गुण परीक्षण किए गए बेंचटॉप डिवाइस और एक पारंपरिक समानांतर प्लेट रिओमीटर (चित्रा 1 बी) के बीच अप्रभेद्य थे। एसए बलगम के तीन गुना माप दोहराए जाने योग्य थे, जी * के लिए भिन्नता के 10% गुणांक के साथ, जी ', और जी" समापन बिंदु और बलगम व्हिस्कोइलिस्टिसिटी में पर्याप्त असामान्यताओं को प्रतिबिंबित करते थे जो इस रोगी के मामले में नैदानिक रूप से स्पष्ट थे (चित्रा 1 डी)। अंत में, TCEP के साथ पूर्व विवो उपचार के परिणामस्वरूप जी और जी "में महत्वपूर्ण कमी आई, और टैन δ में वृद्धि हुई, जो म्यूसिन नेटवर्क (चित्रा 2) में परिवर्तन द्वारा उपचार के प्रति जवाबदेही का प्रदर्शन करती है। अंत में, एक बेंचटॉप रिओमीटर का उपयोग करके यह प्रोटोकॉल क्लिनिक से प्राप्त बलगम नमूनों के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों का आकलन करने के लिए एक सरल और प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस क्षमता का उपयोग देखभाल के लिए सटीक दवा दृष्टिकोण को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि चिकित्सक ऑनसाइट अनुमोदित म्यूकोएक्टिव दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण कर सकते हैं, जो वैकल्पिक उपचार विकल्पों की पहचान करने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग नैदानिक परीक्षणों में जांच दवाओं के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

वर्तमान अध्ययन में, यूएनसी संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद नैदानिक रूप से इंगित ब्रोंकोस्कोपी के दौरान नमूने एकत्र किए गए थे।

1. थूक / बलगम संग्रह और भंडारण

  1. थूक संग्रह या ब्रोंकोस्कोपी आकांक्षा के माध्यम से वायुमार्ग बलगम ले लीजिए।
    1. थूक या तो सहज expectoration के माध्यम से इकट्ठा या 3% hypertonic खारा साँस लेने से थूक प्रेरित. वैकल्पिक रूप से, एक ब्रोन्कोस्कोपी प्रक्रिया के दौरान वायुमार्ग से सीधे एस्पिरेट बलगम।
    2. बाँझ नमूना कप में एकत्रित वायुमार्ग थूक / बलगम को स्टोर करें। थूक के मामले में, संग्रह पर तुरंत नमूने से अतिरिक्त लार को हटा दें।
    3. परिवहन के लिए नमूनों को बर्फ पर रखें। परिवहन समय को 4 घंटे से कम तक सीमित करें।
  2. संग्रह के समय नमूनों का विश्लेषण करें या संसाधित होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    1. भंडारण से पहले, धीरे से ऊपर और नीचे तीन से पांच बार एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट या पिपेट के साथ सीधे माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में पाइपेट करके बलगम को homogenize करें।
    2. प्रयोगों के लिए पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए वॉल्यूम ≥500 μL में भंडारण के लिए नमूनों को एलीकोट करें।
      नोट:: ठंड और thawing नमूने के viscoelastic गुणों को प्रभावित कर सकते हैं। केवल उन नमूनों की तुलना करें जो समान फ्रीज / पिघलने वाले चक्रों से गुजरे हैं।

2. नमूना तैयारी

  1. पिपेट ताजा और जमे हुए स्पुटा / बलगम सीधे या एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके नमूनों को समरूप करता है, धीरे से एलीकोटिंग से पहले तीन से पांच बार ऊपर और नीचे पिपेट करके।
    नोट:: Homogenization उन नमूनों के लिए महत्वपूर्ण है जिनमें मोटे प्लग होते हैं जो पुनरुत्पादन को प्रभावित कर सकते हैं।
  2. अलग-अलग माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में नमूने के 400-500 μL को एलीकोट करें। दोहराए जाने वाले माप और / या औषधीय अभिकर्मकों के साथ उपचार के लिए आवश्यक के रूप में कई ऐलीकोट तैयार करें (उदाहरण के लिए, rhDNase, N-acetyl सिस्टीन)। माप से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण करने के लिए एलीकोट को इनक्यूबेट करें।
  3. औषधीय एजेंटों (वैकल्पिक) के परीक्षण के लिए, नमूना कमजोर पड़ने को रोकने के लिए स्टॉक समाधानों की उच्च सांद्रता का उपयोग करें।
    1. वांछित अभिकर्मक (जैसे, TCEP) के 0.4% और 10% मात्रा (नमूना कमजोर पड़ने को कम करने के लिए) के बीच सीधे नमूने पर जोड़ें। सुनिश्चित करें कि यौगिक की कोई बूंद ट्यूब के किनारे पर नहीं रहती है।
    2. एक रासायनिक प्रतिक्रिया की अनुमति देने के लिए समय की वांछित लंबाई के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें (बलगम के प्रोटियोलिटिक गिरावट को रोकने के लिए <1 एच)।
    3. म्यूसिन नेटवर्क से समझौता किए बिना बलगम नमूने में अभिकर्मक के प्रगतिशील प्रवेश की अनुमति देने के लिए हर 2 मिनट में माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल को फ्लिक करके बलगम के नमूने और अभिकर्मक को मिलाएं (उदाहरण के लिए, सिलियरी पिटाई और म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस की नकल करना)। कई दवा अभिकर्मकों की तुलना करते समय, सुनिश्चित करें कि समय इनक्यूबेशन समान है।

3. साधन प्रारंभ और अंशांकन

  1. मशीन (सामग्री की तालिका) को चालू करें और सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें.
  2. नया मापन का चयन करें. जारी रखने के लिए माप ID और ऑपरेटर के अंतर्गत ऑपरेटर का नाम के अंतर्गत नमूना पहचान संख्या दर्ज करें. टिप्पणियाँ के अंतर्गत अतिरिक्त जानकारी या टिप्पणियाँ दर्ज करें.
  3. एक ज्यामिति सेट का चयन करें (यानी, किसी न किसी, या चिकनी 25 मिमी समानांतर प्लेटें) और यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्लेटें साफ और सही स्थिति में हैं, बड़ी और छोटी प्लेटों का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें।
    नोट: किसी न किसी प्लेटों को बड़ी मात्रा (350-500 μL) के लिए डिज़ाइन किया गया है और चिकनी प्लेटों को छोटे वॉल्यूम (250-350 μL) के लिए डिज़ाइन किया गया है। अनुशंसित से कम या उच्च नमूना मात्रा का उपयोग करने से गलत माप हो सकते हैं।
  4. बड़ी प्लेट को मजबूती से नीचे लुगदी पर डालें।
  5. छोटी प्लेट को धीरे से ऊपरी पल्पिट पर डालें और "क्लिक" सुनने तक थोड़ा घूर्णन करके प्लेट को लॉक करें, जो इंगित करता है कि प्लेट ठीक से क्लैंप की गई है। ध्यान दें कि ऊपरी प्लेट का मुक्त दोलन सामान्य है।
  6. तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि तापमान 37 डिग्री सेल्सियस लक्ष्य मान तक नहीं पहुंच जाता। उसके बाद, सॉफ़्टवेयर द्वारा संकेत के रूप में स्वत: अंशांकन प्रारंभ करें।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान मशीन या बेंचटॉप सतह को परेशान न करें।

4. नमूना लोड हो रहा है

  1. एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करते हुए, धीरे-धीरे बड़े नीचे की प्लेट के केंद्र पर नमूने के 250 और 500 μL के बीच पिपेट। एक बार प्लेट पर जमा होने के बाद, चिपचिपा नमूने एक गुंबद के आकार को अपनाएंगे जबकि अत्यधिक लोचदार नमूनों को शारीरिक विच्छेदन की आवश्यकता हो सकती है (विच्छेदन कैंची का उपयोग करें)।
    नोट: हवा के बुलबुले पेश करने से बचें। यदि आवश्यक हो, तो एक पिपेट टिप के साथ दूर धकेलकर अवशिष्ट बुलबुले को हटा दें।
  2. सॉफ्टवेयर के माध्यम से छोटी प्लेट ले जाने वाले मापने वाले सिर को कम करें और नमूने का निरीक्षण करें। यदि नीचे की प्लेट पर ठीक से लोड किया जाता है, तो नमूना संपर्क करेगा और दो प्लेटों के बीच केंद्रित होगा।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना अंतराल को भरता है (यानी, प्लेटों के किनारों पर फैलकर), कम अंतराल फ़ंक्शन का उपयोग करें जब तक कि नमूना अब द्विअबिकित आकार में नहीं है या प्लेटों के किनारे के साथ संरेखित नहीं है। Reduce Gap फ़ंक्शन 0.1 मिमी वेतन वृद्धि में मापने वाले सिर को कम करता है और सात वेतन वृद्धि तक सीमित है।
    नोट:: सावधानीपूर्वक नमूने की निगरानी करें और overspill से बचने के लिए उत्तरोत्तर अंतराल को समायोजित करें।
    1. यदि सात वेतन वृद्धि के बाद कोई अंतर रहता है, तो प्रारंभिक स्थिति में लौटने के लिए पुन: स्थापना पर क्लिक करें और नमूने की स्थिति और / या मात्रा को समायोजित करें।
    2. यदि अंतर बहुत कम हो जाता है (उदाहरण के लिए, द्विउत्तल आकार), तो ऊपरी प्लेट के किनारे के साथ एक परिपत्र गति द्वारा स्पैटुला के साथ अतिरिक्त नमूने को हटा दें। कतरनी तनाव से बचने के लिए अतिरिक्त नमूने को धीरे से ट्रिम करना सुनिश्चित करें।
      नोट:: इस चरण के अंत में, नमूना के किनारे ऊपरी प्लेट के किनारे के साथ संरेखित किया जाना चाहिए के रूप में उपयोगकर्ता दिशानिर्देशों में दिखाया गया है।
  4. दोलन के दौरान दूषित तरल पदार्थों के किसी भी आकस्मिक प्रक्षेपण से बचने के लिए सुरक्षात्मक कवर को कम करें।

5. बायोफिजिकल माप शुरू करें

  1. माप शुरू करने के लिए, प्रारंभ विश्लेषण पर क्लिक करें। एक पूर्ण चक्र में 4-7 मिनट लगेंगे।
    1. चक्र की पूरी लंबाई के दौरान जोर से बात करने और डिवाइस या बेंच को छूने से बचें। एक शांत वातावरण विशेष रूप से पहले 2 मिनट के लिए महत्वपूर्ण है।
      नोट: चक्र के दौरान, उपकरण एक मानकीकृत तनाव स्वीप परीक्षण करता है, जिसमें क्रमिक दोलन चरण होते हैं। प्रत्येक चरण स्थिर आयाम और आवृत्ति (1 हर्ट्ज) पर 10 दोलनों की एक श्रृंखला है, जिसके दौरान संबंधित टोक़ को वास्तविक समय में मापा जाता है। तनाव और टोक़ संकेत जटिल (जी *), लोचदार (जी'), और चिपचिपा (जी") मोडुली की गणना की अनुमति देते हैं, साथ ही साथ प्रत्येक चरण में अवमंदन अनुपात (तन δ) भी। दोलन धीरे-धीरे आयाम में वृद्धि होती है, जो नमूने पर लगाए गए विरूपण को तेज करती है।

6. नमूना हटाने

  1. एक बार चक्र पूरा हो जाने के बाद, मापने वाले सिर को बढ़ाने और नमूना विश्लेषण रिपोर्ट उत्पन्न करने के लिए नेक्स्ट पर क्लिक करें।
    नोट: रिपोर्ट के लिए, सॉफ़्टवेयर रिकॉर्ड किए गए डेटा की गणना करता है और स्वचालित रूप से नमूने के लिए लगाए गए विरूपण के संबंध में चिपचिपा और लोचदार मोडुली के विकास को दिखाने वाले दो वक्रों को रेखांकित करता है और रैखिक विस्कोइलिस्टिक शासन (यानी, कम विरूपण पर एक पठार) प्रदर्शित करता है यदि मौजूद है। यदि कोई रैखिक शासन का पता नहीं लगाया जाता है, तो G', G", G*, और tan δ के मान 0.05 स्ट्रेन पर निकाले जाते हैं। इसके अलावा, क्रॉसओवर तनाव और उपज तनाव (γसी, और σसी) की गणना टैन δ = 1 पर की जाती है। आगे के विश्लेषण के लिए प्रत्येक चरण के लिए स्प्रेडशीट में डेटा भी प्रदान किया जाता है।
  2. एक बार मापने वाला सिर पूरी तरह से वापस ले लिया जाता है, तो सुरक्षात्मक कवर उठाएं, नमूने को छोड़ दें और प्लेटों को सावधानीपूर्वक हटा दें। गर्म पानी और साबुन का उपयोग करके प्लेटों को साफ और कीटाणुरहित करें।
    नोट: बार-बार उपयोग करने से पहले ज्यामिति सेट को अच्छी तरह से सुखाएं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 viscoelastic नियंत्रण के एकाग्रता-निर्भर वक्रों का उपयोग करके rheological माप की सटीकता और पुनरावृत्ति को दर्शाता है, अर्थात्, polyethylene oxide (PEO) समाधान, और स्थिति दमा (एसए) बलगम। पांच अलग-अलग सांद्रता (1%, 1.5%, 2%, 2.5%, और 3%) पर 8 MDA PEO की व्हिस्कोइलिस्टिक विशेषताओं के माप की तुलना सीधे मूल्यांकन किए गए बेंचटॉप रिओमीटर और पारंपरिक बल्क रिओमीटर (सामग्री की तालिका) के बीच की गई थी। एसए बलगम के विपरीत, पीईओ समाधान पूरे तनाव सीमा में चिपचिपा-प्रभुत्व (जी "> जी') थे और क्रॉसओवर का प्रदर्शन नहीं करते थे और इसलिए, एक ठोस-जैसे व्यवहार प्रस्तुत करते थे। इसके अलावा, 1.5% पीईओ समाधान और नैदानिक एसए बलगम नमूने पर किए गए तीन गुना माप ने पुष्टि की कि रैखिक विस्कोइलिस्टिक विशेषताएं (जी *, जी', और जी ") जैविक नमूने से प्राप्त मूल्यों के लिए अत्यधिक दोहराने योग्य (<10% भिन्नता का गुणांक) थीं।

एसए रोगी में लोबर पतन के अवलोकन ने सुझाव दिया कि बलगम प्लगिंग फेफड़ों को यांत्रिक रूप से हवादार करने की क्षमता को जटिल कर सकता है और इस संभावना को बढ़ा सकता है कि गैर-मानक, म्यूकोलिटिक उपचारों पर विचार किया जा सकता है। चित्रा 2 में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग म्यूकोलिटिक एजेंट के साथ उपचार के बाद बलगम के विस्कोइलिस्टिक गुणों में परिवर्तन को मापने के लिए किया गया था। जबकि एनएसी को सीओपीडी और सीएफ के साथ उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है, इसे कम करने वाले एजेंट21 के रूप में धीमी गतिकी और कम शक्ति दिखाया गया था। TCEP को बलगम22 के बायोफिजिकल गुणों को संशोधित करने में अत्यधिक प्रभावी दिखाया गया है। एसए बलगम viscoelasticity पर TCEP के प्रभावों को बेंचटॉप रिओमीटर का उपयोग करके एक नैदानिक सेटिंग में परीक्षण किया गया था। म्यूकोलिटिक उपचार के परिणामस्वरूप जटिल मापांक (जी *) में 4.6 गुना, लोचदार मापांक (जी') में 5.1 गुना, चिपचिपा मापांक (जी") में 1.9 गुना, क्रॉसओवर स्ट्रेन (γसी) में 3.3 गुना, और क्रॉसओवर यील्ड तनाव (σसी) में 5.7 गुना तक की कमी के साथ एक अधिक तरल पदार्थ जैसा नमूना हुआ, और 2.8 गुना से अवमंदन अनुपात (तन δ) में वृद्धि हुई।

क्षेत्र प्राचल चिह्न इकाई परिभाषा मतलब
रैखिक विस्कोइलिस्टिक शासन (LVR) जटिल मापांक G* पीए रैखिक शासन में प्रतिनिधि व्हिस्कोइलिस्टिक व्यवहार आणविक नेटवर्क के विरूपण के लिए समग्र प्रतिरोध
G* = σ/γ
प्रत्यास्थ मापांक G' पीए रैखिक शासन में सामग्री की लोच आण्विक संरचना की कठोरता, आण्विक नेटवर्क कठोरता से संबंधित
→0 : नरम
→∞ : कठोर
चिपचिपा मापांक G" पीए रैखिक शासन में सामग्री की चिपचिपाहट ऊर्जा की अपरिवर्तनीय हानि जबकि संरचना बहुत कम तनाव के तहत आगे बढ़ रही है
→0 : शुद्ध ठोस
→∞ : हासीय
अवमंदन कारक टैन δ इकाईहीन रैखिक शासन में अवमंदन कारक ऊर्जा अपव्यय कारक, आणविक नेटवर्क आकृति विज्ञान से संबंधित है। कोई भी परिवर्तन आणविक प्रकृति में परिवर्तन को इंगित करता है।
tan δ = G'/G' →0 : शुद्ध ठोस
=1: गंदे / तरल संक्रमण
→∞ : शुद्ध तरल
जेल बिंदु क्रिटिकल या क्रॉसओवर स्ट्रेन γc  इकाईहीन जेल से प्रवाह व्यवहार में स्विच करते समय तनाव जेल की खिंचाव क्षमता, एक प्रवाह शुरू करने या एक ठोस को तोड़ने के लिए आवश्यक कुल विरूपण
→0 : भंगुर
→∞ : लचीला
क्रिटिकल या क्रॉसओवर यील्ड स्ट्रेस σc पीए प्रवाह व्यवहार पर स्विच करते समय तनाव जेल की ताकत, एक प्रवाह शुरू करने या एक ठोस को तोड़ने के लिए आवश्यक बल की मात्रा
→0 : कमजोर
→∞ : मजबूत

तालिका 1: रैखिक विस्कोइलिस्टिक मोडुली और जेल बिंदु विशेषताओं को बेंचटॉप रिओमीटर द्वारा मापा जाता है। डिवाइस एक कतरनी-तनाव स्वीप के साथ गतिशील दोलन का उपयोग करके तेजी से माप करता है ताकि रैखिक विस्कोइलिस्टिक (जी,जी", जी *, और टैन δ) मोडुली और जेल पॉइंट विशेषताओं (γसी और σसी) को ~ 5 मिनट के भीतर प्रदान किया जा सके। पैरामीटर, प्रतीक, इकाइयाँ, और माप का एक संक्षिप्त विवरण प्रदान किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: PEO समाधान और एसए बलगम के viscoelastic गुणों के माप. 8 एमडीए पीईओ के समाधान सांद्रता 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, और 3% पर तैयार किए गए थे। एसए बलगम एक ब्रोंकोस्कोपी प्रक्रिया के दौरान काटा गया था। बेंचटॉप रिओमीटर का उपयोग करके माप के लिए, 25 मिमी किसी न किसी प्लेटों और नमूने के 500 μL का उपयोग किया गया था। पारंपरिक थोक rheometer का उपयोग कर माप के लिए, 20 मिमी समानांतर चिकनी प्लेटों और पीईओ समाधान के 30 μL का उपयोग किया गया था। दोनों मापों को 1 हर्ट्ज की आवृत्ति पर चलाया गया था। (ए) 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, और 3% 8 MDA PEO का विश्लेषण करने वाले एकल चक्र से प्राप्त वक्र, नीले (i) में लोचदार मापांक (G') के विकास को दर्शाते हैं और लाल (ii) में चिपचिपा मापांक (G")। (बी) पीईओ समाधानों की सांद्रता बढ़ाने के लिए लोचदार (i) और चिपचिपा मोडुली (ii) की तुलना करने वाले वक्र, 5% तनाव पर बेंचटॉप और पारंपरिक रिओमीटर द्वारा विश्लेषण किए जाते हैं। (सी) एसए बलगम के जी और जी के विकास को दर्शाने वाले वक्र, बेंचटॉप रिओमीटर द्वारा मापा जाता है। तीर क्रॉसओवर स्ट्रेन (γc) को इंगित करता है, जो नरम-ठोस से तरल जैसे व्यवहार में संक्रमण को दर्शाता है। (D) ग्राफ़ क्रमशः रैखिक व्हिस्कोइलिस्टिक रिजीम (LVR) या 5% तनाव में 1.5% PEO (ब्लैक बार) और SA बलगम (ग्रे बार) के लिए (i) G*, (ii) G' और (iii) G" मानों को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एसए बलगम की viscoelasticity पर TCEP उपचार के प्रभाव। एसए बलगम से पहले (गैर-उपचारित या एनटी) और टीसीईपी उपचार (टीसीईपी) के बाद विश्लेषण किया गया था। उपचार में 500 μL एलीकोट (20 μM की अंतिम TCEP एकाग्रता) में 5 mM TCEP समाधान के 2 μL को जोड़ना शामिल था। NT और TCEP-उपचारित नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था और विश्लेषण से पहले हर 2 मिनट में ट्यूब के नीचे फ्लिक करके मिश्रित किया गया था। माप 1 हर्ट्ज की आवृत्ति पर दोलन तनाव के तहत किए गए थे। (ए) NT और TCEP-उपचारित एसए बलगम से वक्र (i) लोचदार (G') और (ii) चिपचिपा (G") मोडुली के विकास को दर्शाते हैं। क्षैतिज काली धराशायी रेखा रैखिक विस्कोइलिस्टिक शासन (LVR) को इंगित करती है और ऊर्ध्वाधर काली बिंदीदार रेखा उस घटना में 5% तनाव संदर्भ को इंगित करती है जिसे LVR स्थापित नहीं किया जा सकता है। (बी) जटिल मापांक (जी *), लोचदार मापांक (जी), चिपचिपा मापांक (जी"), अवमंदन अनुपात (टैन δ), क्रॉसओवर स्ट्रेन (γसी) और क्रॉसओवर यील्ड तनाव (σसी) की तुलना एनटी और टीसीईपी-उपचारित बलगम की तुलना संबंधित वक्रों से व्युत्पन्न। सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था, और पी मूल्यों को युग्मित टी-परीक्षणों का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। सभी रेखांकनों के लिए मान ±SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 के रूप में दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

बलगम के अद्वितीय व्हिस्कोइलिस्टिक गुण स्वस्थ वायुमार्ग को बनाए रखने में आवश्यक हैं। आंतरिक और बाहरी कारक वायुमार्ग बलगम बायोफिजिकल गुणों को बदल सकते हैं, जिससे म्यूको-ऑब्सट्रक्टिव बीमारियों की विशेषता वाली नैदानिक जटिलताएं हो सकती हैं। इसलिए, रोग की स्थिति के आकलन और उपचारों की खोज के दौरान बलगम व्हिस्कोइलिस्टिसिटी में परिवर्तन की निगरानी पर विचार किया जा सकता है जो बलगम व्हिस्कोइलिस्टिकिटी को कम करते हैं। 1980 के दशक के अनुभवजन्य अध्ययनों ने चुंबकीय मनका रिओमीटर23,24 का उपयोग करके बलगम रियोलॉजी और वायुमार्ग निकासी के बीच एक मजबूत संबंध का प्रदर्शन किया। हाल के वर्षों में, rheology कई तकनीकों का लाभ उठाने के लिए विकसित हुआ है जो विभिन्न पैमानों पर बलगम का विश्लेषण करते हैं। उदाहरण के लिए, माइक्रोरियोलॉजिकल एसेस चुंबकीय या फ्लोरोसेंट माइक्रोमीटर आकार के कणों के आंदोलन के आधार पर स्थानीय बलगम गुणों का वर्णन करने के लिए माइक्रोस्कोपिक जांच का उपयोग करते हैं। हालांकि, क्योंकि यह तकनीक छोटे नमूना वॉल्यूम का उपयोग करती है, इसलिए प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है जो थूक जैसे विषम नमूनों का वर्णन करता है। इसके अलावा, माइक्रोरहोलॉजी एसेस को उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप, महत्वपूर्ण गणना कौशल और समय लेने वाले विश्लेषणों की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार व्यापक प्रयोगशाला या क्लिनिक उपयोग के लिए खराब अनुकूल हैं।

जबकि माइक्रोरहोलॉजी और मैक्रोरियोलॉजी आमतौर पर तुलनीय नहीं होते हैं, इसी तरह की सीमाएं लंबे समय से स्थापित उपकरणों पर लागू होती हैं, जैसे कि शंकु / समानांतर प्लेट बल्क रिओमीटर। मैक्रोरहोलॉजी को घूर्णन शंकु, प्लेटों, कपों और / या विभिन्न आयामों के रोटर से सुसज्जित सटीक उपकरणों का उपयोग करके किया जाता है ताकि उप-एनएन तक बेहद छोटे टोक़ और विस्थापन को मापा जा सके। m और उप Å श्रेणियाँ. इस तरह के उच्च परिशुद्धता तक पहुंचने के लिए, अधिकांश वाणिज्यिक रिओमीटर को तेल, धूल या शोर से मुक्त वातावरण में एक संपीड़ित हवा की आपूर्ति और शीतलन प्रणाली के साथ सीधे संबंध की आवश्यकता होती है और आर्टिफैक्ट गठन को रोकने के लिए एक नियंत्रित परिवेश तापमान और आर्द्रता के साथ। इसके अतिरिक्त, जबकि पारंपरिक थोक रिओमीटर विशिष्ट चर के समायोजन के माध्यम से सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला को माप सकते हैं, इन उपकरणों के अंशांकन में महत्वपूर्ण समय लगता है और व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है।

इसके विपरीत, Rheomuco benchtop rheometer को विशेष रूप से बलगम और थूक के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया था और मिनटों के भीतर रैखिक व्हिस्कोइलिस्टिक और जेल-पॉइंट माप करने के लिए एक एकल अंशांकन चरण की आवश्यकता होती है। यह बेंचटॉप डिवाइस इंस्ट्रूमेंट कैलिब्रेशन या rheological डेटा विश्लेषण / गणना में व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता के बिना तेजी से और सटीक व्हिस्कोइलिस्टिक माप का उत्पादन करने के लिए एक सीधा और मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग करता है। डिवाइस एक तनाव स्वीप वक्र का उत्पादन करने के लिए नियंत्रित कोणीय विस्थापन के साथ दोलनों के बाद टोक़ और विस्थापन को मापने और एक रैखिक व्हिस्कोइलिस्टिक शासन या एलवीआर (तनाव के लिए समान व्हिस्कोइलिस्टिक प्रतिक्रिया का एक क्षेत्र, चित्रा 2 ए में एक क्षैतिज धराशायी रेखा के साथ इंगित किया गया है) स्थापित करने के लिए संचालित होता है, उस बिंदु तक पहुंचने से पहले जहां नमूना पैदावार होता है। ज्यादातर मामलों में, थूक के नमूने 1% -10% तनाव सीमा से अधिक एलवीआर के भीतर होते हैं। जब एक LVR का पता नहीं लगाया जाता है, तो 5% तनाव पर मान को आमतौर पर नमूने की व्हिस्कोइलिस्टिक विशेषताओं पर रिपोर्ट करने के लिए संदर्भित किया जाता है। एक पता लगाया गया LVR की अनुपस्थिति माप को अमान्य नहीं करती है, बल्कि एक नमूने को दर्शाती है जिसके गुण अधिकांश नमूनों से अलग (अधिक प्लास्टिक) हैं। इस उपकरण की संवेदनशीलता को यांत्रिक शोर के लिए उच्च सहिष्णुता प्रदान करते हुए बलगम के करीब चिपचिपा और लोचदार तरल पदार्थों की जरूरतों से मेल खाने के लिए अनुकूलित किया गया है, जो इसे नैदानिक सेटिंग्स में जैविक तरल पदार्थों के अध्ययन के लिए आदर्श बनाता है; हालांकि, यह अत्यंत कम (जैसे, लार) या अत्यंत उच्च (जैसे, कोयला-टार) लोचदार या चिपचिपा मोडुली के साथ अन्य व्हिस्कोइलिस्टिक सामग्री का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, जो प्रतिबंधित सॉफ़्टवेयर पैरामीटर के परिणामस्वरूप और प्लेट आकार, सतह, दूरी और घूर्णी आवृत्ति जैसे चर में हेरफेर करने में असमर्थता के परिणामस्वरूप होता है। PEO 8 MDa (चित्रा 1) पर एकाग्रता-निर्भर rheological माप ने इस डिवाइस की संवेदनशीलता (यानी, पता लगाने की निचली सीमा) के अनुमान की अनुमति दी, जो 8 MDA PEO के 0.3% और 0.4% या G* के लिए <0.05 Pa) के बीच है। हालांकि, 3% से अधिक PEO सांद्रता को घुलनशील बनाने की कठिनाई के कारण एक ऊपरी सीमा स्थापित नहीं की जा सकी। फिर भी, डिवाइस 3% 8 एमडीए पीईओ के लिए जी 'और जी" की रिपोर्ट करने में सक्षम था, जो एसए बलगम नमूनों (एसए की तुलना में ~ 5-गुना अधिक जी' और 25-गुना अधिक जी " की तुलना में अधिक व्हिस्कोइलिस्टिक है, बलगम बायोस्पीमेंस के लिए एक प्रासंगिक गतिशील सीमा का सुझाव देता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि दोलनों के दौरान सटीक माप प्राप्त करने के लिए, नमूने की एक उपयुक्त मात्रा को बुलबुले की उपस्थिति के बिना प्लेट के केंद्र में रखा जाना चाहिए। नमूना लोडिंग के दौरान, अपर्याप्त मात्रा, हवा के बुलबुले, और / या ऑफ-सेंटर प्लेसमेंट प्लेटों के साथ अपर्याप्त संपर्क पैदा करेगा, जिसके परिणामस्वरूप कम दर्ज किए गए मान होंगे। इसके विपरीत, नमूना अतिप्रवाह अतिरिक्त ड्रैग फोर्स25 के कारण अत्यधिक कतरनी तनाव पैदा करेगा।

यह अध्ययन वर्णन करता है कि संग्रह पर तुरंत मोटे बलगम के नमूनों को संसाधित, संग्रहीत और इलाज कैसे किया जाए। थूक rheology के अध्ययन का सामना करने वाली मुख्य चुनौतियों में से एक इन नमूनों की विषम प्रकृति और मानकीकृत माप दृष्टिकोण का विकास है। थूक एक expectorated पदार्थ है जो अक्सर लार से दूषित होता है जिसमें बैक्टीरिया और पाचन एंजाइम होते हैं जो तेजी से म्यूसिन नेटवर्क को बदल सकते हैं और बलगम व्हिस्कोइलिस्टिसिटी को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, संग्रह पर तुरंत और / या होमोजेनाइजेशन से पहले थूक के नमूनों से लार को हटाना महत्वपूर्ण है। प्रकृति से, बलगम चिपचिपा और संभालना मुश्किल है, लेकिन सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स का उपयोग म्यूसिन नेटवर्क से समझौता किए बिना समरूपता की सुविधा प्रदान करता है, सटीक एलीकोट तैयारी को सक्षम बनाता है, और नमूना लोडिंग को सरल बनाता है। प्रयोग के आधार पर, नमूना homogenization की आवश्यकता नहीं हो सकती है, लेकिन प्रतिकृति के बीच परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं। संग्रह के तुरंत बाद थूक को संसाधित करते समय, वायुमार्ग बलगम ठंड और पिघलने के बाद अद्वितीय बायोफिजिकल गुणों को बनाए रखता है। हालांकि, ठंड और पिघलना एक नमूने के समग्र rheology को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, केवल उन नमूनों की तुलना में एक दूसरे से तुलना की जानी चाहिए जो समान फ्रीज / पिघलने वाले चक्रों से गुजरे हैं। Mucoactive एजेंटों के प्रभावों का परीक्षण करते समय, यौगिक प्रसार को अनुकूलित करने के लिए प्रारंभिक नमूना homogenization महत्वपूर्ण है। साँस लेने के माध्यम से फेफड़ों को दवा वितरण उन मात्राओं को सीमित करता है जो लक्ष्य (यानी, बलगम प्लग) तक पहुंचते हैं, लेकिन म्यूकोसिलियरी परिवहन के साथ संयुक्त सिलिया की निरंतर पिटाई दवा और लक्ष्य के कुछ मिश्रण उत्पन्न करती है। विवो उपचार में अनुकरण करने के लिए, एक औषधीय एजेंट की छोटी मात्रा को सीधे नमूनों पर लागू किया जा सकता है और धीरे-धीरे इनक्यूबेशन समय में नियमित आंदोलन द्वारा मिश्रित किया जा सकता है। हालांकि, अन्य उपचार विधियों (उदाहरण के लिए, पेट्री डिश में नमूने पर दवा नेबुलाइजेशन) की जांच की जा सकती है। इनक्यूबेशन के दौरान कोमल आंदोलन यांत्रिक व्यवधान के कारण म्यूसिन नेटवर्क से समझौता किए बिना प्रगतिशील दवा प्रवेश सुनिश्चित करेगा (उदाहरण के लिए, भंवर या sonication)। वर्तमान में, TCEP का उपयोग नैदानिक सेटिंग्स में नहीं किया जाता है, लेकिन अन्य म्यूकोएक्टिव अभिकर्मकों, जैसे कि एनएसी, rhDNase, P-2119, ARINA-1, और PAAG की जांच म्यूको-ऑब्सट्रक्टिव स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए की जा रही है 21,26,27,28। अवधारणा सत्यापन के लिए, यह प्रदर्शित किया गया था कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग टीसीईपी उपचार के जवाब में दमा बलगम में महत्वपूर्ण परिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। एक अधिक तरल पदार्थ की तरह बलगम एक कम करने वाले एजेंट के साथ उपचार द्वारा उत्पादित किया गया था, जो निचले रैखिक व्हिस्कोइलिस्टिक और जेल पॉइंट मार्करों से स्पष्ट है, जो निकासी क्षमता में सुधार का सुझाव देता है। यद्यपि rhDNase ने CF में जबरदस्त नैदानिक लाभ का उत्पादन किया, यह आमतौर पर अन्य म्यूको-ऑब्सट्रक्टिव बीमारियों के लिए उपयोग नहीं किया जाता है, संभवतः क्रोनिक रूप से कम एक्स्ट्रासेल्युलर डीएनए सांद्रता के कारण। हालांकि, एक तीव्र वायरल और जीवाणु संक्रमण के दौरान, एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया अस्थायी रूप से उच्च बाह्य कोशिकीय डीएनए एकाग्रता का कारण बन सकती है और वायुमार्ग निकासी को कम कर सकती है। इसलिए, मामले-दर-मामले के आधार पर rhDNase प्रभावकारिता का तेजी से पूर्व विवो परीक्षण वायरल और जीवाणु-प्रेरित निमोनिया के इलाज के लिए मार्गदर्शन प्रदान कर सकता है। यह कोविड-19 महामारी के बीच विशेष रूप से मूल्यवान हो सकता है, जो श्वसन वायरस, सार्स-कोव -2 के कारण होता है।

संक्षेप में, वर्णित डिवाइस व्यवहार्य, तेजी से, और सटीक rheologic उपाय प्रदान करता है। ये विशेषताएं वायुमार्ग रोगों की स्थिति की जांच और निगरानी करने की क्षमता प्रदान करती हैं, साथ ही उपन्यास म्यूकोएक्टिव यौगिकों के प्रभावों का परीक्षण करती हैं। माप की तेजी और सादगी assays को ठंड और / या लंबे समय तक भंडारण या परिवहन के अस्थायी प्रभावों से संबंधित जटिलताओं के बिना प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, जबकि इन assays सेटिंग्स की एक विस्तृत विविधता में व्यवहार्य बनाते हैं। आखिरकार, इस दृष्टिकोण को विकल्पों के एक पैनल से व्यक्तिगत उपचारों के चयन के लिए खोजा जा सकता है, जिससे रोगी उपचार के वास्तविक समय की सिलाई की अनुमति मिलती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

इस पत्र वर्टेक्स फार्मास्यूटिकल्स (Ehre RIA पुरस्कार) और CFF-समर्थित अनुसंधान EHRE20XX0 से अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Pistons Tips Gilson CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3 TA Instruments DHR-3 Bulk Rheometer manufactured
by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software GraphPad Prism GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube Costar 3621
Peltier plate TA Instruments Temperature control system manufactured
by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide Sigma 372838 8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette Gilson M1000 Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco Rheonova Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries Rheonova D-1811-007 25mm Diameter
Rough Upper Geometries Rheonova U-1811-007 25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate TA Instruments 20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine Sigma 646547-10X1ML TCEP: Potent reducing agent.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
  2. Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
  3. Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
  4. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
  5. Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
  6. Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
  7. Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
  8. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  9. Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
  10. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  11. Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
  12. Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
  13. Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
  14. Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
  15. Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
  16. Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
  17. Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
  18. Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
  19. Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
  20. Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
  21. Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
  22. Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
  23. Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
  24. Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
  25. Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
  26. Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
  27. Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
  28. Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).

Tags

चिकित्सा अंक 182 वायुमार्ग श्वसन बलगम थूक म्यूको-ऑब्सट्रक्टिव अस्थमा सीओपीडी सिस्टिक फाइब्रोसिस रियोलॉजी रियोमीटर विस्कोलिस्टिक बायोफिजिकल माप
एक बेंचटॉप रिओमीटर का उपयोग करके वायुमार्ग बलगम के तेजी से व्हिस्कोइलिस्टिक लक्षण वर्णन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wykoff, J. A., Shaffer, K. M.,… More

Wykoff, J. A., Shaffer, K. M., Araba, K. C., Markovetz, M. R., Patarin, J., Robert de Saint Vincent, M., Donaldson, S. H., Ehre, C. Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer. J. Vis. Exp. (182), e63876, doi:10.3791/63876 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter