Summary
As propriedades viscoelásticas do muco desempenham um papel crítico na liberação mucociliaria. No entanto, as técnicas reológicas muco tradicionais requerem abordagens complexas e demoradas. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o uso de um reômetro de bancada que pode realizar de forma rápida e confiável medições viscoelásticas.
Abstract
Em doenças pulmonares muco-obstrutivas (por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística) e outras condições respiratórias (por exemplo, infecções virais/bacterianas), as propriedades biofísicas do muco são alteradas por hipersecreção de células de cálice, desidratação das vias aéreas, estresse oxidativo e presença de DNA extracelular. Estudos anteriores mostraram que a viscoelasticidade da escarro correlacionada com a função pulmonar e que tratamentos que afetam a reologia da escarro (por exemplo, mucolíticos) podem resultar em benefícios clínicos notáveis. Em geral, as medidas reológicas de fluidos não newtonianos empregam abordagens elaboradas e demoradas (por exemplo, reômetros de placas paralelas/cone e/ou rastreamento de partículas de microesferas) que requerem treinamento extensivo para realizar o ensaio e interpretar os dados. Este estudo testou a confiabilidade, a reprodutibilidade e a sensibilidade do Rheomuco, um dispositivo de bancada fácil de usar que foi projetado para realizar medições rápidas usando oscilação dinâmica com uma varredura de cepa de cisalhamento para fornecer moduli viscoelástico linear (G', G*, e características de δ ponto de gel) e ponta de gel (γc e σc) para amostras clínicas dentro de 5 min. O desempenho do dispositivo foi validado utilizando diferentes concentrações de um simulador de muco, 8 óxido de polietileno MDa (PEO) e contra as tradicionais medições de reologia a granel. Um isolado clínico colhido de um paciente entubado com estado asmático (SA) foi então avaliado em medidas triplicadas e o coeficiente de variação entre as medidas é <10%. O uso ex vivo de um potente agente redutor de muco, o TCEP, no muco SA resultou em uma redução de cinco vezes no módulo elástico e uma mudança em direção a um comportamento mais "líquido" no geral (por exemplo, maior bronzeamento δ). Juntos, esses resultados demonstram que o reômetro de bancada testado pode fazer medidas confiáveis de viscoelasticidade do muco em ambientes clínicos e de pesquisa. Em resumo, o protocolo descrito poderia ser usado para explorar os efeitos de drogas mucoativas (por exemplo, rhDNase, N-acetil cysteine) no local para adaptar o tratamento caso a caso, ou em estudos pré-clínicos de novos compostos.
Introduction
Doenças muco-obstrutivas das vias aéreas, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (CF) e outras condições respiratórias, como pneumonia viral e bacteriana, são preocupações de saúde prevalentes em todo o mundo. Embora a fisiopatologia varie muito entre cada condição, uma característica chave comum é o desembaraço mucociliar anormal. Em pulmões saudáveis, o muco alinha o epitélio das vias aéreas para capturar partículas inaladas e fornecer uma barreira física contra patógenos. Uma vez secretado, o muco das vias aéreas, composto por ~97,5% de água, 0,9% de sal, ~1,1% de proteínas globulares e ~0,5% de mucinas, é gradualmente transportado em direção ao glottis pela batida coordenada de cílio 1,2. As mucinas são grandes glicoproteínas ligadas ao O que interagem através de ligações não covalentes e covalentes para fornecer as distintas propriedades viscoelásticas do muco, que é necessária para um transporte eficiente3. Alterações na ultraestrutura da rede de mucina causadas pelo transporte de íons alterados, desdobramentos da mucina, interações eletrostáticas, ligação cruzada ou alterações na composição podem afetar significativamente a viscoelasticidade da mucocus e prejudicar o despejo mucociliário 4,5. Assim, identificar mudanças nas propriedades biofísicas do muco das vias aéreas é essencial para entender a patogênese da doença e testar novos compostos mucoativos6.
Vários fatores podem levar à produção de muco aberrante nos pulmões. Na DPOC, a inalação crônica de fumaça de cigarro desencadeia a hipersecreção do muco como resultado da metaplasia de células de cálice, bem como a desidratação das vias aéreas através da regulação da regulação da fibrose cística do canal cftr(CFTR), causando hiperconcentração do muco e obstrução das vias aéreaspequenas 7,8. Da mesma forma, a CF, uma desordem genética associada a mutações no gene CFTR, caracteriza-se pela produção de muco viscoso e aderente que é inadequado para o transporte 8,9. Em suma, a disfunção cftr induz o esgotamento líquido da superfície das vias aéreas, o emaranhamento de mucina polimérica e o aumento das interações bioquímicas, que resultam em inflamação crônica e infecções bacterianas. Além disso, as células inflamatórias presas no muco estático exacerbam ainda mais a viscoelasticidade do muco adicionando outra grande molécula, o DNA, na matriz de gel, piorando a obstrução das vias aéreas5. Um dos melhores exemplos da importância da reologia da muco na saúde geral dos pulmões é fornecido pelo exemplo de DNFase humano recombinante (rhDNase) no tratamento de pacientes com fibrose cística. Os efeitos do rhDNase foram demonstrados pela primeira vez ex vivo na escarro expectada, que mostrou uma transição do muco viscoso para um líquido fluindo em minutos10,11. Ensaios clínicos em pacientes com CF demonstraram que a redução da viscoelasticidade do muco das vias aéreas com a inalação de rhDNase diminuiu a taxa de exacerbações pulmonares, e melhorou a função pulmonar e o bem-estar geral do pacienteem 12,13,14. Como resultado, a inalação de rhDNase teve como objetivo facilitar a liberação tornou-se o padrão de atendimento aos pacientes cf por mais de duas décadas. Benefícios clínicos semelhantes foram observados com o uso de soro fisiônico hipertônico inalado para hidratação muco em CF, que se correlacionava com alterações nas propriedades reológicas e resultou em aceleração do desembaraço mucociliário e melhora da função pulmonar15,16. Por isso, um protocolo rápido e confiável para medir as propriedades viscoelásticas muco em ambientes clínicos é importante para otimizar abordagens terapêuticas.
O reômetro de bancada testado aqui oferece uma alternativa rápida e conveniente para realizar medições viscoelásticas abrangentes de amostras de muco/escarro. Utilizando oscilações dinâmicas com deslocamento angular controlado, o instrumento fornece deformação através de um par de placas paralelas ajustáveis (por exemplo, geometrias ásperas ou lisas) para medir o torque e o deslocamento com resoluções de 15 nN. m e 150 nm, respectivamente17. Uma calibragem padronizada padrão combinada com as diretrizes do usuário adaptadas para especialistas em não reologia permite medições simples e reduz o risco de erros do operador. O dispositivo produz uma curva de varredura de tensão que é processada e analisada em tempo real (dentro de ~5 min) e fornece automaticamente características viscoelásticas lineares (G', G", G*e tan δ) e de ponto de gel (γc, e σc) características (ver Tabela 1). O módulo elástico ou de armazenamento (G') descreve como uma amostra responde ao estresse (ou seja, a capacidade de retornar à sua forma original), enquanto o módulo viscoso ou de perda (G)descreve a energia dissipada por ciclo de deformação sinusoidal (ou seja, a energia perdida devido ao atrito das moléculas). O módulo complexo ou dinâmico (G*) é a razão do estresse com a tensão, que descreve a quantidade de acúmulo de força interna em resposta a um deslocamento de cisalhamento (ou seja, as propriedades viscoelásticas globais). O fator de amortecimento (δ) é a razão do módulo viscoso ao módulo elástico, que indica a capacidade de uma amostra de dissipar energia (ou seja, um baixo bronzeado δ indica um comportamento elástico-dominante/sólido, enquanto um alto bronzeado δ indica um comportamento viscoso-dominante/líquido-like). Para características de ponto de gel, a cepa de crossover (γc) é a medida da cepa de tesoura, calculada pela razão do caminho de deflexão para a altura da abertura do calha, na qual a amostra transita de um comportamento sólido para um líquido e ocorre, por definição, na tensão de oscilação onde G' = G" ou tan δ = 1. O estresse de rendimento cruzado (σc) é uma medida da quantidade de estresse aplicada pelo dispositivo em que o elástico e viscoso moduli cruzam. Em sputa saudável, a elasticidade domina a resposta mecânica à tensão (G' > G"). Nas doenças muco-obstrutivas, o aumento de G' e G" como resultado das alterações patológicas do muco 17,18,19. A simplicidade operacional do dispositivo facilita as medições no local e contorna a necessidade de armazenamento/transporte/envio de amostras para uma instalação offsite para análise, evitando assim os efeitos do tempo e do congelamento nas propriedades dessas amostras biológicas.
Neste estudo, foram utilizadas 8 soluções de óxido de polietileno MDa (PEO) de diferentes concentrações (1%-3%) para validar a faixa de medição de um reômetro de bancada comercial (Tabela de Materiais) e a curva dependente de concentração obtida foi diretamente comparada às medidas adquiridas com um reômetro a granel tradicional (Tabela de Materiais ). A repetibilidade das medidas reológicas foi então avaliada utilizando mucosoquiaticamente colhido de um paciente entubado que sofre de estado asmático (SA), uma forma extrema de exacerbação da asma caracterizada por broncoespasmo, inflamação eosinofílica e hiperprodução de muco em resposta a um agente ambiental ou infeccioso 8,20 . Neste caso, o paciente sa tinha sido entubado para insuficiência respiratória grave e necessitado de ECMO (oxigenação de membrana extracorpórea) devido à incapacidade de apoiar o paciente de forma eficaz e segura com ventilação mecânica, apesar das terapias agressivas padrão de asma. Durante uma broncoscopia clinicamente indicada para o colapso do lobar, secreções grossas, claras e tenazes foram notadas como obstruindo brônquios de lobar e foram aspiradas usando lavagem salina. Imediatamente após a coleta, o excesso de soro fisiológico foi removido do aspirado e as propriedades viscoelásticas da amostra SA restante foram analisadas utilizando-se o dispositivo benchtop. Alíquotas adicionais de amostra foram tratadas com um agente redutor, tris (2 carboxillethyl) cloridrato de fosfina (TCEP), para determinar se este protocolo poderia ser usado para caracterizar a eficácia do composto terapêutico ex vivo.
Os resultados mostraram que este protocolo e o dispositivo benchtop podem ser usados efetivamente em um ambiente clínico. As propriedades reológicas determinadas a partir de curvas dependentes de concentração de PEO (Figura 1A) eram indistinguíveis entre o dispositivo de bancada testado e um reômetro tradicional de placa paralela (Figura 1B). As medidas triplicadas do muco SA foram repetidas, com coeficiente de variação de 10% para pontos finais de G*, G'e G e G e refletiram as anormalidades substanciais na viscoelasticidade muco que foram clinicamente aparentes no caso deste paciente (Figura 1D). Por fim, o tratamento ex vivo com TCEP resultou em uma redução significativa em G' e G", e aumento do bronzeado δ, demonstrando receptividade ao tratamento por alterações na rede de mucina (Figura 2). Em conclusão, este protocolo utilizando um reômetro benchtop fornece uma abordagem simples e eficaz para avaliar propriedades viscoelásticas de amostras de muco obtidas da clínica. Essa capacidade pode ser usada para facilitar abordagens de medicina de precisão para o cuidado, já que os médicos podem testar a eficácia de medicamentos mucoativos aprovados no local, o que pode ajudar a identificar opções alternativas de tratamento. Além disso, essa abordagem pode ser usada em ensaios clínicos para examinar os efeitos de medicamentos investigatórios.
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Protocol
No presente estudo, as amostras foram coletadas durante uma broncoscopia clinicamente indicada após a obtenção de consentimento informado sob protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da UNC.
1. Coleta e armazenamento de escarro/muco
- Coletar muco das vias aéreas através da coleta de escarro ou aspiração de broncoscopia.
- Coletar escarro por meio de expectativa espontânea ou induzir escarro por 3% de inalação salina hipertônica. Alternativamente, aspirar diretamente muco das vias aéreas durante um procedimento de broncoscopia.
- Armazenar escarro/muco coletado nas vias aéreas coletadas em copos de espécimes estéreis. No caso da escarro, remova o excesso de saliva da amostra imediatamente após a coleta.
- Coloque as amostras no gelo para transporte. Limite o tempo de transporte para menos de 4h.
- Analise as amostras no momento da coleta ou armazene a -80 °C até que seja processada.
- Antes do armazenamento, homogeneize o muco ao escoar suavemente de três a cinco vezes com uma pipeta de deslocamento positiva ou pipeta diretamente nos tubos de microcentrifuuge.
- Alíquotar as amostras para armazenamento em volumes ≥500 μL para garantir volume suficiente para experimentos.
NOTA: O congelamento e o descongelamento podem afetar as propriedades viscoelásticas da amostra. Compare apenas amostras que sofreram ciclos semelhantes de congelamento/degelo.
2. Preparação da amostra
- Pipeta sputa/muco fresco e congelado diretamente ou homogeneiza amostras usando uma pipeta de deslocamento positiva, cochilando suavemente para cima e para baixo três a cinco vezes antes de aliquotar.
NOTA: A homogeneização é importante para amostras que contenham tampões grossos que possam afetar a reprodutibilidade. - Alíquota 400-500 μL da amostra em tubos de microcentrifuus separados. Prepare quantas alíquotas necessários para medir e/ou tratamento com reagentes farmacológicos (por exemplo, rhDNase, cisteína N-acetil). Incubar as alíquotas a serem testadas a 37 °C por um mínimo de 5 minutos antes da medição.
- Para testar agentes farmacológicos (opcional), utilize altas concentrações de soluções de estoque para evitar a diluição da amostra.
- Adicione entre 0,4% e 10% de volume (para minimizar a diluição da amostra) do reagente desejado (por exemplo, TCEP) diretamente na amostra. Certifique-se de que nenhuma gota do composto fique na lateral do tubo.
- Incubar as amostras a 37 °C pelo tempo desejado para permitir uma reação química (<1 h para evitar a degradação proteolítica do muco).
- Misture a amostra de muco e o reagente, mexendo o fundo do tubo de microcentrífuga a cada 2 minutos para permitir a penetração progressiva do reagente na amostra de muco sem comprometer a rede de mucina (por exemplo, imitando a batida ciliar e o despejo mucociliário). Ao comparar vários reagentes medicamentosos, certifique-se de que o tempo de incubação seja semelhante.
3. Inicialização e calibração do instrumento
- Ligue a máquina (Tabela de Materiais) e inicialize o software.
- Selecione Nova medição. Digite o número de identificação da amostra em Measure ID e o nome do operador em Operador para continuar. Insira informações adicionais ou comentários nos comentários.
- Selecione um conjunto de geometria (ou seja, placas paralelas ásperas ou lisas de 25 mm) e inspecione placas grandes e pequenas cuidadosamente para garantir que as placas estejam limpas e em perfeitas condições).
NOTA: As placas ásperas são projetadas para grandes volumes (350-500 μL) e placas lisas são projetadas para volumes menores (250-350 μL). O uso de um volume amostral menor ou maior do que o recomendado pode causar medidas imprecisas. - Insira a placa grande firmemente no púlpito inferior.
- Insira a placa pequena suavemente no púlpito superior e bloqueie a placa girando ligeiramente até ouvir um "clique", o que indica que a placa está devidamente presa. Note que a oscilação livre da placa superior é normal.
- Aguarde até que a temperatura atinja o valor-alvo de 37 °C. Em seguida, inicie a calibração automática conforme solicitado pelo software.
NOTA: Não perturbe a superfície da máquina ou do banco durante este processo.
4. Carregamento de amostras
- Utilizando uma pipeta de deslocamento positiva, pipeta lenta entre 250 e 500 μL da amostra no centro da grande placa inferior. Uma vez depositadas na placa, amostras viscosas adotarão uma forma de cúpula, enquanto amostras altamente elásticas podem exigir corte físico (use tesoura de dissecação).
NOTA: Evite introduzir bolhas de ar. Se necessário, remova bolhas residuais afastando-se com uma ponta de pipeta. - Abaixe a cabeça de medição carregando a pequena placa através do software e observe a amostra. Se estiver devidamente carregada na placa inferior, a amostra fará contato e será centrada entre as duas placas.
- Para garantir que a amostra preencha a lacuna (ou seja, espalhando-se para as bordas das placas), use a função Reduzir a Lacuna até que a amostra não esteja mais em forma biconcava ou esteja alinhada com a borda das placas. A função Reduce Gap reduz a cabeça de medição em incrementos de 0,1 mm e é limitada a sete incrementos.
NOTA: Monitore a amostra cuidadosamente e ajuste a lacuna progressivamente para evitar o excesso de depils.- Se uma lacuna permanecer após sete incrementos, clique em Redo Instalação para retornar à posição inicial e ajustar a posição e/ou volume da amostra.
- Se a lacuna for extremamente reduzida (por exemplo, forma biconvex), remova a amostra em excesso com uma espátula por um movimento circular ao longo da borda da placa superior. Certifique-se de aparar a amostra em excesso suavemente para evitar o estresse da tesoura.
NOTA: No final desta etapa, a borda da amostra deve estar alinhada com a borda da placa superior, como mostrado nas diretrizes do usuário.
- Abaixe a tampa protetora para evitar qualquer projeção acidental de fluidos contaminados durante a oscilação.
5. Iniciar a medição biofísica
- Para iniciar a medição, clique em Iniciar Análise. Um ciclo completo levará de 4 a 7 minutos.
- Evite falar alto e toque no dispositivo ou no banco durante toda a duração do ciclo. Um ambiente tranquilo é particularmente importante para os primeiros 2 minutos.
NOTA: Durante o ciclo, o instrumento realiza um teste padronizado de varredura de tensão, que consiste em sucessivas etapas oscilantes. Cada passo é uma série de 10 oscilações em constante amplitude e frequência (1 Hz), durante a qual o binário correspondente é medido em tempo real. Os sinais de tensão e torque permitem a computação do moduli complexo (G*), elástico (G') e viscoso (G), bem como a razão de amortecimento (δ bronzeada) em cada etapa. As oscilações aumentam gradualmente na amplitude, o que intensifica a deformação imposta à amostra.
- Evite falar alto e toque no dispositivo ou no banco durante toda a duração do ciclo. Um ambiente tranquilo é particularmente importante para os primeiros 2 minutos.
6. Remoção de amostras
- Uma vez que o ciclo esteja concluído, clique em Próximo para levantar a cabeça de medição e gerar o relatório de análise da amostra.
NOTA: Para o relatório, o software computa os dados registrados egrafia automaticamente duas curvas mostrando a evolução do viscoso e do moduli elástico em relação à deformação exercida à amostra e exibe o regime viscoelástico linear (ou seja, um platô em baixa deformação) se presente. Se não for detectado regime linear, os valores de G', G", G*e tan δ são extraídos a 0,05. Além disso, a cepa de crossover e o estresse de rendimento (γc, e σc) são calculados em δ bronzeada = 1. Os dados também são fornecidos em planilhas para cada etapa para análise posterior. - Uma vez que a cabeça de medição esteja totalmente retraída, levante a tampa protetora, descarte a amostra e remova cuidadosamente as placas. Limpe e desinfete as placas usando água morna e sabão.
NOTA: Seque bem o conjunto de geometria antes do uso repetido.
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Representative Results
A Figura 1 mostra a precisão e a repetibilidade das medidas reológicas utilizando curvas dependentes de concentração de controle viscoelástico, ou seja, solução de óxido de polietileno (PEO) e muco asmático de status (SA). As medições de características viscoelásticas de 8 MDa PEO em cinco concentrações diferentes (1%, 1,5%, 2%, 2%, 2,5% e 3%) foram diretamente comparadas entre o reômetro avaliado no bancada e um reômetro a granel tradicional (Tabela de Materiais). Em contraste com o muco SA, as soluções PEO foram dominadas por viscosos (G" > G') em toda a gama de cepas e não apresentaram crossover e, portanto, apresentaram um comportamento sólido. Além disso, as medições triplicadas realizadas em solução peo 1,5% e amostra clínica de muco SA confirmaram que as características viscoelásticas lineares (G*, G'e G)eram altamente repetíveis (coeficiente de variação de <10%) para os valores obtidos da amostra biológica.
A observação do colapso do lobar no paciente sa sugeriu que a conexão de muco poderia complicar a capacidade de ventilação mecanicamente dos pulmões e levantou a possibilidade de que terapias mucolíticas não padronizadas pudessem ser consideradas. Na Figura 2, o protocolo aqui descrito foi utilizado para medir alterações nas propriedades viscoelásticas do muco após o tratamento com um agente mucólítico. Embora o NAC tenha sido aprovado para uso com DPOC e CF, mostrou-se ter cinética lenta e baixa potência como agente redutor21. O TCEP tem se mostrado altamente eficaz na modificação das propriedades biofísicas do muco22. Os efeitos do TCEP na viscoelasticidade do muco SA foram testados em um ambiente clínico utilizando o reômetro benchtop. O tratamento mucolítico resultou em uma amostra mais fluida com uma diminuição do módulo complexo (G*) em 4,6 vezes, módulo elástico (G') por 5,1 vezes, módulo viscoso (G) por 1,9 vezes, tensão de crossover (γc) por 3,3 vezes, e estresse de rendimento de crossover (σc) em 5,7 vezes, e um aumento na razão de amortecimento (δ) em 2,8 vezes.
| Zona | Parâmetro | Símbolo | Unidade | Definição | Significado | ||||
| Regime Viscoelástico Linear (LVR) | Módulo Complexo | G* | Papai | Comportamento viscoelástico representativo no regime linear | Resistência global à deformação da rede molecular | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| Módulo Elástico | G' | Papai | Elasticidade do material no regime linear | Rigidez da estrutura molecular em repouso, relacionada à rigidez da rede molecular | |||||
| →0 : macio →∞ : duro |
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| Módulo Viscoso | G" | Papai | Viscosidade do material no regime linear | Perda irreversível de energia enquanto a estrutura está se movendo sob tensão muito baixa | |||||
| →0 : puro sólido →∞ : dissipativo |
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| Fator de amortecimento | δ bronzeado | Sem unidade | Fator de amortecimento no regime linear | Fator de dissipação de energia, relacionado à morfologia da rede molecular. Qualquer mudança indica uma mudança na natureza molecular. | |||||
| tan δ= G''/G' | →0 : puro sólido =1: transição suja/líquida →∞: líquido puro |
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| Ponto de Gel | Tensão crítica ou crossover | γc | Sem unidade | Tensão ao mudar de gel para comportamento de fluxo | Elasticidade do gel, a deformação total necessária para iniciar um fluxo ou quebrar um sólido | ||||
| →0 : frágil →∞ : flexível |
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| Estresse crítico ou de rendimento de crossover | σc | Papai | Estresse ao mudar para o comportamento de fluxo | Força do gel, a quantidade de força necessária para iniciar um fluxo ou quebrar um sólido | |||||
| →0 : fraco →∞ : forte |
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Tabela 1: Características lineares de moduli viscoelástico e ponto de gel medidos pelo reômetro do topo do banco. O dispositivo realiza medições rápidas usando oscilação dinâmica com uma varredura de cepa de cisalhamento para fornecer características de moduli e ponto de gel em linha viscoelástica (G', G*e tan δ) moduli e gel point (γc e σc) dentro de ~5 min. Parâmetros, símbolos, unidades e uma breve descrição das medidas são fornecidos.
Figura 1: Medidas das propriedades viscoelásticas das soluções PEO e muco SA. Soluções de 8 MDa PEO foram preparadas nas concentrações 1%, 1,5%, 2%, 2,5% e 3%. O muco SA foi colhido durante um procedimento de broncoscopia. Para as medições utilizando o reômetro de bancada, foram utilizadas placas ásperas de 25 mm e 500 μL da amostra. Para as medidas utilizando o reômetro a granel tradicional, foram utilizadas placas lisas paralelas de 20 mm e 30 μL de soluções PEO. Ambas as medições foram executadas em uma frequência de 1 Hz. (A) Curvas obtidas a partir de um único ciclo analisando 1%, 1,5%, 2%, 2,5% e 3% 8 MDa PEO, mostrando a evolução do módulo elástico (G') em azul (i) e módulo viscoso (G") em vermelho (ii). (B) Curvas comparando elástico (i) e viscoso moduli (ii) para o aumento das concentrações de soluções peo, analisadas por bancada e reômetros tradicionais com 5% de tensão. (C) Curvas que mostram a evolução de G' e G" de muco SA, medido pelo reômetro de bancada. A seta indica cepa de crossover (γc), que denota uma transição de comportamento macio-sólido para líquido. (D) Gráficos mostrando três medidas de replicação dos valores (i) G*, (ii) G' e (iii) G" para 1,5% de PEO (barras pretas) e muco SA (barras cinza) no regime viscoelástico linear (LVR) ou em 5% de tensão, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos do tratamento TCEP sobre a viscoelasticidade do muco SA. O muco SA foi analisado antes (não tratado ou NT) e após o tratamento do TCEP (TCEP). O tratamento consistiu em adicionar 2 μL de solução de 5 mM TCEP em alíquotas de 500 μL (concentração final de TCEP de 20 μM). As amostras tratadas com NT e TCEP foram incubadas por 20 min a 37 °C e misturadas por mexer o fundo do tubo a cada 2 minutos antes da análise. As medições foram realizadas sob tensão oscilante em uma frequência de 1 Hz. (A) Curvas do muco SA tratado de NT e TCEP mostrando a evolução do (i) elástico (G') e (ii) moduli viscoso (G). A linha horizontal de traço preto indica o regime viscoelástico linear (LVR) e a linha pontilhada preta vertical indica a referência de tensão de 5% no caso de não ser estabelecida uma LVR. (B) Comparação do módulo complexo (G*), módulo elástico (G'), módulo viscoso (G"), razão de amortecimento (δ), cepa de crossover (γc) e estresse de rendimento cruzado (σc) de muco tratado com NT e TCEP derivado das curvas correspondentes. Foi realizada análise estatística e adquiridos valores p por meio de testes t emparelhados. Os valores para todos os gráficos são mostrados como ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As propriedades viscoelásticas únicas do muco são essenciais na manutenção de vias aéreas saudáveis. Fatores internos e externos podem alterar as propriedades biofísicas do muco das vias aéreas, causando complicações clínicas características de doenças muco-obstrutivas. Assim, o monitoramento de mudanças na viscoelasticidade do muco pode ser considerado durante avaliações do estado da doença e exploração de terapias que reduzem a viscoelasticidade do muco. Estudos empíricos da década de 1980 demonstraram uma forte correlação entre a reologia do muco e o desembaraço das vias aéreas usando reômetros magnéticos23,24. Nos últimos anos, a reologia evoluiu para aproveitar várias técnicas que analisam o muco em várias escalas. Por exemplo, ensaios microrrehelógicos usam sondas microscópicas para descrever propriedades locais de muco com base no movimento de partículas magnéticas ou fluorescentes do tamanho de micromestre. No entanto, como essa técnica utiliza pequenos volumes amostrais, pode ser difícil obter dados representativos que descrevam amostras heterogêneas, como a escarro. Além disso, os ensaios de microrrehetologia requerem microscópios de alta resolução, habilidades significativas de computação e análises demoradas e, portanto, são pouco adequados para o uso generalizado de laboratórios ou clínicas.
Embora a microrreheologia e a macrorrequeologia não sejam tipicamente comparáveis, limitações semelhantes se aplicam a dispositivos há muito estabelecidos, como reômetros a granel de cone/placa paralela. A macrorrequeologia é realizada utilizando instrumentos de precisão equipados com cones, placas, copos e/ou rotores rotativos de várias dimensões para medir torques e deslocamentos extremamente pequenos até o sub nN. m e sub Å. Para atingir tal precisão, a maioria dos reômetros comerciais requer uma conexão direta com um sistema de fornecimento de ar comprimido e resfriamento em um ambiente livre de óleo, poeira ou ruído e com uma temperatura ambiente controlada e umidade para evitar a formação de artefatos. Além disso, enquanto os reômetros a granel tradicionais podem medir uma ampla gama de materiais através do ajuste de variáveis específicas, a calibração desses instrumentos leva um tempo significativo e requer um treinamento extensivo.
Em contraste, o reômetro do bancada rheomuco foi especificamente projetado para medir as propriedades viscoelásticas do muco e do escarro e requer uma única etapa de calibração para realizar medições viscosásticas lineares e ponto de gel em poucos minutos. Este dispositivo benchtop utiliza um protocolo simples e padronizado para produzir medições viscoelásticas rápidas e precisas sem a necessidade de treinamento extensivo na calibração de instrumentos ou análise/cálculo de dados reológicos. O dispositivo opera medindo o torque e o deslocamento seguindo oscilações com deslocamento angular controlado para produzir uma curva de varredura de tensão e estabelecer um regime viscoelástico linear ou LVR (uma região de resposta viscoelástica uniforme à tensão, indicada com uma linha horizontal tracejada na Figura 2A), antes de chegar ao ponto onde a amostra produz. Na maioria dos casos, as amostras de escarro estão dentro da LVR acima da faixa de tensão de 1%-10%. Quando um LVR não é detectado, o valor em 5% da cepa é comumente referenciado para relatar as características viscoelásticas da amostra. A ausência de uma LVR detectada não invalida a medição, mas reflete uma amostra cujas propriedades são distintas (mais plásticas) das da maioria das amostras. A sensibilidade deste instrumento é otimizada para corresponder às necessidades de fluidos viscosos e elásticos próximos ao muco, proporcionando alta tolerância ao ruído mecânico, o que o torna ideal para o estudo de fluidos biológicos em ambientes clínicos; no entanto, pode não ser adequado para estudar outros materiais viscosesticos com extremamente baixo (por exemplo, saliva) ou extremamente alto (por exemplo, carvão-alcatrão) elástico ou moduli viscoso como resultado de parâmetros de software restritos e a incapacidade de manipular variáveis como forma de placa, superfície, distância e frequência rotacional. As medidas reológicas dependentes da concentração em PEO 8 MDa (Figura 1) permitiram a estimativa de sensibilidade (ou seja, o menor limite de detecção) deste dispositivo, que é entre 0,3% e 0,4% de PEO de 8 MDa ou <0,05 Pa para G*. Um limite superior não poderia, no entanto, ser estabelecido devido à dificuldade de solubilizar concentrações de PEO superiores a 3%. No entanto, o dispositivo foi capaz de relatar G' e G" para 3% 8 MDa PEO, que é mais viscoelástico do que amostras de muco SA (~5 vezes maior G' e 25 vezes maior G" em comparação com SA), sugerindo um alcance dinâmico relevante para bioespecimens muco. Deve-se notar que, para obter medições precisas durante as oscilações, um volume apropriado da amostra deve ser colocado no centro da placa sem a presença de bolhas. Durante o carregamento da amostra, o volume insuficiente, bolhas de ar e/ou colocação fora do centro criarão contato inadequado com as placas, resultando em valores registrados mais baixos. Por outro lado, o estouro da amostra criará estresse excessivo de tesoura devido à força de arrasto adicional25.
Este estudo descreve como processar, armazenar e tratar amostras grossas de muco imediatamente após a coleta. Um dos principais desafios que confrontam os estudos da reologia do escarro é a natureza heterogênea dessas amostras e o desenvolvimento de abordagens de medição padronizadas. O escarro é uma substância esperançosa frequentemente contaminada com saliva que contém bactérias e enzimas digestivas que podem alterar rapidamente a rede de mucina e afetar a viscoelasticidade do muco. Portanto, é fundamental remover a saliva das amostras de escarro imediatamente após a coleta e/ou antes da homogeneização. Por natureza, o muco é pegajoso e difícil de manusear, mas o uso de pipetas de deslocamento positivo facilita a homogeneização sem comprometer a rede de mucina, permite uma preparação precisa de alíquotas e simplifica o carregamento da amostra. Dependendo do experimento, a homogeneização da amostra pode não ser necessária, mas pode minimizar a variabilidade entre as réplicas. Enquanto o processamento da escória imediatamente após a coleta é recomendado, o muco das vias aéreas mantém propriedades biofísicas únicas após o congelamento e o descongelamento. No entanto, o congelamento e o descongelamento podem afetar a reologia geral de uma amostra. Portanto, apenas amostras que tenham sofrido ciclos semelhantes de congelamento/degelo devem ser comparadas entre si. Ao testar os efeitos dos agentes mucoativos, a homogeneização inicial da amostra é importante para otimizar a difusão composta. A entrega de drogas aos pulmões por inalação limita os volumes que acessam o alvo (ou seja, o plugue do muco), mas a batida constante do cílio combinado com o transporte mucociliar gera alguma mistura da droga e do alvo. Para simular o tratamento in vivo, pequenos volumes de um agente farmacológico podem ser aplicados diretamente às amostras e gradualmente misturados por agitação regular durante o tempo de incubação. No entanto, outros métodos de tratamento (por exemplo, nebulização de drogas na amostra em uma placa de Petri) podem ser investigados. A agitação suave durante a incubação garantirá a penetração progressiva de medicamentos sem comprometer a rede de mucina devido a interrupções mecânicas (por exemplo, vórtice ou sonicação). Atualmente, o TCEP não é utilizado em ambientes clínicos, mas outros reagentes mucoativos, como NAC, rhDNase, P-2119, ARINA-1 e PAAG estão sendo investigados por uma ampla gama de condições muco-obstrutivas 21,26,27,28. Para validação conceitual, foi demonstrado que este protocolo pode ser usado para detectar alterações significativas no muco asmático em resposta ao tratamento do TCEP. Um muco mais fluido foi produzido pelo tratamento com um agente redutor, o que é aparente a partir dos marcadores viscoelásticos lineares inferiores e marcadores de ponto de gel, sugerindo uma melhoria na capacidade de liberação. Embora o rhDNase tenha produzido enormes benefícios clínicos em CF, ele não é tipicamente usado para outras doenças muco-obstrutivas, provavelmente devido a concentrações de DNA extracelulares cronicamente menores. No entanto, durante uma infecção viral aguda e bacteriana, uma forte resposta inflamatória pode causar temporariamente alta concentração extracelular de DNA e reduzir o desembaraço das vias aéreas. Assim, testes rápidos de ex vivo da eficácia do rhDNase caso a caso podem fornecer orientação para o tratamento de pneumonia viral e bacteriana. Isso pode ser especialmente valioso em meio à pandemia COVID-19, que é causada pelo vírus respiratório, SARS-CoV-2.
Em resumo, o dispositivo descrito fornece medidas reológicas viáveis, rápidas e precisas. Essas características fornecem o potencial para investigar e monitorar o estado das doenças das vias aéreas, bem como testar os efeitos de novos compostos mucoativos. A rapidez e a simplicidade das medidas permitem que os ensaios sejam realizados sem incorrer em complicações relacionadas ao congelamento e/ou aos efeitos temporais do armazenamento ou transporte prolongados, ao mesmo tempo em que viabilizam esses ensaios em uma ampla variedade de configurações. Em última análise, essa abordagem poderia ser explorada para a seleção de terapias personalizadas a partir de um painel de opções, permitindo a adaptação em tempo real do tratamento do paciente.
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Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
Este artigo é apoiado por subsídios da Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) e da CFF Research EHRE20XX0.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
References
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
- Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
- Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
- Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
- Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
- Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
- Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
- Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
- Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
- Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
- Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
- Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
- Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
- Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
- Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
- Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
- Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
- Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
- Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
- Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
- Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).
