Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Быстрая вязкоупругая характеристика слизи дыхательных путей с помощью настольного реометра

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63876

Summary

Вязкоупругие свойства слизи играют решающую роль в мукоцилиарном клиренсе. Однако традиционные реологические методы слизи требуют сложных и трудоемких подходов. Это исследование предоставляет подробный протокол для использования настольного реометра, который может быстро и надежно выполнять вязкоупругие измерения.

Abstract

При слизисто-обструктивных заболеваниях легких (например, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, муковисцидоз) и других респираторных заболеваниях (например, вирусные/бактериальные инфекции) биофизические свойства слизи изменяются гиперсекрецией бокаловидных клеток, обезвоживанием дыхательных путей, окислительным стрессом и присутствием внеклеточной ДНК. Предыдущие исследования показали, что вязкоупругость мокроты коррелирует с функцией легких и что лечение, влияющее на реологию мокроты (например, муколитики), может привести к замечательным клиническим преимуществам. В целом, реологические измерения неньютоновских жидкостей используют сложные, трудоемкие подходы (например, параллельные / конусно-пластинчатые реометры и / или отслеживание частиц микрогранул), которые требуют обширной подготовки для выполнения анализа и интерпретации данных. Это исследование проверило надежность, воспроизводимость и чувствительность Rheomuco, удобного для пользователя настольного устройства, которое предназначено для выполнения быстрых измерений с использованием динамических колебаний с сдвиговой деформацией для обеспечения линейных вязкоупругих модулей (G', G", G* и δ загара) и характеристик точки геля (γc и σc) для клинических образцов в течение 5 минут. Производительность устройства была проверена с использованием различных концентраций имитатора слизи, полиэтиленоксида 8 МДа (PEO) и по сравнению с традиционными объемными реологическими измерениями. Клинический изолят, собранный у интубированного пациента с астматическим статусом (SA), затем оценивали в трех измерениях, и коэффициент вариации между измерениями составляет <10%. Использование ex vivo мощного агента, уменьшающего слизь, TCEP, на слизи SA привело к пятикратному снижению модуля упругости и изменению в сторону более «жидкого» поведения в целом (например, более высокий δ загара). Вместе эти результаты демонстрируют, что испытанный настольный реометр может надежно измерять вязкоупругость слизи в клинических и исследовательских условиях. Таким образом, описанный протокол может быть использован для изучения эффектов мукоактивных препаратов (например, rhDNase, N-ацетилцистеина) на месте для адаптации лечения в каждом конкретном случае или в доклинических исследованиях новых соединений.

Introduction

Мукобструктивные заболевания дыхательных путей, включая астму, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), муковисцидоз (МВ) и другие респираторные заболевания, такие как вирусная и бактериальная пневмония, являются распространенными проблемами со здоровьем во всем мире. В то время как патофизиология сильно варьируется между каждым состоянием, общей ключевой особенностью является аномальный мукоцилиарный клиренс. В здоровых легких слизь выстилает эпителий дыхательных путей, чтобы улавливать вдыхаемые частицы и обеспечивать физический барьер против патогенов. После секретирования слизь дыхательных путей, состоящая из ~ 97,5% воды, 0,9% соли, ~ 1,1% глобулярных белков и ~ 0,5% муцинов, постепенно транспортируется к голосовой щели путем скоординированного биения ресничек 1,2. Муцины представляют собой большие O-связанные гликопротеины, которые взаимодействуют через нековалентные и ковалентные связи для обеспечения отчетливых вязкоупругих свойств слизи, которые необходимы для эффективного транспорта3. Изменения в ультраструктуре муциновой сети, вызванные измененным транспортом ионов, развертыванием муцина, электростатическими взаимодействиями, сшиванием или изменениями в составе, могут значительно влиять на вязкоупругость слизи и ухудшать мукоцилиарный клиренс 4,5. Следовательно, выявление изменений в биофизических свойствах слизи дыхательных путей имеет важное значение для понимания патогенеза заболевания и тестирования новых мукоактивных соединений6.

Различные факторы могут привести к выработке аберрантной слизи в легких. При ХОБЛ хроническое вдыхание сигаретного дыма вызывает гиперсекрецию слизи в результате метаплазии бокаловидных клеток, а также обезвоживание дыхательных путей через понижающую регуляцию канала трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR), вызывая гиперконцентрацию слизи и небольшую обструкцию дыхательных путей 7,8. Аналогичным образом, CF, генетическое расстройство, связанное с мутациями в гене CFTR, характеризуется производством вязкой, адгезивной слизи, которая недостаточна для транспорта 8,9. Короче говоря, дисфункция CFTR вызывает истощение жидкости на поверхности дыхательных путей, запутывание полимерного муцина и увеличение биохимических взаимодействий, что приводит к хроническому воспалению и бактериальным инфекциям. Кроме того, воспалительные клетки, захваченные в статическую слизь, еще больше усугубляют вязкоупругость слизи, добавляя еще одну большую молекулу, ДНК, в гель-матрицу, ухудшая обструкцию дыхательных путей5. Одним из лучших примеров важности реологии слизи для общего здоровья легких является пример рекомбинантной человеческой DNFase (rhDNase) при лечении пациентов с муковисцидозом. Эффекты rhDNase были впервые продемонстрированы ex vivo на отхаркивающуюся мокроту, которая показала переход от вязкой слизи к текучей жидкости в течение10,11 минут. Клинические испытания у пациентов с муковисцидозом показали, что снижение вязкоупругости слизи дыхательных путей при вдыхании rhDNase снижает частоту легочных обострений и улучшает функцию легких и общее самочувствие пациента 12,13,14. В результате ингаляция rhDNase, направленная на облегчение клиренса, стала стандартом ухода за пациентами с муковисцидозом на протяжении более двух десятилетий. Аналогичные клинические преимущества наблюдались при использовании ингаляционного гипертонического физиологического раствора для гидратации слизи при муковисцидозе, что коррелировало с изменениями реологических свойств и приводило к ускорению мукоцилиарного клиренса и улучшению функции легких15,16. Следовательно, быстрый и надежный протокол измерения вязкоупругих свойств слизи в клинических условиях важен для оптимизации терапевтических подходов.

Настольный реометр, протестированный здесь, предлагает быструю и удобную альтернативу для выполнения комплексных вязкоупругих измерений образцов слизи / мокроты. Используя динамические колебания с контролируемым угловым смещением, прибор обеспечивает деформацию с помощью пары регулируемых параллельных пластин (например, шероховатых или гладких геометрий) для измерения крутящего момента и смещения с разрешением 15 нН. м и 150 нм соответственно17. Стандартизированная калибровка по умолчанию в сочетании с рекомендациями пользователя, адаптированными для специалистов, не являющихся реологами, позволяет проводить простые измерения и снижает риск ошибок оператора. Устройство создает кривую развертки деформации, которая обрабатывается и анализируется в режиме реального времени (в течение ~ 5 мин) и автоматически обеспечивает как линейные вязкоупругие (G', G", G* и δ загара), так и точки геля (γc и σc) характеристики (см. Таблицу 1). Модуль упругости или накопления (G') описывает, как образец реагирует на напряжение (т.е. способность возвращаться к своей первоначальной форме), в то время как модуль вязкости или потерь (G") описывает энергию, рассеиваемую за цикл синусоидальной деформации (т.е. энергию, потерянную из-за трения молекул). Комплексный или динамический модуль (G*) — это отношение напряжения к деформации, которое описывает величину накопления внутренней силы в ответ на сдвиговое смещение (т. е. общие вязкоупругие свойства). Коэффициент демпфирования (тан δ) представляет собой отношение модуля вязкости к модулю упругости, что указывает на способность образца рассеивать энергию (т. Е. Низкий загар δ указывает на упруго-доминантное/твердое поведение, в то время как высокий δ загара указывает на вязко-доминантное/жидкостоподобное поведение). Для характеристик точки геля деформация кроссовера (γc) является мерой деформации сдвига, рассчитанной по отношению пути отклонения к высоте зазора сдвига, при которой образец переходит от твердого к жидкостоподобному поведению и возникает, по определению, при колебательной деформации, где G' = G" или загар δ = 1. Предел текучести кроссовера (σc) представляет собой меру величины напряжения, приложенного устройством, при котором пересекаются модули упругости и вязкости. У здоровой мокроты эластичность доминирует над механической реакцией на деформацию (G' > G). При слизисто-обструктивных заболеваниях как G', так и G" увеличиваются в результате патологических изменений слизи 17,18,19. Эксплуатационная простота устройства облегчает измерения на месте и позволяет обойти необходимость хранения/транспортировки/транспортировки/транспортировки проб на удаленный объект для анализа, что позволяет избежать воздействия времени и замораживания-оттаивания на свойства этих биологических образцов.

В этом исследовании для проверки диапазона измерений коммерческого настольного реометра (Таблица материалов) использовали 8 растворов полиэтиленоксида (ПЭО) различных концентраций (1%-3%), а полученную концентрационно-зависимую кривую непосредственно сравнивали с измерениями, полученными с помощью традиционного объемного реометра (Таблица материалов). ). Затем оценивали повторяемость реологических измерений с использованием бронхоскопически собранной слизи у интубированного пациента, страдающего астматическим статусом (SA), экстремальной формой обострения астмы, характеризующейся бронхоспазмом, эозинофильным воспалением и гиперпроизводством слизи в ответ на экологический или инфекционный агент 8,20 . В этом случае пациент с СА был интубирован для тяжелой дыхательной недостаточности и нуждался в ЭКМО (экстракорпоральная мембранная оксигенация) из-за неспособности эффективно и безопасно поддерживать пациента только с помощью механической вентиляции, несмотря на агрессивные стандартные методы лечения астмы. Во время клинически показанной бронхоскопии для долькового коллапса были отмечены густые, прозрачные, цепкие выделения, обструктирующие дольковые бронхи и аспирированные с использованием солевых промываний. Сразу после сбора излишки физиологического раствора удаляли из аспирата, а вязкоупругие свойства оставшегося образца SA анализировали с помощью настольного устройства. Дополнительные образцы аликвот обрабатывали восстановителем, трис (2-карбоксилэтил)фосфингидрохлоридом (TCEP), чтобы определить, может ли этот протокол быть использован для характеристики эффективности терапевтического соединения ex vivo.

Результаты показали, что этот протокол и настольное устройство могут эффективно использоваться в клинических условиях. Реологические свойства, определяемые по кривым, зависящим от концентрации ПЭО (рисунок 1А), были неразличимы между испытанным настольным устройством и традиционным параллельным пластинчатым реометром (рисунок 1В). Тройные измерения слизи SA были повторяемыми, с 10% коэффициентом вариации для конечных точек G*, G' и G" и отражали существенные аномалии вязкоупругости слизи, которые были клинически очевидны в случае этого пациента (рисунок 1D). Наконец, лечение ex vivo TCEP привело к значительному снижению G' и G" и увеличению δ загара, демонстрируя реакцию на лечение изменениями в сети муцина (рисунок 2). В заключение, этот протокол с использованием настольного реометра обеспечивает простой и эффективный подход к оценке вязкоупругих свойств образцов слизи, полученных из клиники. Эта возможность может быть использована для облегчения подходов точной медицины к лечению, поскольку клиницисты могут проверить эффективность одобренных мукоактивных препаратов на месте, что может помочь определить альтернативные варианты лечения. Кроме того, этот подход может быть использован в клинических испытаниях для изучения эффектов исследуемых препаратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

В настоящем исследовании образцы были собраны во время клинически показанной бронхоскопии после получения информированного согласия в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным наблюдательным советом UNC.

1. Сбор и хранение мокроты/слизи

  1. Сбор слизи дыхательных путей с помощью сбора мокроты или аспирации бронхоскопии.
    1. Собирайте мокроту либо с помощью спонтанного отхаркивания, либо индуцируйте мокроту путем 3% гипертонического физиологического раствора. В качестве альтернативы, непосредственно аспирировать слизь из дыхательных путей во время процедуры бронхоскопии.
    2. Храните собранную мокроту дыхательных путей / слизь в стерильных чашках для образцов. В случае мокроты удалите лишнюю слюну из образца сразу после сбора.
    3. Поместите образцы на лед для транспортировки. Ограничьте время транспортировки до менее 4 ч.
  2. Анализируйте образцы во время сбора или храните при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут обработаны.
    1. Перед хранением гомогенизируйте слизь, осторожно пипетируя вверх и вниз три-пять раз пипеткой с положительным смещением или пипеткой непосредственно в трубки микроцентрифуги.
    2. Аликвотирование образцов для хранения в объемах ≥500 мкл для обеспечения достаточного объема для экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание и оттаивание могут повлиять на вязкоупругие свойства образца. Сравнивайте только образцы, которые прошли аналогичные циклы замораживания/оттаивания.

2. Пробоподготовка

  1. Пипетки свежей и замороженной спута/слизи непосредственно или гомогенизируют образцы с использованием пипетки с положительным смещением, осторожно пипетируя вверх и вниз три-пять раз перед аликвотированием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация важна для образцов, содержащих толстые пробки, которые могут повлиять на воспроизводимость.
  2. Аликвота 400-500 мкл образца в отдельные микроцентрифужные пробирки. Приготовьте столько аликвот, сколько необходимо для повторных измерений и/или лечения фармакологическими реагентами (например, rhDNase, N-ацетилцистеин). Инкубируйте аликвоты, подлежащие испытанию при температуре 37 °C, в течение не менее 5 минут до измерения.
  3. Для тестирования фармакологических средств (необязательно) используют высокие концентрации стоковых растворов для предотвращения разбавления пробы.
    1. Добавьте от 0,4% до 10% объема (для минимизации разбавления образца) желаемого реагента (например, TCEP) непосредственно на образец. Убедитесь, что ни одна капля соединения не остается на боковой стороне трубки.
    2. Инкубируют образцы при 37 °C в течение желаемого периода времени, чтобы обеспечить химическую реакцию (<1 ч для предотвращения протеолитического разложения слизи).
    3. Смешайте образец слизи и реагента, щелкая нижней частью трубки микроцентрифуги каждые 2 мины, чтобы обеспечить прогрессирующее проникновение реагента в образец слизи без ущерба для муциновой сети (например, имитируя цилиарное биение и мукоцилиарный клиренс). При сравнении нескольких лекарственных реагентов убедитесь, что время инкубации одинаково.

3. Инициализация и калибровка прибора

  1. Включите машину (Таблица материалов) и инициализируйте программное обеспечение.
  2. Выберите Новое измерение. Введите идентификационный номер образца в поле Идентификатор меры и имя оператора в поле Оператор , чтобы продолжить. Введите дополнительную информацию или комментарии в разделе Комментарии.
  3. Выберите набор геометрии (например, грубые или гладкие 25-миллиметровые параллельные пластины) и тщательно осмотрите большие и маленькие пластины, чтобы убедиться, что пластины чистые и находятся в идеальном состоянии).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Грубые пластины предназначены для больших объемов (350-500 мкл), а гладкие пластины предназначены для меньших объемов (250-350 мкл). Использование меньшего или большего объема образца, чем рекомендуется, может привести к неточным измерениям.
  4. Плотно вставьте большую пластину на нижнюю кафедру.
  5. Аккуратно вставьте небольшую пластину на верхнюю кафедру и зафиксируйте пластину, слегка повернув, пока не услышите «щелчок», который указывает на то, что пластина правильно зажата. Отметим, что свободное колебание верхней пластины является нормальным.
  6. Подождите, пока температура не достигнет целевого значения 37 °C. Затем запустите автоматическую калибровку в соответствии с запросом программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокойте поверхность машины или стола во время этого процесса.

4. Загрузка образца

  1. Используя пипетку с положительным смещением, медленно пипетку между 250 и 500 мкл образца по центру большой нижней пластины. После нанесения на пластину вязкие образцы примут форму купола, тогда как высокоэластичные образцы могут потребовать физического разрыва (используйте рассекающие ножницы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения пузырьков воздуха. При необходимости удалите остаточные пузырьки, отталкиваясь кончиком пипетки.
  2. Опустите измерительную головку, несущую небольшую пластину с помощью программного обеспечения, и наблюдайте за образцом. При правильной загрузке на нижнюю пластину образец будет контактировать и центрироваться между двумя пластинами.
  3. Чтобы убедиться, что образец заполняет зазор (т.е. путем распространения к краям пластин), используйте функцию Reduce Gap до тех пор, пока образец больше не будет иметь двояковыпуклую форму или не будет выровнен с краем пластин. Функция Reduce Gap понижает измерительную головку с шагом 0,1 мм и ограничена семью шагами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно контролируйте образец и постепенно регулируйте зазор, чтобы избежать перелива.
    1. Если зазор остается после семи шагов, нажмите « Повторить установку», чтобы вернуться в исходное положение и отрегулировать положение и/или объем образца.
    2. Если зазор чрезмерно уменьшен (например, двояковыпуклая форма), удалите лишний образец шпателем круговым движением вдоль края верхней пластины. Обязательно аккуратно обрежьте лишний образец, чтобы избежать напряжения сдвига.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этого шага край образца должен быть выровнен с краем верхней пластины, как показано в руководстве пользователя.
  4. Опустите защитную крышку, чтобы избежать случайного выпадения загрязненных жидкостей во время колебаний.

5. Начало биофизического измерения

  1. Чтобы начать измерение, нажмите кнопку Начать анализ. Полный цикл займет 4-7 мин.
    1. Избегайте громких разговоров и прикосновений к устройству или скамейке в течение всего цикла. Тихая обстановка особенно важна в течение первых 2 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение цикла прибор выполняет стандартизированное испытание на развертку деформации, которое состоит из последовательных колебательных ступеней. Каждый шаг представляет собой серию из 10 колебаний при постоянной амплитуде и частоте (1 Гц), во время которых соответствующий крутящий момент измеряется в режиме реального времени. Сигналы деформации и крутящего момента позволяют вычислять комплексный (G*), упругий (G') и вязкий (G") модули, а также коэффициент демпфирования (tan δ) на каждом шаге. Колебания постепенно увеличиваются в амплитуде, что усиливает деформацию, наложенную на образец.

6. Удаление образцов

  1. После завершения цикла нажмите кнопку Далее , чтобы поднять измерительную головку и сгенерировать отчет об анализе образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для отчета программное обеспечение вычисляет записанные данные и автоматически строит графики двух кривых, показывающих эволюцию вязкости и модулей упругости по отношению к деформации, оказываемой на образец, и отображает линейный вязкоупругий режим (т.е. плато при низкой деформации), если таковой имеется. Если линейный режим не обнаружен, значения G', G", G* и δ загара извлекаются при деформации 0,05. Кроме того, деформация кроссовера и предел текучести (γc и σc) рассчитываются при δ загара = 1. Данные также предоставляются в электронных таблицах для каждого шага для дальнейшего анализа.
  2. Как только измерительная головка будет полностью убрана, поднимите защитную крышку, выбросьте образец и аккуратно снимите пластины. Очистите и продезинфицируйте тарелки, используя теплую воду и мыло.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно высушите геометрию перед повторным использованием.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На фиг.1 показана точность и повторяемость реологических измерений с использованием концентрационно-зависимых кривых вязкоупругого контроля, т.е. раствора полиэтиленоксида (ПЭО) и состояния астматической (SA) слизи. Измерения вязкоупругих характеристик ПЭО 8 МДа при пяти различных концентрациях (1%, 1,5%, 2%, 2,5% и 3%) были непосредственно сопоставлены между оцененным настольным реометром и традиционным объемным реометром (Таблица материалов). В отличие от слизи SA, растворы PEO были с вязко-преобладанием (G" > G') во всем диапазоне штаммов и не проявляли кроссовера и, следовательно, представляли твердоподобное поведение. Кроме того, тройные измерения, выполненные на 1,5% растворе ПЭО и клиническом образце слизи SA, подтвердили, что линейные вязкоупругие характеристики (G*, G' и G") были высоковоспроизводимыми (коэффициент вариации <10%) для значений, полученных из биологического образца.

Наблюдение за коллапсом дольки у пациента с СА показало, что закупорка слизи может усложнить способность механически вентилировать легкие и повысила вероятность того, что можно было бы рассмотреть вопрос о нестандартной муколитической терапии. На фиг.2 протокол, описанный в настоящем описании, использовали для измерения изменений вязкоупругих свойств слизи после обработки муколитическим агентом. Хотя NAC был одобрен для использования с ХОБЛ и CF, было показано, что он имеет медленную кинетику и низкую эффективность в качестве восстановителя21. Было показано, что TCEP очень эффективен при модификации биофизических свойств слизи22. Влияние TCEP на вязкоупругость слизи SA было проверено в клинических условиях с использованием настольного реометра. Муколитическая обработка привела к получению более жидкого образца с уменьшением модуля комплекса (G*) в 4,6 раза, модуля упругости (G') в 5,1 раза, модуля вязкости (G") в 1,9 раза, перекрестной деформации (γc) в 3,3 раза и перекрестного предела текучести (σc) в 5,7 раза, а также увеличение коэффициента демпфирования (tan δ) в 2,8 раза.

Зона Параметр Символ Единица Определение Значение
Линейный вязкоупругий режим (LVR) Модуль комплексного уклада G* Папа Репрезентативное вязкоупругое поведение в линейном режиме Общая устойчивость молекулярной сети к деформации
G* = σ/γ
Модуль упругости G' Папа Упругость материала в линейном режиме Жесткость молекулярной структуры в состоянии покоя, связанная с жесткостью молекулярной сети
→0 : мягкий
→∞ : жесткий
Модуль вязкости G" Папа Вязкость материала в линейном режиме Необратимая потеря энергии при движении конструкции при очень низком напряжении
→0 : чистое твердое вещество
→∞ : диссипативный
Коэффициент демпфирования δ загара Без единиц измерения Коэффициент демпфирования в линейном режиме Коэффициент диссипации энергии, связанный с морфологией молекулярной сети. Любое изменение указывает на изменение молекулярной природы.
тан δ = G''/G' →0 : чистое твердое вещество
=1: переход загрязненный/жидкий
→∞ : чистая жидкость
Гель Пойнт Критическая или перекрестная деформация γс  Без единиц измерения Деформация при переходе от геля к поведению потока Растяжимость геля, полная деформация, необходимая для запуска потока или разрушения твердого вещества
→0 : хрупкий
→∞ : гибкий
Критическое или перекрестное давление на выход σс Папа Стресс при переходе на поведение потока Прочность геля, количество силы, необходимое для запуска потока или разрушения твердого вещества
→0 : слабый
→∞ : сильный

Таблица 1: Линейные модули вязкоупругости и точки геля, измеренные настольным реометром. Прибор выполняет быстрые измерения с использованием динамических колебаний с разверткой сдвига-деформации для обеспечения линейных вязкоупругих (G', G", G* и δ загар) модулей и характеристик точки геля (γc и σc) в течение ~ 5 мин. Приведены параметры, символы, единицы измерения и краткое описание измерений.

Figure 1
Рисунок 1: Измерения вязкоупругих свойств растворов ПЭО и слизи SA. Растворы 8 МДа ПЭО готовили в концентрациях 1%, 1,5%, 2%, 2,5% и 3%. Слизь SA была собрана во время процедуры бронхоскопии. Для измерений с использованием настольного реометра использовались грубые пластины толщиной 25 мм и 500 мкл образца. Для измерений с использованием традиционного объемного реометра использовались 20 мм параллельные гладкие пластины и 30 мкл растворов ПЭО. Оба измерения проводились на частоте 1 Гц. (A) Кривые, полученные из одного цикла, анализировали 1%, 1,5%, 2%, 2,5% и 3% 8 МДа PEO, показывая эволюцию модуля упругости (G') синим (i) и модуля вязкости (G") красного цвета (ii). (B) Кривые, сравнивающие модули упругости (i) и вязкости (ii) для повышения концентрации растворов PEO, проанализированные настольными и традиционными реометрами при 5% деформации. (C) Кривые, показывающие эволюцию G' и G" слизи SA, измеренные настольным реометром. Стрелка указывает на перекрестную деформацию (γc), которая обозначает переход от мягкого твердого к жидкостному поведению. (D) Графики, показывающие три реплицированных измерения значений (i) G*, (ii) G' и (iii) G" для 1,5% PEO (черные полосы) и СЛИ SA (серые полосы) в линейном вязкоупругом режиме (LVR) или при 5% деформации соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние лечения TCEP на вязкоупругость слизи SA. Слизь SA анализировали до (необработанной или NT) и после лечения TCEP (TCEP). Лечение состояло из добавления 2 мкл раствора TCEP 5 мМ в 500 мкл аликвот (конечная концентрация TCEP 20 мкМ). Образцы, обработанные NT и TCEP, инкубировали в течение 20 мин при 37 °C и смешивали, щелкая дном трубки каждые 2 минуты перед анализом. Измерения проводили при колеблющейся деформации на частоте 1 Гц. (A) Кривые из СЛИ SA, обработанной NT и TCEP, показывающие эволюцию (i) упругих (G') и (ii) вязких (G") модулей. Горизонтальная черная пунктирная линия указывает на линейный вязкоупругий режим (LVR), а вертикальная черная пунктирная линия указывает на 5% деформационную привязку в случае, если LVR не может быть установлен. B) Сопоставление комплексного модуля упругости (G*), модуля упругости (G'), модуля вязкости (G"), коэффициента демпфирования (tan δ), деформации кроссовера (γc) и предела текучести кроссовера (σc) слизи, обработанной NT и TCEP, полученной из соответствующих кривых. Был проведен статистический анализ, и значения p были получены с помощью парных t-тестов. Значения для всех графиков показаны как ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Уникальные вязкоупругие свойства слизи имеют важное значение для поддержания здоровья дыхательных путей. Внутренние и внешние факторы могут изменять биофизические свойства слизи дыхательных путей, вызывая клинические осложнения, характерные для мукобструктивных заболеваний. Следовательно, мониторинг изменений вязкоупругости слизи может быть рассмотрен во время оценки состояния заболевания и изучения методов лечения, которые снижают вязкоупругость слизи. Эмпирические исследования 1980-х годов продемонстрировали сильную корреляцию между реологией слизи и клиренсом дыхательных путей с использованием магнитных бисерных реометров23,24. В последние годы реология эволюционировала, чтобы использовать несколько методов, которые анализируют слизь в различных масштабах. Например, микрореологические анализы используют микроскопические зонды для описания местных свойств слизи на основе движения магнитных или флуоресцентных частиц микрометрового размера. Однако, поскольку этот метод использует небольшие объемы выборки, может быть трудно получить репрезентативные данные, описывающие гетерогенные образцы, такие как мокрота. Кроме того, микрореологические анализы требуют микроскопов с высоким разрешением, значительных навыков вычислений и трудоемких анализов и, следовательно, плохо подходят для широкого использования в лаборатории или клинике.

Хотя микрореология и макрореология обычно не сопоставимы, аналогичные ограничения применяются к давно установленным устройствам, таким как конусные / параллельные пластинчатые объемные реометры. Макрореология выполняется с использованием прецизионных приборов, оснащенных вращающимися конусами, пластинами, чашками и / или роторами различных размеров для измерения чрезвычайно малых крутящих моментов и перемещений вплоть до суб-nN. m и sub Å диапазоны. Для достижения такой высокой точности большинство коммерческих реометров требуют прямого соединения с системой подачи и охлаждения сжатого воздуха в среде, свободной от масла, пыли или шума, и с контролируемой температурой и влажностью окружающей среды для предотвращения образования артефактов. Кроме того, в то время как традиционные объемные реометры могут измерять широкий спектр материалов путем настройки конкретных переменных, калибровка этих приборов занимает значительное время и требует обширной подготовки.

Напротив, настольный реометр Rheomuco был специально разработан для измерения вязкоупругих свойств слизи и мокроты и требует одного шага калибровки для выполнения линейных измерений вязкоупругости и гелевой точки в течение нескольких минут. Это настольное устройство использует простой и стандартизированный протокол для получения быстрых и точных вязкоупругих измерений без необходимости обширной подготовки в области калибровки приборов или анализа / расчета реологических данных. Устройство работает путем измерения крутящего момента и смещения после колебаний с контролируемым угловым смещением для получения кривой развертки деформации и установления линейного вязкоупругогого режима или LVR (область равномерного вязкоупругого отклика на деформацию, обозначенная горизонтальной пунктирной линией на фиг.2A), прежде чем достичь точки, где образец дает. В большинстве случаев образцы мокроты находятся в пределах LVR в диапазоне деформаций 1%-10%. Когда LVR не обнаруживается, значение при 5% деформации обычно упоминается для отчета о вязкоупругих характеристиках образца. Отсутствие обнаруженного LVR не делает измерение недействительным, а скорее отражает образец, свойства которого отличаются (более пластичны) от свойств большинства образцов. Чувствительность этого прибора оптимизирована для удовлетворения потребностей вязких и эластичных жидкостей, близких к слизи, обеспечивая при этом высокую устойчивость к механическому шуму, что делает его идеальным для изучения биологических жидкостей в клинических условиях; однако он может не подходить для изучения других вязкоупругих материалов с чрезвычайно низким (например, слюна) или чрезвычайно высоким (например, каменноугольная смола) упругими или вязкими модулями в результате ограниченных программных параметров и невозможности манипулировать такими переменными, как форма пластины, поверхность, расстояние и частота вращения. Зависящие от концентрации реологические измерения на ПЭО 8 МДа (рисунок 1) позволили оценить чувствительность (т.е. нижний предел обнаружения) этого прибора, которая составляет от 0,3% до 0,4% от 8 МДа ПЭО или <0,05 Па для G*. Однако верхний предел установить не удалось из-за трудности солюбилизации концентраций ПЭО выше 3%. Тем не менее, устройство смогло сообщить о G' и G" для 3% 8 MDa PEO, что является более вязкоупругим, чем образцы слизи SA (~ в 5 раз больше G' и в 25 раз больше G" по сравнению с SA), предполагая соответствующий динамический диапазон для биообразцов слизи. Следует отметить, что для получения точных измерений во время колебаний соответствующий объем образца необходимо поместить в центр пластины без присутствия пузырьков. Во время загрузки образца недостаточный объем, пузырьки воздуха и/или размещение вне центра создадут недостаточный контакт с пластинами, что приведет к снижению зарегистрированных значений. И наоборот, переполнение образца создаст чрезмерное напряжение сдвига из-за дополнительной силы сопротивления25.

Это исследование описывает, как обрабатывать, хранить и обрабатывать толстые образцы слизи сразу после сбора. Одной из основных проблем, стоящих перед исследованиями реологии мокроты, является гетерогенный характер этих образцов и разработка стандартизированных подходов к измерению. Мокрота является отхаркивающимся веществом, часто загрязненным слюной, которая содержит бактерии и пищеварительные ферменты, которые могут быстро изменять муциновую сеть и влиять на вязкоупругость слизи. Поэтому крайне важно удалять слюну из образцов мокроты сразу после сбора и /или до гомогенизации. По своей природе слизь липкая и сложная в обращении, но использование пипеток с положительным смещением облегчает гомогенизацию без ущерба для муциновой сети, обеспечивает точную подготовку аликвоты и упрощает загрузку образца. В зависимости от эксперимента гомогенизация образца может не потребоваться, но может свести к минимуму изменчивость между репликациями. При обработке мокроты сразу после сбора слизь дыхательных путей сохраняет уникальные биофизические свойства после замораживания и оттаивания. Однако замораживание и оттаивание могут повлиять на общую реологию образца. Поэтому следует сравнивать только образцы, прошедшие аналогичные циклы замораживания/оттаивания. При тестировании эффектов мукоактивных агентов важна первоначальная гомогенизация образца для оптимизации диффузии соединений. Доставка лекарств в легкие посредством вдыхания ограничивает объемы, которые получают доступ к мишени (т. Е. Слизистая пробка), но постоянное биение ресничек в сочетании со мукоцилиарным транспортом создает некоторое смешивание препарата и мишени. Для имитации лечения in vivo небольшие объемы фармакологического агента могут быть нанесены непосредственно на образцы и постепенно смешаны путем регулярного перемешивания в течение всего времени инкубации. Однако другие методы лечения (например, распыление лекарственного средства на образец в чашке Петри) могут быть исследованы. Мягкое перемешивание во время инкубации обеспечит прогрессирующее проникновение препарата без ущерба для сети муцина из-за механического разрушения (например, вихря или обработки ультразвуком). В настоящее время TCEP не используется в клинических условиях, но другие мукоактивные реагенты, такие как NAC, rhDNase, P-2119, ARINA-1 и PAAG, исследуются для широкого спектра слизисто-обструктивных состояний 21,26,27,28. Для валидации концепции было продемонстрировано, что этот протокол может быть использован для обнаружения значительных изменений в астматической слизи в ответ на лечение TCEP. Более жидкоподобная слизь была получена путем обработки восстановителем, что видно из нижних линейных вязкоупругих и гелевых точечных маркеров, что свидетельствует об улучшении способности к клиренсу. Хотя rhDNase произвела огромные клинические преимущества при муковисцидозе, она обычно не используется для других слизисто-обструктивных заболеваний, вероятно, из-за хронически более низких концентраций внеклеточной ДНК. Однако во время острой вирусной и бактериальной инфекции сильная воспалительная реакция может временно вызвать высокую концентрацию внеклеточной ДНК и снизить клиренс дыхательных путей. Следовательно, быстрое тестирование эффективности rhDNase ex vivo в каждом конкретном случае может служить руководством для лечения вирусной и бактериальной пневмонии. Это может быть особенно ценно на фоне пандемии COVID-19, которая вызвана респираторным вирусом SARS-CoV-2.

Таким образом, описанное устройство обеспечивает осуществимые, быстрые и точные реологические измерения. Эти характеристики обеспечивают потенциал для исследования и мониторинга состояния заболеваний дыхательных путей, а также для проверки эффектов новых мукоактивных соединений. Скорость и простота измерений позволяют проводить анализы без осложнений, связанных с замораживанием и/или временными последствиями длительного хранения или транспортировки, в то же время делая эти анализы осуществимыми в самых разных условиях. В конечном счете, этот подход может быть изучен для выбора персонализированных методов лечения из панели вариантов, что позволяет адаптировать лечение пациента в режиме реального времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой

Acknowledgments

Эта статья поддерживается грантами Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) и поддерживаемыми CFF исследованиями EHRE20XX0.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary Pistons Tips Gilson CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3 TA Instruments DHR-3 Bulk Rheometer manufactured
by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software GraphPad Prism GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube Costar 3621
Peltier plate TA Instruments Temperature control system manufactured
by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide Sigma 372838 8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette Gilson M1000 Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco Rheonova Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries Rheonova D-1811-007 25mm Diameter
Rough Upper Geometries Rheonova U-1811-007 25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate TA Instruments 20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine Sigma 646547-10X1ML TCEP: Potent reducing agent.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
  2. Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
  3. Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
  4. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
  5. Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
  6. Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
  7. Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
  8. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  9. Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
  10. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  11. Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
  12. Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
  13. Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
  14. Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
  15. Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
  16. Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
  17. Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
  18. Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
  19. Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
  20. Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
  21. Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
  22. Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
  23. Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
  24. Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
  25. Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
  26. Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
  27. Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
  28. Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).

Tags

Медицина Выпуск 182 Дыхательные пути Дыхательные пути Слизь Мокрота Слизисто-обструктивная Астма ХОБЛ Муковисцидоз Реология Реометр Вязкоупругие Биофизические измерения
Быстрая вязкоупругая характеристика слизи дыхательных путей с помощью настольного реометра
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wykoff, J. A., Shaffer, K. M.,More

Wykoff, J. A., Shaffer, K. M., Araba, K. C., Markovetz, M. R., Patarin, J., Robert de Saint Vincent, M., Donaldson, S. H., Ehre, C. Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer. J. Vis. Exp. (182), e63876, doi:10.3791/63876 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter