Évaluation de l’hypersensibilité mécanique induite par une lésion nerveuse chez le rat à l’aide d’un test de douleur opérante orofaciale

La douleur chronique affecte des millions d’Américains chaque année¹. Malheureusement, la douleur chronique est difficile à traiter, car les thérapies existantes sont relativement inefficaces pour atténuer la douleur chronique et ont souvent des effets secondaires indésirables avec une utilisation à long terme ^2,3,4. Les tests précliniques traditionnels de la douleur, tels que le test de von Frey, reposent sur des résultats réflexifs ou des réponses stimulées par la douleur⁵. Bien que le test de von Frey soit utilisé depuis des décennies pour mesurer l’allodynie mécanique, il est sensible à plusieurs facteurs de confusion, notamment le biais de l’expérimentateur⁶. L’utilisation du test de von Frey pour évaluer la douleur orofaciale est également problématique en raison du degré de contention nécessaire pour sécuriser la tête de l’animal afin de tester avec succès la zone faciale, ce qui peut produire des effets de stress indésirables, tels que l’augmentation de la douleur ou, inversement, l’analgésie induite par le stress.

Les comportements stimulés par la douleur sont également susceptibles de résultats faussement positifs⁷ et ne tiennent pas compte de la composante affective de la douleur, qui fait partie intégrante de l’expérience de la douleur humaine⁸. Par conséquent, il y a un intérêt croissant pour l’utilisation de modèles de douleur opérants qui évaluent les comportements dépressifs de la douleur qui englobent à la fois les composantes sensorielles et affectives de la douleur pour améliorer le contenu et la validité prédictive dans les tests précliniques. Le test opérant d’évaluation de la douleur orofaciale décrit ici est basé sur un paradigme récompense-conflit 9,10,11. Dans ce test, le rongeur peut choisir entre recevoir un renforçateur positif et se soumettre à un stimulus nociceptif ou renoncer à la récompense et éviter le stimulus nociceptif, contrôlant ainsi la quantité de douleur qu’il ressent. Contrairement aux tests de douleur traditionnels, le test basé sur l’opérant est indépendant de l’expérimentateur et n’est pas sensible aux résultats faussement positifs en raison d’effets sédatifs indésirables.

Les sensations nocives de la tête et du visage sont transmises par les branches ophtalmiques, maxillaires et mandibulaires du nerf trijumeau. Une lésion ou une inflammation du nerf trijumeau augmente la sensibilité des neurones sensoriels aux stimuli thermiques ou mécaniques^12,13,14,15. Les tests de douleur orofaciale basés sur les opérants fournissent une mesure automatisée de la douleur orofaciale thermique ou mécanique transmise par le nerf trijumeau chez les rongeurs 11,12,16,17,18. La stimulation par des stimuli non nocifs et nocifs est une distinction importante entre le test de l’allodynie thermique et mécanique et de l’hyperalgésie dans la région orofaciale avec l’OPAD, car ils peuvent représenter des manifestations de différents mécanismes sous-jacents.

Dans le test thermique orofacial, les animaux pressent leur visage contre des thermodes lisses pour accéder à la récompense. Les thermodes peuvent être réglés à différentes températures froides, chaudes et chaudes, permettant ainsi l’évaluation du comportement dans des conditions neutres ou nociceptives. Dans l’essai mécanique orofacial, les animaux pressent leur visage contre des barres à pointes pendant les essais opérants; Comme ces pointes causent un certain niveau d’inconfort, les rongeurs peuvent boire moins lorsque leurs visages touchent les pointes par rapport aux surfaces lisses des thermodes. Ainsi, le test mécanique orofacial opérant peut évaluer l’effet de divers degrés de stimulation nociceptive mécanique. Nous avons déjà démontré que l’OPAD est une méthode utile et fiable pour évaluer la température aiguë⁹, ainsi que la mécanique aiguë¹⁹, la nociception et l’hyperalgésie.

Cet article rend compte de l’utilisation d’une nouvelle version de l’OPAD pour évaluer la nociception mécanique et l’hypersensibilité. De plus, à titre de validation, nous démontrons la capacité de l’ICC-ION à induire une neuropathie chronique qui entraîne une réponse prévisible dans l’OPAD. On détaille également comment utiliser l’OPAD et son logiciel associé pour obtenir et analyser rapidement les données comportementales des rongeurs.

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride et étaient conformes aux normes énoncées dans le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Ici, l’évaluation de l’hypersensibilité mécanique à l’aide de l’OPAD est décrite à l’aide d’un modèle de douleur orofaciale neuropathique chez le rat. Un schéma de la chronologie utilisée dans l’étude est présenté à la figure 1. Toutes les évaluations comportementales ont été effectuées par des expérimentatrices.

1. Animaux

1. Hébergez les rats Sprague-Dawley femelles (n = 8/groupe, 150-200 g) par paires dans une pièce à température contrôlée (22 °C ± 1 °C) avec un cycle lumière-obscurité de 12 h:12 h. Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum. Gardez les rats dans l’installation pendant 5 jours pour l’acclimatation avant les expériences.
2. Effectuer les tests de douleur opérants le même jour de la semaine et à la même heure (9 h-11 h).
3. À la fin des expériences, euthanasier les rats par décapitation après anesthésie à l’isoflurane.

2. Mise en place de l’OPAD

1. Placez des bacs d’égouttage à lait, des cages en plexiglas et des grilles de sol en métal sur l’OPAD. Fixez le câblage aux cages. Glissez le porte-bouteille sur le poteau métallique à l’arrière de l’appareil.
2. Préparez un rapport de 2:1 d’eau au lait concentré sucré comme solution de récompense en ouvrant une boîte de lait concentré sucré et en la versant dans un bécher de 1 L. Ajouter ~600 ml d’eau du robinet à 300 ml de lait. Mélangez d’abord la solution à l’aide d’une cuillère, puis utilisez une barre d’agitation et l’agitateur à plaque chauffante. Ensuite, remplissez les flacons de récompense avec la solution de lait et conservez la solution de lait mère à 4 °C.
   REMARQUE: Couvrir la solution de lait bouillon avec une pellicule alimentaire en plastique. Réchauffer la solution de lait avant chaque utilisation. La solution de lait de bouillon dans le réfrigérateur peut coaguler après une semaine. Lorsqu’il coagule, il peut obstruer le tube à lécher. Par conséquent, jetez-le et préparez une nouvelle solution mère.
3. Placez les bouteilles de lait de récompense sur le porte-biberon et ajustez-les de manière à ce que le bec puisse être atteint par l’animal. Serrez le bouton gauche du support pour fixer le flacon en place.
4. Allumez les cages à l’aide de l’interrupteur situé sur le panneau avant.

3. Mise en place d’un protocole et création d’un fichier d’expérience

Remarque : Tout d’abord, configurez le protocole pour exécuter l’expérience. Le protocole décrit comment le logiciel ANY-maze effectue l’expérience.

1. Ouvrez le logiciel. Tapez le mot de passe. Cliquez sur Me connecter ou appuyez sur Entrée.
2. Cliquez sur Nouvelle expérience vide | Menu Protocole .
   1. Sélectionnez le mode que ce protocole utilisera et nommez-le. Sous Appareil, cliquez sur Protocole sans nom, cliquez sur la section Sélectionnez le mode que ce protocole utilisera et, sous Modes spécifiques à l’équipement, sélectionnez Mode de cage mécanique OPAD, puis cliquez sur OK. Ensuite, nommez le protocole (par exemple, OPAD mécanique).
   2. Ajoutez des cages OPAD.
      1. Sous Appareil, cliquez sur Appareil | Ajouter un élément situé en haut du volet Protocole | Nouvelle cage de l’OPAD | Ajoutez toutes les cages OPAD connectées.
         REMARQUE: Avant d’ajouter les cages, assurez-vous que toutes les cages sont allumées.
   3. Ajoutez des étapes de test d’expérience.
      1. Sous Test, cliquez sur Étapes | Première étape et nom Stade (p. ex., jour de référence 1). Tapez 10 min pour la durée de l’essai. Pour ajouter d’autres étapes, cliquez sur Ajouter un élément situé en haut du volet Protocole | Nouvelle étape.
         REMARQUE: Chaque étape fait référence à la séance où un test est effectué. Par exemple, pour 10 jours de formation, 10 étapes sont nécessaires. La durée de l’essai peut être augmentée ou diminuée en fonction de la conception expérimentale.
   4. Assignez des groupes de traitement.
      1. Sous Informations supplémentaires, cliquez sur Groupes de traitement. Cochez Utiliser les groupes de traitement | L’utilisateur affectera manuellement les animaux à leurs groupes.
         NOTE: Le logiciel référencé (voir le tableau des matériaux) permet également d’assigner les animaux de manière aléatoire ou dans un ordre spécifique. Les expériences peuvent être menées à l’aveugle. Pour afficher les groupes de traitement attribués, décochez Exécuter les expériences à l’aveugle.
   5. Attribuez des identifications d’animaux (ID).
      1. Cliquez sur le menu Protocole ; sous Informations supplémentaires, cliquez sur ID de l’animal et cochez Utiliser mes identifiants pour faire référence aux animaux.
3. Cliquez sur le menu Expérimenter .
   1. Tapez un titre d’expérience.
   2. Nommez les traitements en cliquant sur Afficher les traitements, puis tapez les noms des traitements (par exemple, Traitement 1 : CCI-ION, Traitement 2 : simulacre).
   3. Ajoutez des animaux et attribuez des traitements et des identifiants d’animaux en cliquant sur Afficher les animaux | Ajoutez des animaux, entrez le nombre d’animaux qui seront testés, puis cliquez sur OK. Attendez que la liste des animaux apparaisse et ajoutez des identifiants d’animaux et des traitements pour chaque rat.
      REMARQUE : Une liste d’état apparaissant à côté de l’ID de l’animal sera définie sur Normal au début de l’étude. Les animaux peuvent ensuite être retirés du calendrier des tests en changeant leur statut en Retiré ou Supprimé.
4. Enregistrez le protocole en cliquant sur le menu Protocole | Enregistrez le protocole situé en haut du volet Protocole . Tapez Nom de fichier et mot de passe du logiciel (ANY-maze) et cliquez sur Enregistrer.
   REMARQUE : Les protocoles enregistrés peuvent être réutilisés pour de nouvelles expériences.
5. Enregistrez le fichier d’expérience en cliquant sur Fichier | Enregistrez, tapez le mot de passe du logiciel, puis cliquez sur Enregistrer.

4. Séances de formation et d’essais de base

REMARQUE: Amenez les rats dans la pièce au moins 15 minutes avant le test si la salle d’essai comportemental se trouve dans le même centre de logement pour animaux. S’ils sont transportés dans une salle d’essai à l’extérieur de l’animalerie, donnez aux rats 1 h pour s’acclimater à la salle.

1. Avant les enregistrements de référence, entraînez les rats dans les OPAD pendant 2 semaines (5 jours / semaine, 10 minutes / jour) à presser leur visage contre les barres métalliques pour recevoir la solution de lait.
   REMARQUE : Une image représentative de barres dopées et d’un rat effectuant le test est présentée à la figure 2.
2. Configurez l’équipement OPAD.
3. Allumez les cages à l’aide de l’interrupteur situé sur le panneau avant. Recherchez la lumière verte sur la cage, ce qui signifie que la cage est prête à tester.
4. Double-cliquez sur le fichier d’expérience enregistré pour l’ouvrir. Tapez le mot de passe. Cliquez sur Me connecter ou appuyez sur Entrée.
5. Attendez que le menu Tests s’affiche. Sur le côté gauche de l’écran, notez le nombre d’animaux et la cage correspondante (par exemple, l’animal 1 sera testé dans la cage 1), l’étape qui sera exécutée ce jour-là et le statut du test (« prêt »). Sur le côté droit de l’écran, observez le tableau de chaque animal qui montre le nombre de coups de langue et de contacts.
6. Observez l’écran des cages qui affiche l’ID de l’animal à tester. Placez chaque rat dans la cage correspondante et appuyez deux fois sur le bouton de la cage. Notez que le voyant vert se transformera en voyant orange une fois le test commencé, et un son d’avertissement se fera entendre à la fin de la session de test.
7. Pendant les 2 premiers jours d’entraînement, placez complètement les bouteilles de lait dans la cage pour permettre aux rats de boire du lait sans entrer en contact avec le stimulus.
8. Les jours 3 à 8 de l’entraînement, une fois que les animaux commencent à boire, déplacez progressivement les bouteilles vers l’arrière pour encourager les rats à presser leur visage contre les barres à pointes.
9. Les jours 9 et 10 de l’entraînement, une fois que les animaux appuient complètement contre les barres à pointes et que le nombre de léchages est constant (un minimum de 500 coups de langue pendant les séances d’essai de 10 minutes), notez l’emplacement de la bouteille de lait pour chaque animal et utilisez cette distance pour les enregistrements de base.
10. Après 2 semaines de formation, recueillir des données à partir de la distance de la bouteille de lait notée pendant 5 jours comme référence (10 min/jour).

5. Induction de la douleur neuropathique orofaciale et évaluation de l’hypersensibilité mécanique

REMARQUE : À la suite des mesures de base, les rats ont subi une chirurgie CCI-ION, qui impliquait une ligature bilatérale de l’ION, comme décrit précédemment²⁰. Les rats témoins ont subi une chirurgie fictive. Aucune analgésie pré ou postopératoire n’a été utilisée dans la procédure car elle peut modifier l’évolution de la neuropathie. ATTENTION : Les déchets d’isoflurane doivent être récupérés dans des bidons de charbon de bois. Les lames et aiguilles de scalpel doivent être éliminées dans les déchets présentant un risque biologique.

1. Anesthésiez le rat dans la chambre d’induction avec un mélange_d’O2 (1 L/min) et d’isoflurane à 4% et maintenez l’état anesthésique avec un cône nasal spécialisé pendant toute la durée de la chirurgie.
2. Placez le rat anesthésié sur un établi chirurgical et retenez-le. Maintenez la température corporelle à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour les empêcher de se dessécher. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’orteil et commencez la procédure lorsque le réflexe de retrait de l’orteil n’est plus observé.
3. Effectuer l’intervention chirurgicale sous un stéréomicroscope. Ouvrez la bouche à l’aide d’écarteurs et rétractez la lèvre à l’aide d’un petit clip.
4. Faites une petite incision entre la gencive dorsale et la lèvre à l’aide d’une lame de scalpel (#15). Coupez doucement les tissus mous à l’aide de la pointe de la lame du scalpel pour révéler une branche de l’ION.
5. Placez deux ligatures intestinales chromiques (#5-0) autour de l’ION à l’aide d’une aiguille de seringue émoussée et courbée.
6. Fermez la plaie à l’aide d’un adhésif tissu.
7. Pour la chirurgie fictive, exposer l’ION en utilisant la même procédure, mais ne pas ligaturer le nerf.
8. Après la chirurgie, fournissez du chow de rongeur ramolli au lait pendant 2 jours pour encourager l’alimentation et prévenir la déshydratation.
9. Testez les rats dans l’OPAD le lendemain de la chirurgie pendant 3 jours consécutifs, puis 3 jours par semaine (p. ex., tous les mardis, jeudis et vendredis) pendant les semaines suivantes jusqu’à ce que le nombre de coups de langue atteigne ses valeurs de référence.
   REMARQUE: La durée de la sensibilité mécanique induite par CCI-ION peut dépendre du sexe, de la souche du rongeur utilisé et de la performance de l’expérimentateur. Ainsi, il pourrait ne pas être exact d’indiquer une certaine durée pour tester les animaux. Par conséquent, les tests jusqu’à ce que les nombres de léchage atteignent les valeurs de base sont plus précis.

6. Nettoyage de l’appareil

1. Lorsque le test est terminé, quittez le logiciel en cliquant sur l’icône x dans le coin supérieur droit et attendez que les données soient enregistrées automatiquement.
2. Éteignez les cages à l’aide de l’interrupteur situé sur le panneau avant.
3. Débranchez les fils des grilles de plancher métalliques. Retirez et lavez les bacs d’égouttage de lait, les cages en plexiglas, les grilles de sol en métal et les porte-bouteilles avec du savon à vaisselle. Mettez tout sur le séchoir.
4. Essuyez les barres métalliques, le dispositif de test et les paillasses de laboratoire en utilisant de l’alcool isopropylique à 70%.
   REMARQUE: Les instruments doivent être manipulés avec soin. Utilisez des brosses douces pendant le nettoyage des bouteilles de lait et des tubes à lécher. Un équipement sale peut entraîner une accumulation de bactéries.

7. Analyse des données

1. Double-cliquez sur le fichier d’expérience pour l’ouvrir.
2. Cliquez sur le menu Résultats . Sélectionnez les mesures (c.-à-d. lécher, contacter) ou les jours de test à voir.
3. Cliquez sur Texte, graphique ou statistique situé en haut du panneau Résultats pour afficher un rapport de texte, de graphique ou d’analyse statistique.
4. Pour voir les données brutes, cliquez sur le menu Données . Cliquez sur Enregistrer en haut du panneau Données pour enregistrer les données sous forme de feuille de calcul ou cliquez sur Envoyer pour les recevoir par courrier électronique.
5. Pour modifier ou ajouter d’autres variables à afficher, cliquez sur Sélectionner des données, sélectionnez les mesures, puis cliquez sur Afficher la feuille de calcul.
6. Analyse statistique
   1. Dérivez automatiquement le nombre de léchages et de contacts et la latence du premier léchage du logiciel et exportez les données du logiciel vers une feuille de calcul.
   2. Calculer le rapport L/F comme indice d’hypersensibilité en divisant le nombre de coups de langue par le nombre de contacts^21,22,23.
      REMARQUE: Dans cette étude, l’un des rats du groupe simulé a été exclu de l’étude en raison du faible nombre de léchages (<500 léchages) avant la chirurgie.
   3. Analyser la signification statistique des différences entre L/F, le nombre de licks et les contacts, et la latence au premier léchage via des ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles suivies des comparaisons multiples de Dunnett ou des tests de comparaisons multiples de Šídák, le cas échéant.
      REMARQUE : P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Les données ont été présentées sous forme d’erreur moyenne ± type de la moyenne (MEB).

Un exemple de léchage d’un seul rat sur le flacon de récompense et de contacts avec les barres à pointes métalliques au départ et 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines après la chirurgie est présenté à la figure 3. Pendant les périodes non nocives, les rats ont généralement de longues séances de consommation d’alcool (p. ex., au départ et au rétablissement après le CCI-ION : semaine 6 sur l’image) et, après l’ICC-ION, le nombre de léchages diminue car ils ne peuvent pas maintenir le contact facial avec les barres enrichies pendant une longue durée (Figure 3A), sans changements significatifs dans les périodes de consommation d’alcool dans le groupe fictif (Figure 3B).

Les rats atteints de CCI-ION ont eu une diminution significative du nombre de léchages jusqu’à 4 semaines après la chirurgie et une augmentation de la latence jusqu’au premier léchage sur la semaine de chirurgie (semaine 0) et 1 semaine après la chirurgie par rapport à la ligne de base. Il n’y a pas eu de changement significatif dans le groupe simulé (Figure 4A,B). L’ICC-ION a entraîné une diminution du nombre de contacts, mais cette différence n’était pas significative (figure 4C). L’ICC-ION a également entraîné une diminution significative du L/F, et la diminution pour le groupe CCI-ION a été supérieure à la diminution pour le groupe fictif (figure 4D).

Ces résultats indiquent que, suite à CCI-ION, les rats montrent moins de comportement de consommation de lait de récompense, et il leur faut un certain temps pour faire le premier léchage, indiquant un comportement nocifensif. Cependant, CCI-ION n’a pas d’impact sur leur désir d’atteindre le lait. De plus, la diminution du L/F chez les rats atteints d’ICC-ION indique une hypersensibilité mécanique, car le L/F est plus élevé dans des conditions non douloureuses.

Figure 1 : Représentation schématique de la conception de l’étude. Abréviations : OPAD = appareil d’évaluation de la douleur buccale; CCI-ION = lésion chronique par constriction des nerfs infraorbitaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Image représentative de barres dopées et d’un rat effectuant le test. Les barres à pointes sont en métal inoxydable. La longueur de la barre entière est de 7 cm. La hauteur des pointes est de 0,3 cm. La distance entre les pointes est de 0,5 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Tentatives de contact représentatives et données de léchage d’un seul rat opéré par ICC-ION et simulacre pendant la séance de test standard de 10 minutes au départ et 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines après la chirurgie. Abréviations : CCI-ION = lésion chronique par constriction des nerfs infraorbitaires; AS = après la chirurgie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Développement d’une hypersensibilité mécanique après l’ion-CCI chez les rats Sprague-Dawley. (A) Les rats avec CCI-ION (n = 8) ont eu une diminution significative du nombre de léchages jusqu’à 4 semaines après la chirurgie et (B) une augmentation de la latence au premier léchage sur la semaine de chirurgie (semaine 0) et 1 semaine après la chirurgie (**p < 0,01, *p < 0,05: semaines après la chirurgie par rapport à la ligne de base. #p < 0,05 : CCI-ION contre simulacre). Il n’y avait pas de diminution significative dans le groupe simulé (n = 7, p > 0,05). (C) CCI-ION ou chirurgie fictive n’a pas entraîné de changement significatif dans le nombre de contacts. (D) Les rats avec CCI-ION ont montré une diminution significative de L / F la semaine de chirurgie et 3 semaines après et ont montré une tendance à la baisse 2 semaines après la chirurgie. Par rapport aux rats du groupe placebo, cette diminution était significativement plus élevée chez les rats CCI-ION et a commencé 1 semaine après la chirurgie et s’est poursuivie jusqu’à 3 semaines après la chirurgie. Il n’y avait pas de différence significative dans le groupe simulé (**p < 0,01, *p < 0,05 : semaines après chirurgie vs ligne de base. # p < 0,05 : CCI-ION vs simulacre). Dans les graphiques, la ligne rouge représente le groupe CCI-ION et la ligne bleue représente le groupe fictif. Les données sont présentées sous forme de MEB moyen ±. Les différences significatives ont été analysées par ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles, suivie des tests de comparaison multiples de Šídák ou de Dunnett, selon le cas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

John K. Neubert et Robert M. Caudle sont les inventeurs de l’OPAD. Stoelting Co. est le fabricant de l’OPAD, et Richard Mills est un employé de Stoelting. Les frais de publication ont été payés par Stoelting Co. Richard Mills, John K. Neubert et Robert M. Caudle sont les anciens propriétaires de Velocity Laboratories, une société qui fournit des tests comportementaux rémunérés à l’acte à l’aide de tests de douleur opérants.