Summary
获得性甲状旁腺功能减退症（HypoPT）的动物模型对于了解HypoPT如何影响矿物离子稳态和验证新疗法的有效性至关重要。本文提出了一种使用碳纳米颗粒通过甲状旁腺切除术（PTX）生成获得性甲状旁腺功能减退症（AHypoPT）大鼠模型的技术。
Abstract
甲状旁腺功能减退症（HypoPT）是一种涉及甲状旁腺的罕见疾病，其特征是甲状旁腺激素（PTH）的分泌或效力减少，从而导致高血清磷水平和低血清钙水平。HypoPT 最常见的原因是甲状腺或其他颈部前部手术期间腺体意外损伤或切除。近年来，甲状旁腺/甲状腺手术变得越来越普遍，作为术后并发症的HypoPT的发生率相应增加。迫切需要一个HypoPT动物模型来更好地了解HypoPT对矿物离子稳态影响的机制，并验证新疗法的治疗效果。据报道，一种通过使用碳纳米颗粒进行甲状旁腺切除术（PTX）在雄性大鼠中产生获得性HypoPT的技术。与甲状旁腺功能减退症的小鼠模型相比，大鼠模型显示出很大的前景。重要的是，人PTH受体结合区与大鼠的序列相似度为84.2%，高于小鼠共有的73.7%相似度。此外，雌激素的影响可以影响PTH/PTHrP受体信号通路，尚未在雄性大鼠中得到充分研究。碳纳米颗粒是淋巴示踪剂，可将甲状腺淋巴结染成黑色而不影响其功能，但它们不会染色甲状旁腺，这使得它们易于识别和去除。在这项研究中，PTX后血清PTH水平检测不到，这导致了严重的低钙血症和高磷血症。因此，术后HypoPT的临床状态可以在大鼠模型中得到显着表现。因此，碳纳米颗粒辅助PTX可以作为研究HypoPT的发病机制，治疗和预后非常有效且易于实施的模型。
Introduction
甲状旁腺激素（PTH）由甲状旁腺分泌。它是钙平衡的主要调节剂，维持磷酸盐代谢，并参与骨转换1，2。甲状旁腺功能减退症 （HypoPT） 表现为 PTH 分泌减少或功能丧失。它是一种罕见的内分泌疾病，患病率约为 9-37/100，000 人年3，4，5。低PT的特征是血清PTH和钙水平降低，伴血清磷6，7升高。HypoPT根据其原因进行分类：获得性甲状旁腺功能减退症（AHypoPT）或特发性甲状旁腺功能减退症（IHypoPT）8。AHypoPT在临床实践中更常见;大约75%的AHypoPT病例是由甲状腺手术或其他头颈部手术期间甲状旁腺切除或意外损伤引起的。其他原因包括头颈部肿瘤的放化疗和药物毒性1，8。升级的诊断方法和甲状腺相关疾病筛查的增加增加了甲状腺外科手术的数量。这导致相关的甲状旁腺并发症相应增加9，10。
需要易于建立的具有稳定特征的动物模型来更好地研究AHypoPT并验证新疗法的治疗效果。在以前的研究中已经报道了对大鼠和小鼠进行的甲状旁腺切除术（PTX）6，11;然而，由于甲状旁腺的尺寸极小，其解剖分布的可变性，在实践中成功率相对较低。因此，通常进行甲状腺-甲状旁腺切除术（TPTX）（即完全切除甲状腺和甲状旁腺）以确保切除甲状旁腺12。然而，由此产生的低甲状腺素水平可能会使该动物模型的研究复杂化13。通过其他方法（如药物刺激和基因编辑）建立的HypoPT模型不能正确代表最常见的AHypoPT发病机制。我们小组以前使用敲除小鼠模型来标记甲状旁腺，并允许在不损害甲状腺和周围解剖结构的情况下切除甲状旁腺14，15。然而，该方法利用转基因小鼠模型，由于交配和育种要求，需要更长的开发时间。
因此，我们旨在建立一个易于生成的AHypoPT模型。本研究描述了使用碳纳米颗粒标记的PTX大鼠模型。甲状腺手术中常用的50mg/mL碳纳米颗粒悬浮液在局部注射后均匀分布在甲状腺中16。甲状腺变黑，但甲状旁腺未染色17，从而清楚地区分甲状旁腺和甲状腺，并允许在不影响甲状腺的情况下进行PTX。该方法适用于不同年龄的大鼠。碳纳米颗粒悬浮液的注射是安全的，对甲状腺功能的影响可以忽略不计18。本研究产生的碳纳米颗粒标记的PTX大鼠模型在4周观察期内显示出显着的低钙血症和高磷血症表型。因此，该AHypoPT模型易于建立，并且具有可重复的表型。
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Protocol
本研究获得四川大学口腔疾病国家重点实验室机构动物护理与使用委员会的批准。在实验之前获得了当地相关机构的许可。本研究使用了八只8-10周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，平均体重为200-250g。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。 在整个实验 期间随意提供食物和水。
1.产生碳纳米颗粒辅助PTX大鼠的术前准备
- 使用2.0%-2.5%异氟醚吸入麻醉8-10周龄大鼠，然后腹腔内（腹膜）注射10mL / kg体重的三溴乙醇。通过测试瞳孔光反射的缺失来保证足够的麻醉深度。在眼睛上使用兽医软膏以防止麻醉时干燥。
注意：8-10周龄的大鼠被认为是成年大鼠。然而，这种建模方法可用于年仅7天大的老鼠。 - 通过在仰卧位剃除腹颈区域的皮毛来准备麻醉的SD大鼠进行手术。使用聚维酮碘棉球对手术区域进行消毒（见 材料表）。
- 用手术单覆盖动物（见 材料表），并暴露手术区域，旨在最大限度地减少微生物污染。
2. 甲状旁腺切除术
- 从两只耳朵之间的中点开始，用手术刀向尾部纵向切开一个2厘米的切口。用锋利的、弯曲的锯齿状镊子依次解剖筋膜和脂肪层。
- 分离气管旁肌肉，并在体视显微镜下以4x-5x放大倍率使用相对钝的镊子曝光气管。
- 在气管一侧找到蝴蝶形甲状腺的左叶和右叶。
- 使用带有30G斜面针的10μL注射器在甲状腺膜下注射1μL碳纳米颗粒悬浮液（参见 材料表）。5分钟后，用生理盐水冲洗手术区域，以清洁覆盖甲状腺膜的额外碳纳米颗粒悬浮液。
注意：推荐的注射点是甲状腺叶的内侧部分，其血管较少。碳纳米颗粒悬浮液通常用于甲状腺手术，因为它能够检测淋巴结。对甲状腺进行染色，使甲状旁腺不染色，便于识别后者。 - 检查以确保甲状腺变黑，而甲状旁腺在~5分钟内保持未染色。使用体视显微镜或台灯的光在普通光线下观察突出显示的甲状旁腺。
注意：通常，啮齿动物有两个滴形甲状旁腺，位于甲状腺的左右表面。偶尔，额外的甲状旁腺可能位于更远的地方。 - 用显微手术镊子和剪刀精确切割未染色的甲状旁腺。使用无菌棉球止血，如果出血更多，请使用明胶海绵。
- 使用6-0聚乳素910缝合线用断续的水平床垫缝合线逐层关闭肌肉，脂肪层和皮肤（见 材料表）。
- 对于假手术组，执行术前准备和PTX的所有步骤，步骤2.6除外。麻醉大鼠，分离气管上方的组织。找到甲状旁腺，但不要切除它们。与PTX组的大鼠一起进行术后恢复和观察。
3.术后恢复与观察
- 手术后，将大鼠放在恒温电热毯（37°C）上以保持体温。每12小时注射丁丙诺啡盐酸盐0.01mg / kg皮下注射（皮下注射），作为术后镇痛。当大鼠开始移动并尝试爬行时，将大鼠转移到无菌笼中。
- 术后密切观察大鼠2小时。将老鼠送回饲养室，定期观察它们，并记录它们的状态。
- 手术后 10 天从尾静脉抽取 7 μL 血液。使用适当的商业试剂盒测量血清Ca 2+、血清 Pi 和血清 PTH（参见 材料表）。成功的甲状旁腺切除术产生的血清离子化 Ca2+ 2 级 SD 低于假手术大鼠 （9.00 mmol/L， n = 16）。
注：统计分析使用了统计和绘图软件（见 材料表）。学生t检验用于比较假和PTX组之间的血清和尿液参数。 p < 0.05被认为具有统计学意义。根据制造商的说明，用商业试剂盒测量血清和尿Ca2+ 和Pi以及血清尿素和肌酐（见 材料表）。使用市售的ELISA试剂盒测量I型胶原蛋白和骨钙素的血清C-端肽（见 材料表）。
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Representative Results
最初在解剖显微镜下在大鼠中观察到甲状旁腺的位置和数量。在碳纳米颗粒注射之前，甲状腺呈半透明的红色，在显微镜下几乎无法区分甲状旁腺（图1A）。纳米颗粒注射后，甲状腺被染成黑色，而甲状旁腺保持未染色（图1B）。仔细解剖浅色甲状旁腺，使甲状腺未受影响（图1C）。通常，甲状旁腺分布在甲状腺的外侧或后缘。
图1：外科手术过程中甲状腺和甲状旁腺的外观 。 （A）甲状腺（白色虚线）位于气管外侧。（乙，丙）注射碳纳米颗粒后甲状腺呈黑色染色（白色虚线），甲状旁腺（黄色虚线）呈浅色。比例尺 = 2 mm。 请点击此处查看此图的大图。
从术前准备到PTX完成的手术时间约为20分钟。术后大鼠4周存活率为90.9%（60/66）。观察到PTX大鼠在手术后1周驼背。通过执行除步骤2.6以外的协议中的所有步骤，同时建立了假操作的对照组。所有幸存的碳纳米颗粒标记PTX大鼠的平均电离Ca2+ 水平较低，比假手术组低2 SD。碳纳米颗粒标记的PTX大鼠的甲状旁腺功能减退症表型，表现为血清钙降低，血清磷酸盐升高和未检测到的PTH，在4周监测期间保持稳定。
术后7天，与假手术组相比，PTX大鼠血清Ca 2+和PTH水平显著降低（Ca2+= 4.97 mmol/L ± 0.99 mmol/L vs. 8.98 mmol/L ± 0.58 mmol/L，p < 0.05;PTH = 13.13 pg/mL ± 6.58 v pg/mL s. 313.06 pg/mL ± 75.24 pg/mL，p < 0.05）。PTX手术后血清Pi显著升高（Pi = 13.90 mmol/L ± 1.77 mmol/L vs. 7.46 mmol/L ± 1.28 mmol/L）。PTX手术后7天，假尿素组和PTX组的血清尿素和肌酐水平相当（尿素= 8.71毫摩尔/升±0.81毫摩尔/升±0.89毫摩尔/升，p>0.05;肌酐= 49.03微摩尔/升± 13.14微摩尔/升±18.28微摩尔/升，p>0.05）。在PTX手术后14天，尿Ca 2+和Pi水平显着降低（Ca 2+ = 2.33 mmol/L ± 0.53 mmol/L vs. 7.18 mmol/L ±4.27 mmol/L，p < 0.05;Pi = 2.40 毫摩尔/升 ± 1.90 毫摩尔/升 vs. 5.29毫摩尔/升 ± 1.52毫摩尔/升，p < 0.05）（图 2）。
图 2：碳纳米颗粒辅助甲状旁腺切除术后血清 Ca 2+、Pi、PTH、尿素和肌酐水平以及尿Ca 2+ 和 Pi 水平。 （A）PTX大鼠在4周观察期内表现出稳定的低钙血症和高磷血症（N = 4）。（B）术后7天PTX大鼠血清PTH检测不到（N = 8）。（中，四）术后7天假尿素组和PTX组的血清尿素和肌酐水平相当（N = 5）。（中、女）PTX手术后14天，尿Ca2+和Pi水平显著降低（N = 8）。误差线表示标准偏差。缩写：PTX = 甲状旁腺切除术;Ca++ = 血清中的离子钙;PTH=甲状旁腺激素;Pi = 血清中的电离磷。请点击此处查看此图的大图。
PTX组和假手术组在术后第7天（POD7）、POD14和POD28的体重差异无统计学意义（POD0的体重= 256.40克±4.76克±252.56克，p>0.05;POD7的体重= 266.00克 ± 6.93克对257.44克±30.56克，p>0.05;POD14的体重= 294.80克 ± 25.90克与288.22克±37.35克， > 0.05;POD28 的体重 = 327.75 克± 24.82 克对 324.17 克± 57.97 克，p > 0.05）。此外，血清 I 型胶原蛋白 C 端肽 （CTX-1） 在 POD28 上呈统计学意义降低（CTX-1 = 82.03 pg/mL ± 8.98 pg/mL 100.33 pg/mL ± 6.36 pg/mL，p < 0.05）。血清骨钙素在POD28上无显著差异（骨钙素= 913.66 pg/mL ± 378.03 pg/mL vs. 1066.17 pg/mL ± 549.80 pg/mL，p > 0.05）（图3）。
图 3：碳纳米颗粒辅助甲状旁腺切除术后的体重、I 型胶原蛋白的血液 C 端肽和骨钙素水平。 （A）PTX组和假手术组在POD7，POD14和POD28上的体重没有显着差异（N = 14）。（B）PTX大鼠血清I型胶原蛋白C-端肽（N = 4）呈统计学下降。（C）血清骨钙素水平无显著差异（N = 5）。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
流行病学报告表明，甲状腺疾病的检测显着增加，进行的相关手术数量相应增加19，20。术后甲状旁腺功能减退症的发病率约为7.6%8，21，而获得性甲状旁腺功能减退症发病率的增加使这种罕见疾病受到更多的研究关注。因此，建立合适的动物模型来研究疾病的发病机制以及测试新疗法的结果尤为重要。但是，目前可用的动物模型有限。此外，生产此类模型的成功率、存活率和外科手术难度仍然存在问题。我们小组之前在小鼠中报告了两种HypoPT模型。在PTHcre+/Rosa-mTmG小鼠中，对甲状旁腺进行荧光标记，有助于准确解剖甲状旁腺，该方法也有助于发现解剖分布异常的甲状旁腺，提高手术成功率14。另一种建模方法使用转基因小鼠，其中甲状旁腺细胞可能被白喉毒素靶向。然后，甲状旁腺可以通过全身施用白喉毒素来破坏，而无需手术14，15。然而，上述方法需要转基因小鼠的广泛杂交，导致时间和成本要求相对较高。此外，全身性施用白喉毒素可能具有广泛的副作用。目前，甲状腺甲状旁腺切除术（TPTX）是确保切除甲状旁腺的常用手术12。虽然该技术易于执行且成功率高，但对甲状腺的损害不容忽视。甲状腺损伤或破坏对实验结果的潜在影响可能是显着的，这意味着这是该领域所有研究的主要限制21，22。
在目前的研究中，注射了一种碳纳米颗粒悬浮液，通常用于临床实践中可视化甲状腺，以增强PTX手术。该方法安全、快速且高度可行。它可以有效地用黑色染色标记甲状腺，使甲状旁腺保持未染色，从而能够精确识别和解剖甲状旁腺，同时避免对甲状腺造成伤害。这种标记方法与使用转基因小鼠的荧光标记获得的效果相同，但不受基因型的限制。此外，碳纳米颗粒辅助PTX的手术时间约为20 min，与5-ALA荧光鉴定所需的2 h手术相比节省了时间23。此外，由于碳纳米颗粒24的生物安全性，这种建模方法可用于年仅7天大的大鼠。手术过程中需要注意的一个关键步骤是，可以根据大鼠的体重调整碳纳米颗粒悬浮液的剂量。本研究中使用的碳纳米颗粒悬浮液体积（1μL）足以对成年大鼠进行手术，即使注射器中损失了一些量。初学者很难识别所有甲状旁腺的分布，建议进行大量练习。
目前的研究有一些局限性。例如，使用碳纳米颗粒无法识别未附着在甲状腺上的远程甲状旁腺。如果手术后血清参数保持不变，则可能表明存在一些远端甲状旁腺且未切除。未测量甲状旁腺最佳分化和鉴定所需的染色期;然而，甲状腺在纳米颗粒给药后5分钟内正确染色，并在整个手术过程中保留染色。本研究未记录随访期间甲状腺的功能。然而，在我们之前的研究中，涉及利用转基因小鼠模型来识别和去除甲状旁腺，甲状腺功能被证明得以保留15。本研究也没有测试大鼠对碳纳米颗粒的耐受性;然而，这些纳米颗粒已作为临床手术中的药物在商业上使用16。通常，这种方法允许研究人员选择具有所需基因型和操作时间点的动物。最终，这种方法有望为获得性甲状旁腺功能减退症提供有用的大鼠模型。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金基金81800928、四川大学华西学院/口腔医院的研究资助（RCDWJS2021-1）和口腔疾病国家重点实验室开放基金SKLOD-R013的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Solution | Kelun Co. Sichuan, China | ||
| 10 µL 30G NanoFil Syringe | WPI | ||
| 6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
| Calcium LiquiColor test | EKF | 0155-225 | For Ca2+ analysis |
| Carbon Nanoparticles Suspension Injection | Lummy, Chongqing, China | H20073246 | 1 mL : 50 mg |
| Creatinine (Cr) Assay kit ( sarcosine oxidase ) | Jiancheng, Nanjing, China | C011-2-1 | For creatinine analysis |
| Disposable Scalpel | Shinva, China | ||
| Dumstar Biology forceps | Shinva, China | ||
| Micro Dissecting Spring Scissors | Shinva, China | ||
| MicroVue Rat intact PTH ELISA | Immunotopics | 30-2531 | For the measurement of PTH in rat serum |
| Needle Holder | Shinva, China | ||
| Phosphorus Liqui-UV test | EKF | 0830-125 | For Pi analysis |
| Ply gauze | Weian Co. Henan, China | ||
| Povidone-Iodine | Yongan pharmaceutical Co.Ltd. Chengdu, China | ||
| Prism 9.0 (statistics and graphing software) | GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Rat C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit | CUSABIO, Wuhan, China | CSB-E12776r | For CTX-I analysis |
| Rat Osteocalcin/Bone Gla Protein (OT/BGP) ELISA Kit | CUSABIO, Wuhan, China | CSB-E05129r | For osteocalcin analysis |
| Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
| Sprague-Dawley Rats | 8 to 10 weeks old | ||
| Surgical Incise Drapes | Liangyou Co. Sichuan, China | ||
| Urea Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | C013-2-1 | For urea analysis |
References
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