L’examen des leucocytes peroxydases positifs dans le sperme

L’infertilité est devenue un problème de santé publique mondial qui touche environ 15 % des couples en âge de procréer. Les facteurs masculins sont dus à environ 50 % des cas totaux d’hypofertilité, et près de 20 % à 30 % peuvent être attribués uniquement aux facteurs masculins ^1,2,3. Les infections de l’appareil génital masculin constituent l’une des causes importantes d’infertilité masculine, représentant environ 15 % des cas ^4,5.

La plupart des individus ont des leucocytes dans leur sperme, qui constituent 13 % des cellules non spermatozoïdes, avec des proportions différentielles de 12 % pour les neutrophiles, de 0,9 % pour les macrophages et de 0,1 ^{% pour} les lymphocytes6,7. Selon le manuel de laboratoire de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) pour l’examen et le traitement du sperme humain (5e éd.), la leucocytospermie est généralement définie comme la présence de leucocytes >1 ×^{10 6} cellules/mL dans le sperme⁸. Cette condition peut être causée par de nombreux facteurs tels que les toxines environnementales, la toxicomanie, les varicocèles, les MGTI, etc., tous susceptibles d’entraîner une augmentation anormale de la concentration de leucocytes dans le sperme⁹. Les leucocytes peuvent élever les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans le sperme, provoquant une peroxydation lipidique et des dommages oxydatifs aux protéines et à l’ADN, ce qui entraîne une diminution de la motilité des spermatozoïdes, une augmentation des anomalies morphologiques des spermatozoïdes, un indice de fragmentation élevé de l’ADN des spermatozoïdes, une altération de la fonction acrosomique des spermatozoïdes et même des impacts négatifs sur le développement embryonnaire^10,11.

Actuellement, les andrologues choisissent généralement d’examiner les cellules rondes du sperme ou de l’élastase dans le plasma séminal lors de l’identification de l’inflammation des voies génitales. Cependant, il est souvent difficile de distinguer les cellules spermatogènes desquamées et les cellules épithéliales de l’appareil reproducteur, qui ne contribuent pas à réduire l’utilisation aveugle et inutile d’antibiotiques⁶. Cette dernière méthode d’examen est relativement compliquée et prend beaucoup de temps, avec des résultats lents, ce qui n’est pas bénéfique pour le diagnostic précoce et le traitement de maladies telles que les MGTI. L’American Urological Association (AUA) suggère qu’une différenciation plus poussée entre les leucocytes et les cellules desquamées de l’appareil génital devrait être effectuée lorsque la concentration de cellules rondes dans l’analyse du sperme est supérieure à 1 × 10⁶ cellules/mL¹². Certains laboratoires d’andrologie utilisent la cytométrie en flux¹³ ou l’immunocytochimie de l’antigène leucocytaire (par exemple, CD45)¹⁴ pour examiner les leucocytes. Bien que ces méthodes soient précises, elles sont coûteuses et prennent beaucoup de temps, ce qui rend difficile la mise en œuvre clinique à grande échelle, en particulier dans les pays en développement.

La peroxydase est largement distribuée dans divers types de cellules et joue un rôle crucial dans la résistance aux dommages causés par le stress oxydatif. La myéloperoxydase (MPO) est un membre de la sous-famille des peroxydases qui est généralement exprimée dans les cellules immunitaires. Il est le plus fortement exprimé dans les granules azurophiles des neutrophiles^15,16 et est également exprimé dans les lymphocytes^17,18, les monocytes et les macrophages¹⁹. La concentration de leucocytes, en particulier de neutrophiles, dans le sperme peut être obtenue en examinant des cellules rondes qui sont peroxydases positives ^7,20. Pour rendre le processus d’examen des leucocytes dans le sperme économique, pratique et efficace, nous avons repensé la méthode d’examen. À l’aide du système d’analyse de sperme assistée par ordinateur (CASA), la concentration de leucocytes peut être obtenue en 60 minutes. Cette nouvelle méthode permet de réduire les coûts d’examen des patients et le temps d’attente pour l’obtention des résultats, d’alléger la charge de travail des techniciens de laboratoire et de raccourcir la période d’attente du médecin pour le diagnostic et le traitement.

Cette étude a été examinée et approuvée par le Comité d’éthique médicale du troisième hôpital affilié de l’Université Sun Yat-sen.

1. Préparation de la solution de travail

1. Rassemblez les réactifs suivants essentiels à la préparation de la solution de travail : solution de substrat d’ortho-toluidine, solution saturée de chlorure d’ammonium (NH₄Cl), solution de sel disodique d’acide éthylènediaminetétraacétique à 148 mmol/L (Na₂EDTA) et solution de peroxyde d’hydrogène à 6 % (v/v). Placez-les sur une paillasse de laboratoire à température ambiante (RT) avec les outils nécessaires, tels que des pipettes de transfert (1000 μL, 200 μL, 10 μL) et des portoirs de tubes à essai.
   ATTENTION : Lisez la fiche de données de sécurité (FDS) avant de manipuler les réactifs mentionnés ci-dessus.
2. Préparez un flacon de réactif brun opaque pour stocker et protéger la solution de travail préparée de l’exposition à la lumière.
3. Transférez les réactifs dans le flacon de réactif brun opaque selon les proportions spécifiées ci-dessous :
   1. Utilisez la pipette de transfert de 200 μL et ajustez l’échelle à 100 μL en tournant le bouton. Ensuite, transvasez 100 μL de la solution NH₄Cl dans le flacon de réactif brun opaque.
   2. Remplacez l’embout de la pipette et transférez 100 μL de la solution d’EDTA Na₂à 148 mmol/L dans le flacon de réactif brun opaque à l’aide de la pipette de transfert de 200 μL mentionnée ci-dessus. Ensuite, soufflez doucement par pipetage et homogénéisez soigneusement la solution.
   3. Utilisez la pipette de transfert de 1000 μL et ajustez l’échelle à 900 μL en tournant le bouton. Ensuite, transvasez 900 μL de la solution de substrat d’ortho-toluidine dans le flacon de réactif brun opaque, soufflez doucement par pipetage et homogénéisez soigneusement la solution.
   4. Utilisez la pipette de transfert de 10 μL et ajustez l’échelle à 5 μL en tournant le bouton. Ensuite, transvasez 5 μL de la solution de peroxyde d’hydrogène à 6 % (v/v) dans le flacon de réactif brun opaque.
4. Utilisez la pipette de transfert de 1000 μL et ajustez l’échelle à 1000 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, soufflez doucement par pipetage et homogénéisez soigneusement la solution dans le flacon de réactif brun opaque.
5. Conservez la solution de travail prête à l’emploi dans le flacon de réactif brun opaque à RT, à l’abri de la lumière. La solution de travail est réactive pendant 24 h.
6. Chaque échantillon de sperme nécessite 900 μL de la solution de travail. S’assurer que la quantité de solution de travail préparée chaque jour correspond au nombre d’échantillons examinés quotidiennement.

2. Préparation de l’échantillon de sperme

1. Avant de prélever l’échantillon de sperme, assurez-vous que le patient s’est abstenu d’éjaculer pendant 2 à 7 jours, comme l’exige le manuel de laboratoire de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) pour l’examen et le traitement du sperme humain (5e éd.) ⁸. La masturbation est la méthode préférée pour obtenir des échantillons de sperme. Pour améliorer la précision de l’examen, demandez au patient de recueillir tout le sperme éjaculé.
2. Allumez le support à température constante et chauffez jusqu’à 37 °C à l’avance afin que la liquéfaction ultérieure de l’échantillon de sperme puisse se dérouler sans problème.
3. À la réception de l’échantillon de sperme du patient, notez méticuleusement les informations détaillées, y compris le code d’identification, le temps de prélèvement, la durée d’abstinence et d’autres informations pertinentes, sur la paroi extérieure du récipient à base de polymère.
4. Placez le récipient à base de polymère contenant l’échantillon de sperme sur le support à température constante préchauffé à 37 °C, ce qui est bénéfique pour la liquéfaction du sperme.
5. Prélever l’échantillon de sperme dans une pipette à base de polymère et observer l’état de liquéfaction toutes les 5 minutes jusqu’à ce que l’échantillon de sperme soit complètement liquéfié.
6. Si l’échantillon de sperme n’a pas été complètement liquéfié dans les 30 minutes, n’effectuez pas encore l’examen ; Continuez à attendre encore 30 minutes. Si le sperme n’est toujours pas complètement liquéfié après 60 min, ajoutez un volume égal de solution tampon de phosphate pour une dilution de 1 :1 et agitez doucement pour favoriser la liquéfaction.
7. Après une agitation complète et une homogénéisation constante, conservez l’échantillon de sperme entièrement liquéfié pour les procédures d’examen ultérieures.

3. Coloration des leucocytes positifs à la peroxydase et analyse de l’échantillon de sperme d’origine

1. Avant l’échantillonnage, utilisez une pipette à base de polymère pour souffler à plusieurs reprises par pipetage et homogénéiser soigneusement l’échantillon de sperme examiné.
2. Utilisez la pipette de transfert de 200 μL et ajustez l’échelle à 100 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, puis transférez 100 μL de l’échantillon de sperme dans un tube à centrifuger.
3. Utilisez la pipette de transfert de 1000 μL et ajustez l’échelle à 900 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, puis transférez 900 μL de la solution de travail mentionnée ci-dessus dans le tube à centrifuger.
4. Souffler à plusieurs reprises par pipetage et homogénéiser soigneusement le réactif, qui se compose de l’échantillon de sperme et de la solution de travail, à l’aide de la pipette de transfert de 1000 μL.
5. Positionnez le tube à centrifuger dans un rack de tubes à essai sur un agitateur bidimensionnel et soumettez-le à une agitation continue à 200 tr/min pendant 30 min à RT.
6. En attendant la réaction de coloration, analysez l’échantillon de sperme à l’aide du système CASA pour déterminer la concentration de spermatozoïdes dans l’échantillon de sperme d’origine dans le récipient à base de polymère.
   1. Allumez l’interrupteur d’alimentation du système CASA et double-cliquez sur l’icône SCA SCOPE pour ouvrir le logiciel d’application.
   2. Avant le prélèvement, souffler à plusieurs reprises par pipetage et homogénéiser à nouveau soigneusement l’échantillon de sperme d’origine avec une pipette à base de polymère.
   3. Utilisez la pipette de transfert de 10 μL et ajustez l’échelle à 10 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, pipetez jusqu’à 10 μL de l’échantillon de sperme d’origine et placez-le dans la chambre de comptage SCA. Attendez 60 s pour que l’échantillon de sperme cesse de dériver.
   4. Positionnez la chambre de comptage SCA sur le porte-échantillon du système CASA et définissez les informations du patient dans la boîte de dialogue du logiciel d’application pour préparer l’examen formel.
   5. Examinez l’échantillon de sperme d’origine dans la chambre de comptage SCA avec le système CASA en cliquant sur le bouton Démarrer et enregistrez les données nécessaires, telles que la concentration de spermatozoïdes.

4. Observation des leucocytes et des spermatozoïdes peroxydases positifs

1. Utilisez la pipette de transfert de 1000 μL et ajustez l’échelle à 1000 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, puis soufflez à plusieurs reprises par pipetage et homogénéisez soigneusement le réactif, qui se compose d’un échantillon de sperme et d’une solution de travail dans le tube à centrifuger à la fin du processus de réaction de 30 minutes.
2. Utilisez la pipette de transfert de 10 μL et ajustez l’échelle à 10 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, pipetez jusqu’à 10 μL du réactif mentionné ci-dessus et placez-le dans la chambre de comptage des spermatozoïdes. Enfin, couvrez la chambre de comptage des spermatozoïdes avec une lamelle en verre dédiée.
3. Placez la chambre de comptage des spermatozoïdes sur la platine microscopique et allumez l’interrupteur d’alimentation du microscope optique avec deux oculaires 10x. Ensuite, attendez 60 s pour que l’échantillon de réactif cesse de dériver.
4. Basculez le convertisseur microscopique sur l’objectif 10x pendant le temps d’attente. Ajustez ensuite le bouton de réglage grossier et le bouton de réglage fin dans l’ordre. Enfin, observez les spermatozoïdes et les cellules rondes sous un grossissement de 10×10.
5. Basculez le convertisseur microscopique sur la lentille de l’objectif 40x après avoir déterminé le champ de vision à analyser, et observez les spermatozoïdes et les leucocytes bruns positifs à la peroxydase sous un grossissement de 10 × 40.
6. Utilisez le système de comptage électronique pour compter au moins 200 spermatozoïdes et le nombre de leucocytes bruns positifs à la peroxydase dans les champs correspondants.

5. Calcul de la concentration de leucocytes peroxydases positifs

1. Calculez la concentration de leucocytes peroxydases positifs à l’aide de la formule suivante :
   

Lors de la mise en œuvre de la procédure susmentionnée, le réactif dans le tube à centrifuger présente fréquemment un aspect subtranslucide et opalescent (Figure 1). La détection d’une couleur manifestement brune révèle une dégranulation potentielle des leucocytes, ce qui peut entraîner une coloration liquide. Par conséquent, le processus de coloration pourrait échouer, ce qui rendrait nécessaire soit une nouvelle coloration, soit le prélèvement d’un nouvel échantillon de sperme pour un nouveau test21.

Les leucocytes positifs à la peroxydase présentaient une teinte brune, contrastant avec les cellules rondes ordinaires non colorées (Figure 2, lame ordinaire). Par la suite, tous les spermatozoïdes et leucocytes bruns sous le champ de microscope actuel ont été comptés avant de passer à un champ entièrement nouveau pour l’observation et le comptage continus. Pour assurer une précision optimale, il est nécessaire de compter un minimum de 200 spermatozoïdes et les leucocytes présents dans le champ de vision correspondant.

Figure 1 : Solution de réactif. Le réactif qui complète le processus de réaction est un liquide opalescent subtranslucide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Observation au microscope optique (lame ordinaire). (A) leucocyte à peroxydase positive et (B) cellule ronde ordinaire observée au microscope optique à grossissement 10 x 40. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.