Ce protocole décrit la xénogreffe in ovo de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) B et T dérivées de patients, qui se produit 4 jours après l’injection.
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Article de méthode
À Ovo Xénogreffe de cellules de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) dérivées de patients (PDX-LAL)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cette étude présente une méthode rapide, rentable et efficace de xénogreffe in ovo de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) dérivées de patients, englobant à la fois les lignées de cellules B et de cellules T. À l’aide d’embryons de poulet fécondés, nous avons injecté des cellules B-ALL et T-ALL dérivées de patientes dans le système vasculaire des embryons 11 jours après la fécondation (11dpf). Remarquablement, quatre jours après l’injection, les cellules leucémiques humaines greffées ont montré une survie, une prolifération et une colonisation vasculaire significatives dans l’embryon de poulet en développement. À 15dpf, nous avons détecté une augmentation notable des cellules CD10/CD19+ B-ALL et CD4/CD8+ T-ALL dans les échantillons de sang de la vascularisation de l’embryon, confirmant la réussite de la greffe. Ce système facilite l’évaluation efficace et reproductible du comportement des cellules leucémiques dans un organisme vivant sans les coûts considérables et les contraintes éthiques associés à d’autres modèles animaux. Cette approche rapide fournit une plateforme in vivo à haut débit et biologiquement pertinente pour l’évaluation de composés thérapeutiques potentiels. Le système de xénogreffe dérivée du patient (PDX)-ALL présenté ici offre un outil prometteur pour le dépistage préclinique de médicaments, les études mécanistes et potentiellement pour les approches de médecine personnalisée dans la recherche sur la leucémie.
Introduction
La membrane chorioallantoïdienne du poussin (CAM) commence à prendre forme au jour 7 après la fécondation après l’incubation et est complète au jour 12. Le CAM est sous les feux de la rampe en tant que modèle in vivo approprié pour l’angiogenèse1 et la greffe de cellules cancéreuses 2,3,4,5,6,7,8,9,10, en particulier les cellules cancéreuses liées au sang11, car il est intrinsèquement immunodéficient et a une vascularisation bien développée. De plus, le CAM est également un système souhaitable pour étudier l’invasion tumorale et les métastases, car il porte un certain nombre de protéines de la matrice extracellulaire, notamment le collagène, l’intégrine αVβ3, la fibronectine, la laminine et la métalloprotéinase matricielle-2 (MMP-2)10.
La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est un cancer de la moelle osseuse et du sang qui se caractérise par l’augmentation rapide des lymphocytes B et T immatures. C’est le cancer pédiatrique le plus répandu et la principale cause de décès par cancer chez les enfants. La LAL est guérissable chez >85 % des enfants touchés, mais les adultes et les nourrissons ont des taux de guérison considérablement plus faibles, et la LAL en rechute ou réfractaire a une survie à 5 ans de <10 %12. Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies de traitement pour prévenir ou arrêter la LAL récidivante ou réfractaire. Bien qu’un certain nombre de modèles de xénogreffes, tels que ceux de souris et de rat13, aient été développés, ces méthodes prennent du temps (par exemple, des mois) et sont coûteuses, et nécessitent des réglementations éthiques complètes. Pour répondre à un besoin clinique non satisfait d’un nouveau traitement de la LAL, il est impératif de développer un modèle animal reproductible, efficace en termes de temps et de coûts, adapté à l’extension du travail in vitro de base.
Dans cette étude, nous rapportons la mise en place réussie d’un protocole de xénogreffe in ovo qui produit de manière fiable une colonisation vasculaire 3D des cellules B et T de patients atteints de LAL, qui est potentiellement utilisé pour la conception d’une nouvelle thérapie qui pourrait arrêter la progression de la LAL et pour le développement d’un outil prédictif pour les résultats et les risques du traitement de la LAL.
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Protocole
Les expériences ont été réalisées selon le protocole approuvé par le comité d’éthique de l’Université de Calgary (REB15-1143 ; où le consentement éclairé a été obtenu de TOUS les sujets) et le comité d’éthique de la recherche en santé de l’Alberta Cancer Committee (HREBA. CC-17-0108_REN8). Les patients atteints de LAL au moment du diagnostic (avant le début de tout traitement), qui présentaient des blastes circulants (blastes non seulement dans la moelle mais aussi dans le sang), ont été inclus dans l’étude. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Incubation des œufs
- Procurez-vous des œufs de poule fécondés. Obtenez ~10 % d’œufs de plus que nécessaire pour tenir compte du nombre d’œufs endommagés pendant le transport ou la procédure de fissuration.
- Conservez les ovules fécondés jusqu’à deux semaines à 12 °C sans perte de viabilité.
- Transférez les œufs dans un incubateur roulant humidifié (~50 %-60 %) à 39 °C.
- Incuber les œufs dans l’incubateur pendant 10 dpf. Notez que le jour 1 commence lorsque les œufs sont transférés dans l’incubateur.
2. Isolement de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë à partir d’échantillons de sang de patients atteints de LAL
- Isolez les cellules comme décrit précédemment 14,15.
- Prélever 10 ml de sang périphérique (ou moelle osseuse) de patients atteints de LAL B et T dans des tubes à essai héparinisés.
- Transférez les échantillons de sang dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL et diluez trois fois avec 2 volumes de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 et 1,8 mM de KH2PO4.
- Superposer 1 volume d’échantillons de sang dilué sur 1 volume de milieu à gradient de densité et centrifuger à température ambiante sans frein à 300 x g pendant 30 min.
- Prélevez la couche leucalaire des cellules mononucléées (MNC) de l’interface et transférez-la dans un nouveau tube stérile de 15 ml à l’aide d’une pipette stérile.
- Ajouter 10 mL de 1x PBS et centrifuger à 300 x g pendant 5 min pour éliminer tous les composants sériques restants (répéter cette étape deux fois).
- Ajouter 2 mL de 0,8 % NH4Cl à la pastille cellulaire, agiter doucement, incuber à température ambiante pendant 5 min et tourner à 300 x g pendant 5 min pour lyser les globules rouges (si nécessaire, répéter cette étape).
- Lavez les cellules dans 1x PBS comme décrit à l’étape 2.6.
- Remettre en suspension les cellules dans le RPMI 1640 contenant 10 % de FBS et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Évaluez la viabilité cellulaire à l’aide du test d’exclusion du bleu trypan.
- Remettez les cellules en suspension dans le milieu de congélation (10 % de DMSO dans le FBS), congelez-les à -80 °C et stockez-les dans de l’azote liquide.
3. Amplification d’un lentivirus porteur de mCherry incompétent en réplication de 2e génération
- Semez HEK293T cellules rénales embryonnaires humaines à ~60 %-70 % de confluence dans une plaque à 6 puits contenant du DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2.
- Cotransfecter les cellules (1,5 x 106) avec le transfert FUW-Luc-mCherry-puro, l’emballage pCMVΔr8.91 et les vecteurs d’enveloppe pVSV-G dans un rapport de 3:2:1 en utilisant Lipofectamine 3000 pendant 2 jours.
- Récoltez le surnageant contenant des lentivirus et filtrez-le à travers un filtre de 0,45 μm.
- Transvaser le surnageant viral éliminé dans des tubes à centrifuger, centrifuger à 20 000 x g pendant 2 h à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de PBS ou de milieu sans sérum.
- Mesurez la multiplicité de l’infection (MOI) à l’aide du kit qPCR Lentivirus Titer kit.
4. Marquage de lignées cellulaires de LAL en croissance continue et de cellules LAL dérivées de patients avec mCherry
- Plaque1 x 106 cellules/mL de lignées cellulaires B-(SEM) et T-ALL (MOLT3)16,17 et cellules B- ou T-ALL dérivées de patients dans des plaques à 6 puits contenant RPMI 1640 + 10 % FBS.
- Infecter les cellules avec 300 μL de préparation lentivirale avec un titre viral de 3,47 x 106 UI/mL pour obtenir un MOI de 1 pour 1 x 106 cellules, mélanger doucement et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 jours.
- Ajouter 1 μg/mL de puromycine au milieu de culture pour sélectionner des cellules transduites de manière stable pendant 2 jours.
- Visualisez les cellules marquées mCherry à l’aide d’un microscope à fluorescence.
5. Greffe in ovo xeno
- Le 10e jour (voir ci-dessus la section sur l’incubation des œufs), examinez le système vasculaire des embryons de poussin sous la lumière pour évaluer la viabilité de l’embryon. Ensuite, lavez doucement les œufs avec de l’éthanol à 70 % pour stériliser la surface.
- Percez dans la cellule d’air des œufs pour créer une petite fenêtre (~2,0 cm de diamètre) à l’aide d’une perceuse à main.
- Sceller avec du ruban adhésif transparent et retourner dans un incubateur à 5 % de CO2 .
- Le 11e jour, injecter 1 x 10 cellules LAL marquéesà 7 mCherry dans les vaisseaux sanguins des embryons en développement à l’aide d’aiguilles 34 G. Notez qu’il s’est avéré difficile de confirmer si TOUTES les cellules ont été injectées à des endroits identiques sur différents embryons, car l’ouverture de la fenêtre aux mêmes endroits n’est pas garantie.
- Scellez les fenêtres avec du ruban adhésif transparent, retournez dans l’incubateur à 5 % de CO2 et surveillez quotidiennement la viabilité de l’embryon.
- Le 15e jour, disséquez les vaisseaux sanguins des embryons, placez-les sur des lames de verre et photographiez les xénogreffes réussies à l’aide d’un microscope de dissection équipé de capacités de fluorescence.
REMARQUE : Au-delà de 15dpf (car les plumes recouvrent tout le corps et l’albumen a presque disparu), une immunohistochimie doit être effectuée pour évaluer les changements dans la prolifération et la colonisation de TOUTES les cellules dans le système vasculaire de l’embryon de poulet.
6. Cytométrie en flux
- Le 15e jour, prélever du sang dans le système vasculaire de l’embryon de poulet à l’aide d’une seringue stérile avec une aiguille de 32 g, le transférer dans un tube stérile de 1,5 mL contenant de l’héparine et centrifuger à 226 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant (plasma) et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1x PBS contenant 1 % de BSA (albumine sérique bovine).
- Effectuez les étapes 2.7 et 2.8 pour lyser les globules rouges.
- Étiquetez les cellules B-ALL avec des anticorps humains FITC-CD10 et PE-CD19 humains, et les cellules T-ALL avec des anticorps humains FITC-CD4 et PE-CD8, respectivement, à 4 °C dans l’obscurité pendant 30 min.
- Laver deux fois les cellules marquées avec du PBS contenant 1 % de BSA, centrifuger à 226 x g pendant 5 min à 4 °C, remettre en suspension dans 1 x PBS et analyser par cytométrie en flux.
- Réglez les tensions de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) à 400 V et 360 V, respectivement. Ajustez les gains du détecteur pour les voies FITC et PE à 450-500 V et 400-450 V, respectivement.
REMARQUE : Stratégie de déclenchement : (a) déclenchement par diffusion de la lumière (FSC vs. SSC) : utiliser FSC-A vs. SSC-A pour identifier une population avec une diffusion vers l’avant intermédiaire (taille) et une faible diffusion latérale (granularité), qui correspond à la région des lymphoblastes. Notez que cette étape permet d’exclure les débris et les cellules plus granulaires telles que les monocytes ou les granulocytes ; (b) sélection du singulet (FSC-H vs. FSC-A) : effectuer une discrimination doublet en bloquant sur FSC-H vs. FSC-A, garantissant que seuls les événements unicellulaires sont analysés18. - Quantifier les cellules CD10/CD19+ B-ALL et CD4/CD8+ T-ALL en comptant les événements dans le quadrant 2 (Q2 ; FITC/PE+) de FITC vs. Parcelles PE18. Présent signifie ± MEB de trois expériences indépendantes (n = 3).
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Résultats
Pour déterminer si la greffe de cellules LLA humaines dans des embryons de poulet en développement a été couronnée de succès, des lentivirus porteurs de mCherry incapables de réplicationde 2e génération ont été amplifiés et utilisés pour marquer les lignées cellulaires LLA, SEM et MOLT316,17, respectivement. Comme le montre la figure 1A, ~50 % des cellules ALL B- (deux panneaux en haut à gauche) et T- (deux panneaux en hau...
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Discussion
Trois étapes critiques au cours de la xénogreffein ovo ont été identifiées pour prévenir la contamination microbienne et maximiser la survie des embryons de poulet : c’est-à-dire (1) stériliser la surface de la coquille de l’œuf avec de l’éthanol à 70 % avant de fabriquer la fenêtre et (2) sceller hermétiquement la fenêtre de la coquille de l’œuf avec du ruban adhésif pour empêcher l’évaporation du contenu de l’embryon de poulet pendant l’incubation, et (3) l’utilisation de l’a...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Nous remercions le Dr Andrew Kung de l’Université Columbia pour avoir fourni FUW-Luc-mCherry-puro. Ces travaux ont été financés par des subventions des IRSC (PJT-174983) à KYL et de la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF ; RS-2023-00284121) à KYL et M-YJ.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Aiguilles de 34 g | BD Perisafe | ||
| Cytomètre en flux Attune NxT | Thermo Fisher | ||
| Seringue BD Perisafe (32 g) | BD Perisafe | ||
| Albumine sérique bovine (BSA) | Millipore Sigma | N° A9647 | |
| Milieu de congélation cellulaire | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Centrifugeuse (centrifugeuse Allegra X-22R) | Beckman Coulter ; | ||
| Gants jetables | Royal Touch300 Gants d’examen en nitrile | ||
| Microscope de dissection | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Couveuse à œufs, Vevitts 120 Incubateur roulant | Vixest Trading Co. | ||
| Alcool éthylique (95 %) | VWR International | BDH1158-4LP | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| La solution Ficoll (Ficoll ?? Pâque Plus) | MilliporeSigma | Référence : GE17-1440-02 | |
| Anticorps FITC-CD10 | Santa Cruz Biotech | sc-46656 FITC | |
| Anticorps FITC-CD4 | Santa Cruz Biotech | SC-19641 FITC | |
| Microscope à fluorescence | Microsystèmes Leica | ||
| Perceuse à main (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T ; | ATCC, VA, ÉTATS-UNIS | CRL-3216 | |
| Hémocytomètre | VWR international, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine | Millipore Sigma | N° H3149 | |
| Tubes à essai héparinés | BD Vacutainer ; | BD 366480 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Kit de titrage de lentivirus multiplex (kit de titrage de lentivirus qPCR) | Abm | Le LV900 | |
| NH4Cl (chloride_ d’ammonium | Millipore Sigma | N° A9434 | |
| Microscope inversé Olympus IX71 | Olympe | ||
| Anticorps PE-CD19 | Santa Cruz Biotech | sc-19650 PE | |
| Anticorps PE-CD8 | Santa Cruz Biotech | sc-1177 PE | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) ; | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Sigma | Réf. P3813 | |
| Pipettes (volume réglable) | Eppendorf | ||
| Puromycine | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Ruban adhésif écossais | 3M | ||
| Plaques stériles à 6 puits | VWR international, Corning | 22250-140 | |
| Tubes à centrifuger stériles | Axygen Inc., Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| Fioles de culture stériles (75T) | VWR International | 10062-872 | |
| Tubes Falcon stériles (15 ml) | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Tubes Falcon stériles (50 mL) | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| Filtre stérile (0,45 & micro ; filtre m) | VWR International | 76778-974 | |
| Pinces stériles | VWR International | 82027-404 | |
| Lames en verre stérile | VWR international | 48300-031 | |
| Pointes de pipette stériles | VWR International | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Seringues stériles | Seringue BD | 309628? | |
| Bleu trypan | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | Réf. T10282 |
Références
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Réimpressions et autorisations
