À Ovo Xénogreffe de cellules de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) dérivées de patients (PDX-LAL)

La membrane chorioallantoïdienne du poussin (CAM) commence à prendre forme au jour 7 après la fécondation après l’incubation et est complète au jour 12. Le CAM est sous les feux de la rampe en tant que modèle in vivo approprié pour l’angiogenèse¹ et la greffe de cellules cancéreuses ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10}, en particulier les cellules cancéreuses liées au sang¹¹, car il est intrinsèquement immunodéficient et a une vascularisation bien développée. De plus, le CAM est également un système souhaitable pour étudier l’invasion tumorale et les métastases, car il porte un certain nombre de protéines de la matrice extracellulaire, notamment le collagène, l’intégrine αVβ3, la fibronectine, la laminine et la métalloprotéinase matricielle-2 (MMP-2)¹⁰.

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est un cancer de la moelle osseuse et du sang qui se caractérise par l’augmentation rapide des lymphocytes B et T immatures. C’est le cancer pédiatrique le plus répandu et la principale cause de décès par cancer chez les enfants. La LAL est guérissable chez >85 % des enfants touchés, mais les adultes et les nourrissons ont des taux de guérison considérablement plus faibles, et la LAL en rechute ou réfractaire a une survie à 5 ans de <10 %¹². Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies de traitement pour prévenir ou arrêter la LAL récidivante ou réfractaire. Bien qu’un certain nombre de modèles de xénogreffes, tels que ceux de souris et de rat¹³, aient été développés, ces méthodes prennent du temps (par exemple, des mois) et sont coûteuses, et nécessitent des réglementations éthiques complètes. Pour répondre à un besoin clinique non satisfait d’un nouveau traitement de la LAL, il est impératif de développer un modèle animal reproductible, efficace en termes de temps et de coûts, adapté à l’extension du travail in vitro de base.

Dans cette étude, nous rapportons la mise en place réussie d’un protocole de xénogreffe in ovo qui produit de manière fiable une colonisation vasculaire 3D des cellules B et T de patients atteints de LAL, qui est potentiellement utilisé pour la conception d’une nouvelle thérapie qui pourrait arrêter la progression de la LAL et pour le développement d’un outil prédictif pour les résultats et les risques du traitement de la LAL.

Les expériences ont été réalisées selon le protocole approuvé par le comité d’éthique de l’Université de Calgary (REB15-1143 ; où le consentement éclairé a été obtenu de TOUS les sujets) et le comité d’éthique de la recherche en santé de l’Alberta Cancer Committee (HREBA. CC-17-0108_REN8). Les patients atteints de LAL au moment du diagnostic (avant le début de tout traitement), qui présentaient des blastes circulants (blastes non seulement dans la moelle mais aussi dans le sang), ont été inclus dans l’étude. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Incubation des œufs

1. Procurez-vous des œufs de poule fécondés. Obtenez ~10 % d’œufs de plus que nécessaire pour tenir compte du nombre d’œufs endommagés pendant le transport ou la procédure de fissuration.
2. Conservez les ovules fécondés jusqu’à deux semaines à 12 °C sans perte de viabilité.
3. Transférez les œufs dans un incubateur roulant humidifié (~50 %-60 %) à 39 °C.
4. Incuber les œufs dans l’incubateur pendant 10 dpf. Notez que le jour 1 commence lorsque les œufs sont transférés dans l’incubateur.

2. Isolement de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë à partir d’échantillons de sang de patients atteints de LAL

1. Isolez les cellules comme décrit précédemment ^14,15.
2. Prélever 10 ml de sang périphérique (ou moelle osseuse) de patients atteints de LAL B et T dans des tubes à essai héparinisés.
3. Transférez les échantillons de sang dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL et diluez trois fois avec 2 volumes de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 et 1,8 mM de KH₂PO₄.
4. Superposer 1 volume d’échantillons de sang dilué sur 1 volume de milieu à gradient de densité et centrifuger à température ambiante sans frein à 300 x g pendant 30 min.
5. Prélevez la couche leucalaire des cellules mononucléées (MNC) de l’interface et transférez-la dans un nouveau tube stérile de 15 ml à l’aide d’une pipette stérile.
6. Ajouter 10 mL de 1x PBS et centrifuger à 300 x g pendant 5 min pour éliminer tous les composants sériques restants (répéter cette étape deux fois).
7. Ajouter 2 mL de 0,8 % NH₄Cl à la pastille cellulaire, agiter doucement, incuber à température ambiante pendant 5 min et tourner à 300 x g pendant 5 min pour lyser les globules rouges (si nécessaire, répéter cette étape).
8. Lavez les cellules dans 1x PBS comme décrit à l’étape 2.6.
9. Remettre en suspension les cellules dans le RPMI 1640 contenant 10 % de FBS et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
10. Évaluez la viabilité cellulaire à l’aide du test d’exclusion du bleu trypan.
11. Remettez les cellules en suspension dans le milieu de congélation (10 % de DMSO dans le FBS), congelez-les à -80 °C et stockez-les dans de l’azote liquide.

3. Amplification d’un lentivirus porteur de mCherry incompétent en réplication de 2e génération

1. Semez HEK293T cellules rénales embryonnaires humaines à ~60 %-70 % de confluence dans une plaque à 6 puits contenant du DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂.
2. Cotransfecter les cellules (1,5 x 10⁶) avec le transfert FUW-Luc-mCherry-puro, l’emballage pCMVΔr8.91 et les vecteurs d’enveloppe pVSV-G dans un rapport de 3:2:1 en utilisant Lipofectamine 3000 pendant 2 jours.
3. Récoltez le surnageant contenant des lentivirus et filtrez-le à travers un filtre de 0,45 μm.
4. Transvaser le surnageant viral éliminé dans des tubes à centrifuger, centrifuger à 20 000 x g pendant 2 h à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de PBS ou de milieu sans sérum.
5. Mesurez la multiplicité de l’infection (MOI) à l’aide du kit qPCR Lentivirus Titer kit.

4. Marquage de lignées cellulaires de LAL en croissance continue et de cellules LAL dérivées de patients avec mCherry

1. Plaque1 x 10⁶ cellules/mL de lignées cellulaires B-(SEM) et T-ALL (MOLT3)^16,17 et cellules B- ou T-ALL dérivées de patients dans des plaques à 6 puits contenant RPMI 1640 + 10 % FBS.
2. Infecter les cellules avec 300 μL de préparation lentivirale avec un titre viral de 3,47 x 10⁶ UI/mL pour obtenir un MOI de 1 pour 1 x 10⁶ cellules, mélanger doucement et incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 2 jours.
3. Ajouter 1 μg/mL de puromycine au milieu de culture pour sélectionner des cellules transduites de manière stable pendant 2 jours.
4. Visualisez les cellules marquées mCherry à l’aide d’un microscope à fluorescence.

5. Greffe in ovo xeno

1. Le 10e jour (voir ci-dessus la section sur l’incubation des œufs), examinez le système vasculaire des embryons de poussin sous la lumière pour évaluer la viabilité de l’embryon. Ensuite, lavez doucement les œufs avec de l’éthanol à 70 % pour stériliser la surface.
2. Percez dans la cellule d’air des œufs pour créer une petite fenêtre (~2,0 cm de diamètre) à l’aide d’une perceuse à main.
3. Sceller avec du ruban adhésif transparent et retourner dans un incubateur à 5 % de CO₂ .
4. Le 11e jour, injecter 1 x 10 cellules LAL marquées^{à 7} mCherry dans les vaisseaux sanguins des embryons en développement à l’aide d’aiguilles 34 G. Notez qu’il s’est avéré difficile de confirmer si TOUTES les cellules ont été injectées à des endroits identiques sur différents embryons, car l’ouverture de la fenêtre aux mêmes endroits n’est pas garantie.
5. Scellez les fenêtres avec du ruban adhésif transparent, retournez dans l’incubateur à 5 % de CO₂ et surveillez quotidiennement la viabilité de l’embryon.
6. Le 15e jour, disséquez les vaisseaux sanguins des embryons, placez-les sur des lames de verre et photographiez les xénogreffes réussies à l’aide d’un microscope de dissection équipé de capacités de fluorescence.
   REMARQUE : Au-delà de 15dpf (car les plumes recouvrent tout le corps et l’albumen a presque disparu), une immunohistochimie doit être effectuée pour évaluer les changements dans la prolifération et la colonisation de TOUTES les cellules dans le système vasculaire de l’embryon de poulet.

6. Cytométrie en flux

1. Le 15e jour, prélever du sang dans le système vasculaire de l’embryon de poulet à l’aide d’une seringue stérile avec une aiguille de 32 g, le transférer dans un tube stérile de 1,5 mL contenant de l’héparine et centrifuger à 226 x g pendant 10 min à 4 °C.
2. Retirer le surnageant (plasma) et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1x PBS contenant 1 % de BSA (albumine sérique bovine).
3. Effectuez les étapes 2.7 et 2.8 pour lyser les globules rouges.
4. Étiquetez les cellules B-ALL avec des anticorps humains FITC-CD10 et PE-CD19 humains, et les cellules T-ALL avec des anticorps humains FITC-CD4 et PE-CD8, respectivement, à 4 °C dans l’obscurité pendant 30 min.
5. Laver deux fois les cellules marquées avec du PBS contenant 1 % de BSA, centrifuger à 226 x g pendant 5 min à 4 °C, remettre en suspension dans 1 x PBS et analyser par cytométrie en flux.
6. Réglez les tensions de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) à 400 V et 360 V, respectivement. Ajustez les gains du détecteur pour les voies FITC et PE à 450-500 V et 400-450 V, respectivement.
   REMARQUE : Stratégie de déclenchement : (a) déclenchement par diffusion de la lumière (FSC vs. SSC) : utiliser FSC-A vs. SSC-A pour identifier une population avec une diffusion vers l’avant intermédiaire (taille) et une faible diffusion latérale (granularité), qui correspond à la région des lymphoblastes. Notez que cette étape permet d’exclure les débris et les cellules plus granulaires telles que les monocytes ou les granulocytes ; (b) sélection du singulet (FSC-H vs. FSC-A) : effectuer une discrimination doublet en bloquant sur FSC-H vs. FSC-A, garantissant que seuls les événements unicellulaires sont analysés¹⁸.
7. Quantifier les cellules CD10/CD19+ B-ALL et CD4/CD8+ T-ALL en comptant les événements dans le quadrant 2 (Q2 ; FITC/PE+) de FITC vs. Parcelles PE¹⁸. Présent signifie ± MEB de trois expériences indépendantes (n = 3).

Pour déterminer si la greffe de cellules LLA humaines dans des embryons de poulet en développement a été couronnée de succès, des lentivirus porteurs de mCherry incapables de réplicationde 2e génération ont été amplifiés et utilisés pour marquer les lignées cellulaires LLA, SEM et MOLT316,17, respectivement. Comme le montre la figure 1A, ~50 % des cellules ALL B- (deux panneaux en haut à gauche) et T- (deux panneaux en haut à droite) ont été marquées avec mCherry. Par la suite, les cellules LAL B-(#1 et #2) et T-(#3 et #4) dérivées de patients ont également été marquées avec mCherry (Figure 1A, quatre panneaux en bas à gauche et à droite chacun). Des cellules traitées avec de la puromycine pour enrichir les cellules LAL marquées mCherry ont été utilisées pour effectuer une xénogreffe in ovo de cellules LAL humaines, dont la chronologie est schématiquement représentée à la figure 2.

Sur le 15dpf, soit 4 jours après l’injection de cellules LAL marquées au mCherry, les vaisseaux sanguins d’embryons de poulet en développement ont été disséqués, placés sur des lames de verre et photographiés au microscope fluorescent. Comme le montre la figure 3, les images de fluorescence des vaisseaux sanguins d’embryons de poulet en développement indiquent une colonisation vasculaire in situ de SEM et de MOLT3 (deux panneaux de gauche) ainsi que de cellules ALL B-(#1 et #2, deux panneaux du milieu) et T-(#3 et #4, deux panneaux de droite) dérivées de patients. Des images de vaisseaux sanguins d’embryons de poulet en développement sur 11dpf, 6 heures après l’injection, ont été utilisées comme témoins. Ces données indiquent l’établissement et la croissance réussis des cellules LAL au cours du développement du système vasculaire de l’embryon de poulet.

Pour valider la réussite de la greffe de cellules B et T LAL, des échantillons de sang provenant d’embryons de poulet en développement de 15dpf ont été prélevés et des globules rouges ont été retirés. Les cellules ont ensuite été marquées avec des marqueurs spécifiques des lymphocytes B et T humains et soumises à une cytométrie en flux. Des échantillons de sang d’embryons de poulet en développement sur 11dpf, 6 heures après l’injection, ont été utilisés comme témoins. La figure 4 montre une augmentation spectaculaire des lymphocytes T CD10/CD19+ B et CD4/CD8+ humains dans les embryons de poulet en développement injectés avec SEM et MOLT3 (Figure 4A ; 3e et 4e panneaux supérieurs et inférieurs gauches) ainsi que des cellules B (Figure 4A ; #1 et #2, 3e à droite deux panneaux) et T- (Figure 4A ; #3 et #4, 4èmeà droite deux panneaux) cellules LAL, confirmant la xénogreffe in ovo robuste des cellules LAL.

Figure 1 : Marquage mCherry des lignées cellulaires LAL B-(SEM) et T-(MOLT3) et des cellules LAL B-(#1 et #2) et T-(#3 et #4) dérivées de patients. (A) Lignées cellulaires LAL B-(SEM) et T-(MOLT3) ainsi que des cellules LAL B-(#1 et #2) et T-ALL (#3 et #4) dérivées de patients ont été infectées par un lentivirus porteur de mCherry, traités avec de la puromycine pour sélectionner des cellules transduites de manière stable, et visualisés dans des images en fond clair (panneaux de gauche) et fluorescentes (panneaux de droite) à l’aide d’un microscope à fluorescence. Barre d’échelle : 100 μm. (B) Le graphique représente les intensités moyennes de fluorescence (à λem = 590nm) ± MEB (unités arbitraires) indiquées en (A), qui sont quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Schéma de principe pour la xénogreffe d’œufs de poule en développement avec des cellules B- et T-LAL. Le jour 10 (10dpf), une fenêtre a été créée dans la coquille de l’œuf pour les injections de cellules LAL. Le 11e jour (11dpf), des cellules LAL ont été injectées dans le système vasculaire embryonnaire et la prolifération des cellules LAL (11dpf-15dpf) a été surveillée. Le 15e jour (15dpf), des vaisseaux sanguins ont été prélevés sur des embryons, placés sur des lames de verre et photographiés pour confirmer la réussite des xénogreffes à l’aide d’un microscope de dissection doté de capacités de fluorescence. De plus, du sang a été prélevé pour la cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Colonisation vasculaire de lignées cellulaires B-(SEM) et T-ALL (MOLT3) marquées par mCherry et de cellules LLA, B-(#1 et #2) et T-(#3 et #4) dérivées de patients dans des embryons de poulet. Des images de fluorescence à λem = 590nm de vaisseaux sanguins d’ovules en développement ont été prises 6 h après l’injection de 1 × 107 mCherry ALL cellules à 11dpf (témoins) et à 15dpf (4 jours après l’injection). Barre d’échelle : 0,2 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse par cytométrie en flux d’échantillons de sang provenant d’un système vasculaire d’embryon de poulet en développement de 15dpf. (A) Des cellules SEM et MOLT3, ainsi que des cellules ALL B-(#1 et #2) et T-(#3 et #4) dérivées de patients ont été injectées dans le système vasculaire de l’embryon de poulet 11dpf. Des échantillons de sang provenant d’embryons de poulet en développement de 15dpf ont été prélevés et des globules rouges ont été retirés. Les cellules marquées avec CD10/19 pour les cellules B-ALL et CD4/8 pour les cellules T-ALL ont ensuite été soumises à une cytométrie en flux. Des échantillons de sang isolés à partir de 11dpf, 6 h après l’injection, servent de témoins. (B) Les cellules CD10/CD19+ B et CD4/CD8+ T-ALL dans le quadrant Q2 ont été quantifiées. Les données représentent les moyennes ± MEB de trois expériences indépendantes (n = 3), *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Cellules LAL B et T dérivées de patients utilisées dans cette étude.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.