3.10: Extraction par sonication de biomarqueurs lipidiques de sédiments

1. rassemblez le matériel nécessaire

1. Échantillons (feuilles, terre, champignons, écorce, tissus), généralement congelé, lyophilisé, écrasés et homogénéisé avant l’extraction, extraite en groupes afin de maximiser l’efficacité. Extrait de trois échantillons.
2. Selon la taille de l’échantillon, les flacons avec des volumes allant de 4 à 60 mL peuvent être utilisés. Pour cette expérience, les flacons en verre de borosilicate (40 mL) et solvants sécuritaires casquettes sont utilisés. Flacons, pipettes en verre borosilicate et boîtes de pesage doivent être brûlé à 550 ° C pour garantir l’élimination des contaminants organiques possibles avant 6 h.
3. Dichlorométhane et le méthanol sont courantes dans les laboratoires de géochimie organiques plus. Ils sont utilisés individuellement pour rincer les outils de laboratoire et de la verrerie avant utilisation. Un mélange de dichlorométhane (DCM) de méthanol (MeOH ; 9:1) est utilisé dans nombreux laboratoires d’extraire efficacement des biomarqueurs avec un large éventail de polarités. Solvants doivent être exempts de contaminants organiques.
4. Utiliser un bain d’eau de sonication à température ambiante. Une gamme de tailles sonicateur et sonication avec ou sans chaleur sont disponibles auprès de revendeurs de matériel scientifique majeur.
5. Racks de flacon, qui doivent être imperméable à l’eau, seront placés dans le bain de la sonication.
6. Solvant approuvé hotte chimique.

2. préparation de l’échantillon

1. Placez une tible pesant étain sur l’échelle du laboratoire, puis tare.
2. Rincer la spatule de laboratoire avec le solvant, puis utilisez-la pour transférer une masse appropriée de l’échantillon dans l’étain pesage et enregistrer la masse.
   1. La masse de l’échantillon varie en fonction de sa teneur en matière organique. Matière organique relativement maigre matériel (boue marine) peut exiger plusieurs grammes, tandis que la matière organique riche matériel (tissus foliaires) peut-être nécessiter beaucoup moins.
3. Transférer la totalité de la matière dans l’étain pesage dans un consommé, flacon préalablement pesé et étiqueté. Boucher le flacon, puis jetez l’étain de pesage.
4. Effectuez les étapes 2.1 à 2.3 pour chaque échantillon à extraire.

3. extraction

1. À l’aide d’une pipette de pre-tible et ampoule, transférer environ 20 mL du mélange (9:1) DCM:MeOH dans chaque flacon (flacon devrait être environ moitié plein). Reboucher les flacons avant de passer à l’échantillon suivant, afin que les solvants volatils s’évapore pas.
   1. Les volatilités de DCM et MeOH sont différentes. Évaporation du solvant d’extraction en raison de l’échantillon non plafonnés flacons a la capacité de changer sa polarité et donc l’extraction.
2. Placer les flacons d’échantillon dans un support imperméable à l’eau flacon.
3. Vérifiez que le niveau d’eau dans le bain de sonication n’est pas assez profond pour submerger les flacons d’échantillon jusqu’au sommet du solvant d’extraction. Trop d’eau peut causer les flacons à flotter ; trop peu d’eau peut arrêter des échantillons provenant d’être agité correctement.
4. Placez la grille de flacon avec les échantillons à elle directement dans le bain de la sonication.
5. Laisser agir pendant 30 min à température ambiante.
6. Retirez le panier de l’échantillon du sonicateur. Si l’extraction des sédiments, laissez-le durcir durant 30 min permettre la décantation se produise. S’extraire un autre ensemble d’échantillons, mise en sonicateur en ce moment.
7. Retirez le mélange de DCM:MeOH de la fiole d’extraction, à l’aide d’une pipette de pre-tible et l’ampoule, et insérer dans une autre préalablement pesé, pré-tible et étiqueté flacon de 40 mL.
8. Répétez 3 3.1 à 3.7 x pour tous les échantillons.
9. Permettre des échantillons extraits sécher dans leurs flacons, bouchons et dans la hotte, couverts sans serrer avec un morceau de papier d’aluminium. Qualifier de « résidus extraits » et stocker.
10. Les extraits combinés pour chaque échantillon de qualifier de « TLE ».

La première étape de la paléoclimatologie consiste à collecter, ou extraire, les biomarqueurs des sédiments dans lesquels ils se trouvent. Les échantillons environnementaux sont composés de composants non organiques, tels que des minéraux, de l’eau et des métaux, et de composants organiques créés par des organismes vivants dans la région. Avant que ces composants organiques puissent être utilisés par les scientifiques pour élucider des informations sur le passé, ils doivent être retirés de leur environnement. La sonication, qui utilise des ondes ultrasonores, est la plus simple et la moins coûteuse de ces techniques.

Cette vidéo fait partie d’une série sur l’extraction, la purification et l’analyse des lipides à partir des sédiments. Il illustrera l’extraction des lipides par ultrasons et présentera quelques applications de la méthode.

En raison de la large gamme de biomarqueurs, il n’existe pas de solvant unique optimisé pour les extraire tous. Ceci est résumé par la règle dite « semblable dissous semblable », selon laquelle des molécules relativement apolaires se dissolvent dans des solvants apolaires tels que le dichlorométhane, et plus de molécules polaires se dissolvent dans des solvants plus polaires tels que le méthanol. Les mélanges de solvants pour l’extraction de lipides spécifiques ou de groupes de lipides sont généralement optimisés empiriquement.

Pour accélérer l’extraction et augmenter le rendement, un système de sonication est utilisé pour appliquer des ondes ultrasonores avec des fréquences supérieures à 20 kHz, en conjonction avec le mélange de solvants. Lorsque ces ondes entrent en contact avec la phase organique liquide, elles provoquent la formation de microbulles à courte durée de vie de vapeurs de solvant qui se développent et s’effondrent rapidement. Lors de l’effondrement, ces bulles libèrent une énorme quantité d’énergie sous forme de cisaillement mécanique, facilitant la solubilisation des lipides et augmentant considérablement l’efficacité de l’extraction.

Après le processus d’extraction par solvant assisté par ultrasons, le résultat est une préparation d’extrait brut, appelée extrait lipidique total, qui est soumise à une purification supplémentaire pour permettre un examen qualitatif et quantitatif des signatures lipidiques. Maintenant que vous comprenez certains des grands principes de l’extraction des lipides par sonication, jetons un coup d’œil à un protocole sur la façon dont la procédure est effectuée.

Collectez les échantillons nécessaires à l’endroit choisi. Quelques exemples sont les sédiments lacustres et marins, les sols terrestres, les cultures microbiennes ou les feuilles de plantes. Le matériel collecté est congelé pendant la nuit. Ensuite, il est lyophilisé dans un lyophilisateur pendant 2 à 3 jours. Écrasez et homogénéisez les échantillons lyophilisés avant l’extraction à l’aide d’un mortier et d’un pilon rincés au solvant. Pour éliminer les contaminants organiques, brûlez les pipettes en verre borosilicate, les flacons et les boîtes de pesée requis dans un four. Après avoir laissé refroidir la verrerie dans le four, rincez les outils métalliques avec un mélange de dichlorométhane et de méthanol. Une fois l’échantillon et la verrerie préparés, la procédure de sonication peut commencer.

À partir de cette étape, tous les récipients et la verrerie doivent être brûlés avant utilisation. Placez le plateau de pesée sur une balance et tare. Rincez la spatule de laboratoire avec le mélange de solvants, puis utilisez-la pour transférer une masse appropriée d’échantillon lyophilisé et homogénéisé dans le moule de pesée et enregistrez la masse. Transférez soigneusement l’échantillon pesé dans un flacon étiqueté. À l’aide du flacon pulvérisateur de DCM :MeOH, ajoutez suffisamment de liquide pour que l’échantillon soit recouvert de 1 à 2 cm de solvant et bouchez le flacon. Placez le flacon sur un support étanche, maintenant prêt pour la sonication. Placez le support directement dans le bain de sonication. Vérifiez que le niveau d’eau dans le bain de sonication est juste assez profond pour immerger les flacons d’échantillon jusqu’au sommet du solvant d’extraction. Sonicate pendant 30 minutes à température ambiante. Après la sonication, retirez le rack du sonicateur. Laissez les flacons reposer pour permettre à la sédimentation de se déposer.

Retirer la phase supérieure de dichlorométhane-méthanol du flacon d’extraction à l’aide d’une pipette et d’une poire, puis transférer dans un autre flacon pré-pesé et étiqueté. Répétez le processus de sonication trois fois au total pour chaque échantillon. Rassemblez les extraits dans un seul flacon. Laisser sécher les échantillons extraits dans leurs flacons, bouchons enlevés, et dans le capot, recouvert d’un morceau de papier d’aluminium. Étiqueter comme « résidu extrait » et stocker dans le solvant d’extraction. Maintenant que les biomarqueurs ont été extraits, ils doivent être purifiés avant que l’analyse puisse avoir lieu.

La sonication accélère plusieurs processus d’extraction par solvant et est largement utilisée dans les études géochimiques. De nombreux archéologues travaillent avec des géochimistes afin de reconstituer les circonstances environnementales et culturelles dans lesquelles vivaient les premières civilisations humaines. La poterie, l’une des plus anciennes inventions humaines, lorsqu’elle est déterrée, peut contenir des fossiles moléculaires résiduels de vin, de riz ou d’autres contenus qui étaient autrefois stockés à l’intérieur.

Pour mettre au jour des preuves chimiques de substances absorbées sur les surfaces, de petits échantillons de poterie sont soniqués en présence de solvants organiques et les composés extraits peuvent ensuite être identifiés en aval par des méthodes spectroscopiques. Ce type d’analyse aide les archéologues à détecter les types de ressources qui étaient disponibles pour les populations anciennes et à reconstituer les conditions de leur habitat.

Les microalgues photosynthétiques se trouvent dans les écosystèmes marins et d’eau douce. Parce qu’ils poussent dans des milieux à base d’eau de mer et que leur culture occupe des surfaces nettement plus petites, ils sont aujourd’hui largement étudiés comme une alternative prometteuse aux plantes terrestres pour la production de biocarburants.

Pour extraire des lipides d’une biomasse de microalgues, ces chercheurs décrivent une extraction par solvant assistée par sonication. La cavitation acoustique lors de la sonication perturbe efficacement les parois cellulaires rigides des microalgues afin de libérer les lipides. Ces techniques aident à la caractérisation de nouvelles microalgues de l’environnement pour la production de sources d’énergie non pétrolières.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’extraction assistée par sonication de biomarqueurs à partir de sédiments. Les vidéos suivantes expliquent comment l’extrait est purifié pour l’analyse.

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