Prélèvement d'échantillons de sang I

Collecte de sang est une exigence commune pour plusieurs travaux de recherche qui impliquent des souris et des rats. Le choix de la méthode de prélèvement de sang chez ces animaux dépend de nombreux facteurs comme le volume de sang nécessaire, fréquence de l’échantillonnage, l’état de santé de l’animal à être saigné et le niveau de compétence du technicien.

Ici, nous passerons en revue ces considérations et contour procédures de collecte de sang y compris la purge d’oeil rétro-orbitaire, queue cisailles et pseudos, ainsi que de la collecte de sang intracardiaque. Pour les autres méthodes, voir la deuxième vidéo de cette série.

Avant de plonger dans les protocoles de sevrage de sang, revoyons tout d’abord quelques considérations générales, y compris le type d’échantillon, la sélection de l’aiguille et le volume maximal de sang peut être collectées. Avant de prélever le sang d’une souris ou un rat, le type d’échantillon de sang nécessaire doit être déterminé. Il faudra effectuer des procédures expérimentales sang total, sérum ou plasma.

Si collecte de sang total, un anticoagulant doit être ajouté à l’échantillon pour éviter la coagulation. Les anticoagulants courants incluent héparine, citrate de sodium et l’acide éthylènediamine tétraacétique, abrégé en EDTA. Les anticoagulants peuvent être chargés directement dans la seringue pour enduire les surfaces. Cela permet le contact de l’anticoagulant directement lorsque le sang est tiré à l’aidant dans la prévention de la coagulation. Parce que des caillots sanguins rongeurs rapidement, il est essentiel que le bon ratio d’anticoagulant à sang soit utilisée. Collecte de plasma nécessite centrifugation du sang total avec anticoagulant. Après l’essorage, le liquide translucide au-dessus de la couche WBC et plaquettaire est plasma. Il contient le fibrinogène et autres facteurs de coagulation. En revanche, sérum prélevé les anticoagulants de sans échantillon sang entier. Et parce que l’échantillon a coagulé, le sérum, qui est le meilleur joueur, ne contient-elle pas de fibrinogène ou autres facteurs de coagulation.

Sélection de l’aiguille est basée sur la taille de l’animal et le site de la ponction veineuse. En général, les aiguilles de grosse perce moins endommager les cellules sanguines et activent la collecte de sang plus rapide ; mais sont plus susceptibles de causer des lésions vasculaires. On envisagera également la longueur de l’aiguille. Si une aiguille est trop longue, il pourrait être difficile à utiliser, ou sang pourrait commencer à coaguler encore à l’intérieur de l’aiguille. Le choix de la taille varie de 18 à 29 jauge et 0,5 à 1,5 pouces de longueur. La taille de l’aiguille appropriée pour chaque méthode sera discutée dans la section procédures.

Enfin, en raison de la petite taille des rongeurs, il y a une quantité maximale de sang qui peut être prélevé sur un tirage au sort simple de sang, qui ne causera pas de préjudice grave à l’organisme. Prélèvement de sang pourrait être sans ou avec remplacement liquidien – fait généralement à l’aide de sérum physiologique 0,9 %. La limite supérieure dans chaque cas est répertoriée dans le protocole de texte ci-dessous. En outre, certaines expériences nécessitent plusieurs prélèvement et dans ces cas ainsi que remplacement liquidien animal aura besoin de temps entre les deux pour reconstituer les cellules de sang aussi bien. Encore une fois, il existe un montant maximal pouvant être collectées au cours de la série collection, et les limites supérieures sont énumérés dans le protocole ci-dessous.

Après avoir examiné quelques considérations d’ordre générales, nous allons aller dans les techniques de retrait de sang spécifiques, commençant par rétro-orbitaire hémorragie – une technique utilisée par les scientifiques pour recueillir les petits volumes des navires près de le œil. Notez que la structure anatomique de la zone orbitale est différente entre la souris et le rat. Les rats ont un plexus de navires qui coulent derrière le œil, tandis que la souris a une collection de bateaux qui créent un sinus orbital rétro, qui en fait est plus facile d’effectuer cette procédure chez les souris.

Commencez par saisir un tube de prélèvement sanguin. Tubes de micro hématocrite qui détiennent 50-75 microlitres sont préférés. Prévoir plusieurs serviettes en papier ou d’autres matériaux isolants sur la surface de travail. Il s’agit de maintenir la chaleur du corps de l’animal au cours de la procédure. Maintenant anesthésier l’animal à l’aide d’une anesthésique comme l’isoflurane inhalation. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, retirez-la de la chambre et placez-le vers le bas sur le côté qui est en position de décubitus latéral. Ensuite, placer un doigt sur le dessus de la tête et le long de la ligne de la mâchoire et tirer la peau vers l’arrière et vers le bas pour induire la protrusion oculaire. Évitez d’appliquer la pression la trachée car qui peut causer la mort par asphyxie. Par la suite, placer le tube de micro-hématocrite dans le canthus médial de le œil et de l’orienter direction caudale à un angle de 30 à 45 degrés de l’avion du nez. Appliquer une pression tout en tournant doucement le tube. Cela coupera à travers les membranes conjonctivales et rompent le plexus oculaire ou des sinus. Le sang s’écoule dans le tube de l’hématocrite par capillarité. Éviter de pousser le tube si profond que vous frappez l’os à l’arrière de la cavité oculaire. Une fois que le sang commence à couler, maintenir la pression pour garder l’oeil dépassait. Pour arrêter l’hémorragie, relâcher la peau et laisser l’oeil revenir à la position normale. Faire pression pour favoriser l’hémostase. Pour le prélèvement d’échantillons répétés, prévoyez un minimum de 10 jours entre les saignements. Ceci fournit des tissus quelque temps à guérir.

Bien que l’hémorragie rétro-orbitaire est une procédure courante, il y a des nombreuses préoccupations concernant sa cruauté. Il s’agit d’un gonflement dû à un mouvement excessif du tube hématocrite. Cela peut à son tour provoquer la saillie du globe oculaire et empêcher la fermeture de la paupière résultant dans la cornée séchage, dommages et douleur, qui peut déclencher les rayures et l’automutilation. Une mauvaise mise en place du tube hématocrite peut rompre le nerf optique entraînant la cécité. Une autre complication possible est que le œil peut être forcé hors de l’orbite, ce qui permet des paupières tomber derrière le globe oculaire. En outre, des questions peuvent se poser de la fracturation des os fragiles orbite, pénétration du globe oculaire entraînant la perte du corps vitré, ou la formation d’un hématome derrière le œil qui peut se traduire par des douleurs extrêmes. Malgré tous ces soucis, si un technicien effectue la procédure et que l’animal est complètement anesthésié, hémorragie rétro-orbitaire est une méthode efficace de collecte de sang chez les rongeurs.

Maintenant passons en revue les considérations et les modalités de la queue des saignements, qui permet la collecte d’une série des échantillons de petits volumes. L’équipement nécessaire pour cette procédure inclut un scalpel stérile numéro 11. Ciseaux ne doit pas être utilisé parce que la coupe faite par ciseaux est écrasant, qui peut favoriser la coagulation et réduire la circulation sanguine. Autres instruments sont un tube de retenue qui permet d’accéder à la queue de l’animal ; serviettes en papier absorbant ; tubes de collecte ou de l’hématocrite et poudre styptique – pour aider à l’hémostase.

Commencez par fixer l’animal dans le tube de retenue. Ensuite, essuyez la queue à l’eau tiède pour enlever les débris et provoque une légère vasodilatation. N’utilisez pas d’eau chaude. Étendre la queue et avec la lame de bistouri, couper le bout de la queue pour recueillir le sang à l’aide de tubes hématocrite ou collection. La queue peut être rayée ou « traites » de rumsteck à la pointe pour favoriser la circulation sanguine. Cependant, Ceci diminuera la qualité de l’échantillon.

Pour arrêter l’hémorragie, appuyer sur l’extrémité de la queue avec un tampon de gaze. La poudre styptique peut servir à atteindre l’hémostase. Vérifier les animaux chaque 5 à 10 minutes afin d’assurer l’hémostase est parvenu, qui pourrait être retardée après échantillonnage répété. L’échantillon prélevé dans un snip queue peut contenir de sang artériel et veineux, ainsi que de la contamination des tissus produits. Toutefois, cette procédure pour le prélèvement sanguin permet pour les collections de la série en perturbant la tavelure ou caillot de la coupe originale à l’extrémité de la queue.

Une méthode de collecte de sang alternative à un snip de queue est le Pseudo de navire de queue, qui est relativement moins invasif. Pour ce faire, en utilisant la même lame de bistouri Swann-Morton, faire une petite coupe directement sur la veine latérale arrière, environ deux-tiers la distance de la croupe. Comme avec des cisailles de queue, sang peut être collecté dans la collection ou des tubes de l’hématocrite. Et il est impératif d’assurer l’hémostase en appliquant une pression sur le site et revérifier l’animal toutes les 5-10 minutes. Cependant, comme avec le snip de queue, les échantillons pourraient être contaminés par des produits tissues.

Souvent les études nécessitant un échantillon de sang grand sans survie, qui est accompli à travers exsanguination via une purge intracardiaque ou la veine cave caudale.

Pour la méthode intracardiaque chez la souris, vous devez une seringue cc 3 avec une aiguille de 1 pouce de calibre de 22 -25. Et pour les rats, un 10-12 cc seringue avec une aiguille de 18 calibre 1,5 pouces est préféré. Voir le protocole ci-dessous pour comprendre le pourquoi ces besoins et les seringues sont idéales.

Commencez par euthanasier l’animal à l’aide de dioxyde de carbone. Suite à l’euthanasie, tenez le rongeur par la peau du cou avec le corps suspendu verticalement. Cette retenue est critique car le corps doit être tout droit pour éviter la déviation du cœur ou une torsion de la poitrine. Notez que le cœur est situé approximativement au niveau du coude. Le côté d’insertion est dans l’encoche située juste à gauche de la xiphoïde, parallèle à la colonne vertébrale et sous les côtes.

Insérer l’aiguille, biseau vers le haut, dans la poitrine et percer le cœur. Appliquer une légère contre-pression avec la seringue. Si l’aiguille est dans le cœur, le sang coulera dans la seringue. Attendez que le sang a rempli le canon avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire. Environ la moitié du volume sanguin total peut être prélevée une souris ou un rat par ponction cardiaque. Cela équivaut à environ 1 mL de sang de souris moyenne d’environ 10 mL de sang chez un rat moyen

Une autre position est le décubitus dorsal lorsque vous utilisez l’approche latérale. Dans ce cas, placez l’aiguille entre les côtes du côté gauche de l’animal. Le point d’entrée est mesuré sur la pointe du coude sur la paroi thoracique. Insérer l’aiguille, biseau vers le haut, perpendiculaire au plan de la table à un point situé à mi-chemin sur la paroi thoracique. Appliquez une légère pression arrière avec la seringue. Si l’aiguille se trouve dans le sang du cœur s’écoule dans la seringue. Encore une fois, attendez jusqu’à ce que le sang a rempli le canon avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire. Notez que dans les deux positions, contre-pression excessive risque de s’effondrer au cœur obstruant le biseau de l’aiguille et l’arrêt de la circulation sanguine dans la seringue.

Une autre méthode pour recueillir le sang cardiaque est par l’intermédiaire de la veine cave caudale. Le matériel nécessaire pour cette procédure sont une seringue appropriée avec une aiguille de taille correcte, attachée ; ciseaux pour l’ouverture de la cavité abdominale, atraumatique petit pouce éponge de forceps et de gaze. Cette technique nécessite que l’animal être profondément anesthésié et maintenu sous anesthésie tout au long de la procédure. Narcose de CO2 n’est pas une option, car le cœur animal doit se battre pour cette procédure. Mettre l’animal en position de décubitus dorsal et fixer les branches à la plate-forme. Les membres devraient être étendues loin du corps.

Maintenant, soulevez la peau avec une pince et utiliser des ciseaux pour faire une petite coupe transversale à travers la peau juste au-dessus du bassin dans le prépuce chez les mâles ou de femelles. Ensuite, placez le point des ciseaux dans la coupe et faire une incision médiane à travers la peau dans le bassin ou le prépuce à la xiphoïde. Avec la peau reflétée latéralement, soulevez le muscle et faire une petite coupe transversale à travers le muscle, juste au-dessus de la coupe de la peau.

Placez la pointe des ciseaux dans l’abdomen et faire une incision médiane à travers le muscle à la xiphoïde. N’oubliez pas du point de ciseaux vers le haut pour éviter un quelconque des organes de coupe d’angle. Couper transversalement le long de la courbe des côtes de chaque côté. Veillez à ne pas perforer le foie. Déplacez doucement les intestins à gauche de l’animal afin d’exposer la veine cave postérieure. Placez une compresse sur le foie et reposer votre index et le majeur à ce sujet. Avec votre autre main, introduire l’aiguille, biseau vers le haut dans la veine cave, à mi-chemin entre la jonction des vaisseaux rénaux et de la bifurcation iliaque. Retirer lentement le sang tout en exerçant une pression sur le foie.

Eviter les mouvement de la main, car qui pourrait causer la rupture du navire. Aussi, prélèvement de sang trop rapide peut provoquer le navire de s’effondrer sur le biseau obstruant la collecte de sang ouverture et prévention. Le principal avantage de cette technique est la capacité de recueillir un échantillon stérile parce que l’aiguille ne traverse pas la peau.

Enfin, nous allons étudier certaines applications de ces techniques de retrait de sang. Immuno-oncologie est un domaine émergent, et chercheurs dans ce domaine souvent effectuent des prélèvements sanguins pour étudier les cellules immunitaires à différents stades de développement du cancer. Par exemple, ici le chercheurs ont recueilli sang cardiaque de souris cancer à isoler et à quantifier les neutrophiles à dix, vingt et trente jours après la prise de greffe tumorale.

En revanche, composition sanguine est également fréquemment étudiée par les physiologistes. Comme dans cette étude, chercheurs se sont intéressés à évaluer la fonction rénale chez les animaux diabétiques. Pour ce faire, ces scientifiques a tout d’abord injecté un colorant dans un modèle animal du diabète. Ensuite, ils ont ensuite utilisé queue snip méthode pour recueillir le sang à plusieurs points de temps pour évaluer la concentration de colorant dans le sang, qui a été finalement utilisée pour calculer le taux de filtration glomérulaire qui a mis en évidence la différence de la fonction rénale après diabète induction.

Enfin, les chercheurs de cellules souches utilisent des échantillons de sang pour évaluer la réussite de l’incorporation de cellules du donneur dans le système du destinataire. Ici, les enquêteurs ont transplanté tout d’abord des cellules de moelle osseuse de souris mâles dans un type sauvage et animal femelle génétiquement modifié via l’injection dans la veine queue. Ensuite, ils ont recueilli le sang le sinus rétro orbital de la souris destinataire afin d’étudier l’ADN génomique des cellules sanguines à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase. Cela a fourni le pourcentage de la prise de la greffe de cellules du donneur dans les deux types d’animaux.

Vous avez regardé juste première tranche de JoVE sur les techniques de retrait de sang. S’il vous plaît voir la vidéo suivante dans la série d’examiner comment effectuer autres techniques couramment utilisés de collecte de sang chez les animaux de laboratoire. Comme toujours, Merci pour regarder !