In vivo Bioluminescent imagerie des tumeurs mammaires qui utilisent des fréquences IVIS

Pour commencer cette procédure, la lignée cellulaire de tumeur mammaire exprimant la luciférase est décongelée à partir de tiges congelées, puis développée en culture jusqu’à 90 % de fluidité du CDF. La dilution en série des cellules en suspension est ensuite ensemencée en 96. Des plaques de puits exposées à la luciférienne, puis le nombre optimal de cellules générant des émissions fluorescentes supérieures à 500 photons sont déterminées à l’aide d’une plaque Les cellules du lecteur sont ensuite injectées, par voie sous-cutanée, dans le flanc d’un animal, puis la luciférase est injectée.

Les cellules intrapéritonéales peuvent être imagées dès 10 minutes après l’administration de Lucifer, et la masse tumorale peut être visualisée jusqu’à un mois in vivo jusqu’au début de la nécrose. Bonjour, je m’appelle Ed Lim et je travaille au laboratoire d’imagerie de Caliper Life Sciences à Alameda, en Californie. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de surveillance non invasive de la croissance tumorale chez la souris à l’aide de la bioluminescence.

Cette procédure est utilisée dans notre laboratoire et dans le laboratoire ivus, dans le monde entier, pour étudier la croissance et le développement des tumeurs, en particulier après un traitement avec des composés médicamenteux. Alors commençons. Cette procédure commence par la préparation de la lignée cellulaire tumorale pour l’injection dans la souris.

Une large gamme de lignées cellulaires cancéreuses exprimant la luciférase peut être utilisée pour des expériences précliniques bioluminescentes. Ces cellules sont fournies sous forme de culture congelée exempte d’agents pathogènes, qui se développera facilement dans des milieux standard sans avoir besoin de marqueurs de sélection. Pour notre expérience, nous utiliserons la lignée cellulaire de tumeur mammaire murine 41 Luke two, qui exprime le gène de la luciférase qui sert d’indicateur optique de l’expression génique ou de la tumorgenèse

In vivo, nous utiliserons l’expression de la luciférase pour suivre la croissance de la tumeur primaire de manière non invasive, mais elle peut également être utilisée pour localiser et surveiller les lésions métastatiques. L’activité de la luciférase doit être vérifiée avant l’injection, et pour ce faire, un flacon confluent à 90 % est récolté par la trypsine puis compté. 50 000 cellules sont ensuite distribuées dans un seul puits d’une plaque de microtitration et une dilution en série est effectuée.

Lucifer est ajouté dans les puits à raison de 150 microgrammes par millilitre et incubé pendant deux minutes. La microplaque peut être imagée dans ivus ou dans un lecteur de plaque luminescente pour déterminer les niveaux d’expression. Cette lignée cellulaire exprime jusqu’à 6 500 photons par seconde et par cellule, mais tout niveau d’expression supérieur à 30 photons par seconde et par cellule peut être imagé avec succès in vivo.

Maintenant que nous avons des cellules d’activité optimale, nous pouvons passer à l’étape d’injection sous-cutanée. Afin de faciliter une détection optimale de la tumeur, nous utilisons une souche de souris nude immunodéprimée thymique. Avant l’injection, les animaux sont anesthésiés à l’aide de fluor ISO à 3 % pendant cinq minutes pour une anesthésie profonde.

Ensuite, nous injecterons 250 000 cellules dans une centaine de microlitres de PBS par voie sous-cutanée dans le flanc. Chargez les cellules dans une seringue d’un millilitre et fixez-y une aiguille de calibre 26. Soulevez doucement la peau à l’aide d’une pince pour faire une tente et injectez les cellules à la base.

Les cellules nouvellement injectées peuvent être imagées immédiatement. Un total de 150 milligrammes de Lucifer par kilogramme de poids corporel est ensuite administré via deux injections dans la cavité péritonéale. Dans cette étude, les animaux sont imagés 10 minutes après l’injection luciférienne pour assurer un flux de photons constant.

Nous vous le montrerons à l’étape suivante. Pour notre expérience, nous utiliserons le système d’imagerie in vivo du spectre IVUS, qui utilise un dispositif couplé à la charge amincie refroidi à moins 90 degrés Celsius pour obtenir une sensibilité maximale. Pour prendre en charge la quantification absolue, le système mesure la charge d’obscurité pendant les temps d’arrêt et exécute un auto-étalonnage lors de l’initialisation.

Pour commencer l’imagerie, initialisez le système IVUS et définissez les paramètres d’imagerie de l’expérience. Sélectionnez le champ de vision. Pour le nombre d’animaux imagés, jusqu’à cinq animaux peuvent être maintenus dans l’instrument à l’aide du collecteur d’anesthésique intégré.

La scène est à une température constante de 37 degrés Celsius pour maintenir la température corporelle des animaux. Un port ECG est fourni pour surveiller la santé des animaux pendant les procédures stressantes dans les logiciels d’images vivantes, l’exposition, le temps, le F-stop et la liaison pix peuvent être optimisés en fonction du niveau d’expression de la lignée cellulaire. Ces paramètres peuvent être modifiés à tout moment au cours d’une expérience sans affecter le résultat quantitatif.

Ivus acquiert une image photographique de l’animal sous une lumière blanche dans un signal bioluminescent ou fluorescent quantitatif, qui est superposé à l’image, le signal bioluminescent est exprimé en photons par seconde et affiché sous forme de carte d’intensité. L’affichage de l’image est ajusté pour fournir un contraste et une résolution optimaux dans l’image sans affecter la quantification. La luminescence des cellules peut être mesurée au site d’injection à l’aide d’une région d’intérêt. Outil.

Les données de mesure sont affichées dans le tableau avec tous les paramètres expérimentaux relatifs à la capture d’image, qui peuvent être enregistrés ou exportés. Pour l’analyse, plusieurs images peuvent être acquises et comparées et des études longitudinales couvrant quelques secondes ou quelques mois selon la nature de l’expérience. Nous mesurerons le flux de photons de la tumeur au temps zéro et le surveillerons pendant quatre semaines.

Avec l’imagerie à intervalles bihebdomadaires, le flux de photons de la tumeur est proportionnel au nombre de cellules vivantes exprimant la luciférase. Ainsi, la bioluminescence est directement corrélée à la taille de la tumeur cinq jours après l’implantation. La tumeur n’est pas encore palpable, mais les cellules peuvent être quantifiées par bioluminescence et la tumeur est observée comme étant en croissance active.

À ce stade, le signal de bioluminescence est beaucoup plus fort. Le temps d’exposition, le diaphragme et la rotation des pixels peuvent être ajustés pour que l’image soit claire et que l’appareil photo ne sature pas. IVUS compense automatiquement les changements de collecte de la lumière.

Ces mesures ont donc pu être comparées à celles collectées plus tôt et plus tard. Dans l’expérience. À 15 jours post-implantation, les tumeurs sont palpables et la mesure de la bioluminescence a déjà généré 15 jours de données.

À 28 jours, les tumeurs post-implantatoires se nécrosent et les cellules commencent à mourir. La taille de la tumeur estimée par la mesure de l’étrier ne change pas de manière appréciable, mais la luminescence de la tumeur diminuera. Indiquant que la mesure du calibre de la mort cellulaire et de la bioluminescence peut être poursuivie jusqu’à ce qu’un critère d’évaluation sans cruauté soit atteint.

La nécrose tumorale due à l’hypoxie ou aux schémas thérapeutiques sera indiquée par une bioluminescence réduite même s’ils ne réduisent pas la masse tumorale. Nous venons de vous montrer comment surveiller le développement d’une tumeur sous-cutanée, un modèle simple de souris xénogreffe utilisant l’imagerie bioluminescente. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de vérifier le niveau d’expression de vos cellules avant l’implantation.

Deuxièmement, pour une reproductibilité maximale, imagez les animaux au moment optimal après l’injection luciférienne. La sensibilité de la méthode permet de surveiller le développement de la tumeur à un stade précoce, car les tumeurs peuvent être mesurées par bioluminescence bien avant de pouvoir être mesurées de manière fiable par des pieds à coulisse. N’oubliez pas d’optimiser vos paramètres d’imagerie à chaque étape : ce signal de luminescence ne sature pas, mais par luminescence, les animaux peuvent être suivis quantitativement pendant des mois pour étudier les effets de rémission et de rechute.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.