Culture primaire des adultes myocytes cœur de rat

Dans ce papier, nous avons décrit d'une manière typique à isoler et cultiver les myocytes cardiaques de rat adulte. Collagénase et la protéase sont utilisés pour digérer et d'isoler les myocytes unique. Myocytes cultivés suivre ce protocole répondent aux exigences les plus expérimenter.

La procédure commence par l’excision du cœur d’un rat adulte et son accrochage au système de perfusion. Les solutions enzymatiques sont laissées perfuser pendant environ 30 minutes, après quoi le cœur est retiré. La digestion hachée et enzymatique a pu se poursuivre dans un petit bécher.

À la fin de la digestion, les cellules sont dissociées en une suspension unicellulaire par agitation mécanique et filtrées dans un tube stérile. Les cellules cardiaques primaires sont lavées trois fois dans des tampons à concentration croissante de calcium, remises en suspension dans des cultures en milieu et plaquées sur des boîtes de culture de tissus recouvertes de stratifié. Bonjour, je m’appelle Shahi et je travaille dans le laboratoire d’Henry Cowa au Département de physiologie et de physique cellulaire de l’Université Columbia.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour isoler et cultiver d’autres cellules cardiaques de rat. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les canaux calciques dans le cœur. Alors commençons.

La veille de l’opération du rat, assurez-vous que toutes les solutions sont préparées, mais n’ajoutez pas encore d’enzymes. Les tampons A, B et le tampon de lavage doivent tous être filtrés pour s’assurer qu’ils sont stérilés avant d’être stockés à quatre degrés Celsius. Six plaques de culture tissulaire doivent également être recouvertes d’une solution stratifiée la veille et stockées à 37 degrés Celsius dans un incubateur à CO2.

Le jour de l’opération. Préparez les instruments chirurgicaux en désinfectant la pince, les ciseaux et les pinces avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher sur une serviette en papier. Une seringue d’un millilitre remplie d’un demi-millilitre de solution d’héparine est prête.

Maintenant, il est bon de laver l’appareil de perfusion fonctionnant à 70 % d’éthanol avec la pompe péristaltique à l’envers. Une fois terminé, rinçage à l’éthanol, rincez l’appareil avec de l’eau distillée deux fois et enfin rincez avec le tampon A. Le flux est recueilli dans un bécher et placé dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Pour préparer l’appareil de profusion nettoyé, remplissez le tube de la seringue droit avec 40 millilitres de tampon A et le tube de la seringue gauche avec 40 millilitres de tampon B. Amorcez le tube de perfusion jusqu’à l’extrémité du cathéter en permettant au tampon A de s’écouler à travers l’appareil.

Remplissez le tampon à l’aide d’une seringue jusqu’à ce qu’il pleuve jusqu’à ce qu’il pleuve 40 millilitres. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air piégées dans le tube après cette étape, fermez maintenant le tampon, une seringue avec la valve du robinet d’arrêt et répétez le processus de sorte que le tube de profusion soit maintenant amorcé avec le tampon B. L’appareil de profusion est enfin prêt et reste avec le tampon. B Le robinet d’arrêt est ouvert, mais le débit est arrêté.

À l’aide du régulateur sur la ligne IV, jetez le flux tampon dans le bécher collecteur. La dernière chose à faire avant l’opération est d’ajouter les enzymes nécessaires à votre solution mère, puis de filtrer la solution enzymatique comme les autres solutions ont été filtrées la veille. Une fois filtrée, cette solution peut être laissée à température ambiante selon le protocole standard.

Euthanasier le rat avec de l’isofluor dans une chambre à gaz. Désinfectez la zone d’incision sur le thorax avec de l’éthanol à 70 %. Ouvrez la poitrine à l’aide de ciseaux et exposez le cœur.

Injectez dans le ventricule gauche une solution d’héparine de 0,5 millilitre. Retirez le cœur avec une grande partie de l’aorte intacte. Insérez immédiatement le cathéter dans l’aorte.

Un cœur de rat typique devrait produire une fraction élevée de myocytes sains en forme de bâtonnet et peu de cellules arrondies mortes. Si la procédure suivante est correctement respectée, pour commencer, clampez l’aorte au cathéter. L’extrémité du cathéter ne doit pas être enfoncée trop loin dans le cœur pour assurer une bonne perfusion du cœur à travers l’artère coronaire.

Une fois clampé, attachez l’aorte au cathéter avec la suture. Ensuite, ouvrez le régulateur de ligne IV pour permettre un taux d’égouttement rapide et permettre à l’abeille tampon de laver le cœur pendant le lavage de l’abeille tampon. Utilisez les petits ciseaux et la pince pour retirer les oreillettes et tout tissu adipeux ou pulmonaire accroché au cœur.

Une fois la mémoire tampon B terminée, basculez le flux vers la mémoire tampon pendant un certain temps. La mémoire tampon A peut s’écouler pendant cinq minutes. Réchauffez la solution enzymatique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Lorsque le tampon A est épuisé de la seringue mais toujours présent dans la tubulure, chargez 50 millilitres de la solution enzymatique dans la seringue A de l’appareil de profusion. Il est maintenant nécessaire de jeter tout le flux du bécher collecteur dans le bain-marie jusqu’à ce que la solution enzymatique parcourt le cœur. Dès que la solution enzymatique parcourt le cœur, activez la pompe péristaltique, qui est configurée pour transférer la solution enzymatique du bécher collecteur à la seringue réapprovisionnée.

A Laissez la solution enzymatique circuler dans le cœur pendant 10 minutes. Au fur et à mesure que le cœur digère son cœur, il commence à gonfler à 37,5 microlitres de chlorure de calcium à 0,1 molaire par rapport à la solution enzymatique de la seringue A pour donner une concentration efficace de 0,1 millimolaire de calcium. Il s’agit du premier de plusieurs ajouts de chlorure de calcium utilisés pour augmenter la concentration après 10 minutes, augmenter la concentration de calcium à 0,2 millimolaire en ajoutant 50 microlitres supplémentaires de chlorure de calcium à 0,1 molaire à la seringue A et laisser la profusion se poursuivre pendant 10 minutes supplémentaires.

Au bout de 10 minutes, coupez les ventricules et transférez le cœur dans un petit bécher stérile contenant 20 millilitres de solution enzymatique dans le bécher. Augmentez la concentration de calcium à 0,4 millimolaire en ajoutant 40 microlitres supplémentaires de chlorure de calcium de 0,1 molaire, hachez doucement le cœur en 10 morceaux ou plus avec une paire de petits ciseaux stériles. Maintenant, incubez le bécher à 37 degrés Celsius en le balançant doucement.

Après cinq minutes d’incubation, ajoutez 40 microlitres de chlorure de calcium 0,1 molaire pour obtenir une concentration efficace de 0,6 millimolaire de calcium et itérez doucement les morceaux de cœur avec une pipette de transfert en plastique trois à cinq fois après l’incubation pendant cinq minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius, ajoutez 40 microlitres de chlorure de calcium 0,1 molaire et itérez doucement comme précédemment. Utilisez un filtre stérile de 500 micromètres pour séparer les myocytes simples digérés du tissu conjonctif indigéré. Laissez les cellules se déposer dans un tube de 50 millilitres pendant 10 minutes à température ambiante Jetez le surnageant avec un transfert VI Remettez doucement les cellules en suspension dans le tampon de lavage numéro un et laissez les cellules se déstabiliser pendant 10 à 20 minutes à température ambiante pendant que les cellules se déposent.

Prenez une petite aliquote et profitez-en pour évaluer la qualité et la viabilité des cellules en suspension au microscope inversé. Une bonne préparation aura une forte proportion de cellules en forme de bâtonnets avec des stries croustillantes. Une fois que les cellules se sont stabilisées, jetez le snat et remettez doucement les cellules en suspension dans le tampon de lavage.

Deuxièmement, laissez les cellules se déstabiliser à température ambiante, ce qui devrait à nouveau prendre 10 à 20 minutes, et jetez le surnageant. Remettez doucement les cellules en suspension dans un milieu sérique à 5 % avant de transférer les cellules dans des plaques de culture tissulaire. Lavez les plaques avec un XSFM.

Transférez les cellules à la densité souhaitée et incubez dans un incubateur de culture tissulaire au CO2. Pendant trois à cinq heures, passez au milieu d’un XSFM Les cellules peuvent être cultivées jusqu’à quatre jours et utilisées selon les besoins pour les expériences. Il devrait y avoir plus de 70 % de myocytes cardiaques vivants sous microscope inversé lorsque le protocole est fait correctement.

Il s’agit de myocytes isolés transfectés avec YFP REM après avoir été mis en culture pendant 48 heures. Des cellules de cette qualité sont généralement cultivées à partir de cette procédure. Nous allons juste vous montrer comment isoler et la culture sont des cellules chaudes.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être aussi rapide et aussi propre que possible. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.