Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l'acide acétique organique

Un protocole court pour la coloration des protéines de Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 dans des gels de polyacrylamide est décrite sans utiliser de solvants organiques ou d'acide acétique comme dans les procédures de coloration classique avec CBB.

Pour commencer cette procédure, le Kumasi Brilliant Blue ou CBG two 50 est dissous dans un litre d’eau bidistillée en agitant pendant deux à quatre heures. L’acide chlorhydrique est ensuite ajouté à la solution bleu foncé en agitant pendant une minute supplémentaire, et la solution est stockée dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure. Après la préparation de l’échantillon de protéines et la page STS, la cassette de gel est démontée et le gel placé dans une boîte pour trois étapes de lavage ultérieures avec de l’eau bidistillée.

Après la troisième étape de lavage, l’eau est remplacée par suffisamment de solution de coloration CBB pour couvrir le gel dans la boîte. La boîte est chauffée au micro-ondes pendant 10 secondes, puis la boîte contenant le gel est placée sur un shaker. Pour terminer la coloration, des bandes de protéines peuvent être observées après une minute.

Bonjour, je m’appelle Amri Lawrence et je travaille à l’installation de purification de la toux de l’expression protéique à Emberin Heidelberg. Aujourd’hui, nous allons vous montrer un protocole pour colorer les protéines avec du bleu brillant G cent 50 dans des gels de chlorure. Contrairement aux méthodes de coloration classiques, notre protocole n’utilise pas de solvants organiques ni d’acide acétique.

Nous utilisons ce protocole pour analyser nos protéines après chaque étape de purification. Alors commençons. Pour préparer la solution de coloration au CBB, 60 à 80 milligrammes de CBB sont dissous dans un litre d’eau distillée en remuant pendant deux à quatre heures.

Une fois le CBV dissous, transférez la solution dans une hotte. Dans la hotte, ajoutez soigneusement trois millilitres d’acide chlorhydrique concentré à la solution bleu foncé. En remuant pendant une minute, il faut porter des gants car la solution finale aura un pH de deux.

Une fois la solution préparée, elle est stockée dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure. La solution peut être conservée pendant des semaines ou jusqu’à plusieurs mois sans perdre son efficacité de coloration. Pour préparer les échantillons de protéines pour la page SDS, des aliquotes appropriées d’échantillons de protéines sont mélangées avec un tampon de chargement jusqu’à une concentration finale de un x tampon de chargement, chauffez les échantillons de protéines pendant environ cinq minutes avant le chargement.

Pendant que les échantillons sont chauffés, la chambre d’électrophorèse sur gel est préparée pour le traitement. Nous utilisons des gels préfabriqués dans une mini-cellule avec un tampon MES comme tampon de fonctionnement. Cependant, tout autre système de gel et d’électrophorèse peut être utilisé.

Les échantillons de protéines chauffés sont ensuite chargés sur le gel et l’électro East pendant 50 minutes à 220 volts. Lorsque la page FDS est terminée, la cassette de gel est démontée et le gel est placé dans une boîte avec 100 millilitres d’eau distillée. Pour les étapes de lavage suivantes, la boîte est chauffée au four à micro-ondes pendant 30 secondes.

Le chauffage doit être arrêté avant l’ébullition. Après avoir passé la boîte au micro-ondes avec le gel placé sur un shaker pendant trois à cinq minutes, répétez cette étape de lavage deux fois avec de l’eau douce. Après les trois lavages à l’eau, une solution stagnante de CBB est ajoutée pour couvrir le gel dans la boîte et la boîte est chauffée au micro-ondes pendant 10 secondes sans faire bouillir.

Après cela, la boîte avec le gel est placée sur un shaker pour terminer la coloration. Les bandes protéiques peuvent être observées au bout d’une minute et au bout de 15 à 30 minutes. La coloration est généralement assez forte.

La solution de coloration est versée et 50 à 100 millilitres d’eau bi distillée sont ajoutés. Afin de retenir davantage le fond bleu clair du gel sur un shaker, l’eau peut être remplacée par de l’eau douce pour une coloration supplémentaire. Si nécessaire, le gel peut maintenant être scanné, photographié ou séché pour un stockage à long terme.

Un gel qui a été taché à la suite de cette procédure devrait ressembler à ceci. Dans ce gel, les bandes protéiques sont bien colorées et clairement visibles. Alors que le contexte est négligeable.

La première voie indiquée par l’astérisque contient les marqueurs de poids moléculaire. En revanche, un gel qui n’a pas été suffisamment lavé avant la coloration ressemblera à ceci Dans ce gel, les étapes de lavage étaient trop courtes, de sorte que les bandes de protéines n’ont pas été assez bien colorées. Notez que la voie indiquée par l’astérisque contient les mêmes quantités de protéines de marqueurs de poids moléculaire qu’un gel précédent, mais présente une coloration moins efficace.

Nous venons de vous montrer comment colorer les protéines avec du bleu brillant massif dans des gels de polyamide sans avoir à utiliser de solvants organiques toxiques ou inflammables. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que les étapes de lavage sont essentielles pour la coloration efficace des protéines. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.