Name: La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Apprenez la greffe de cellules hématopoïétiques chez le poisson zèbre adulte pour étudier l'hématopoïèse. Cette méthode permet d'observer la différenciation des cellules souches et leur repopulation in vivo.

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L&#39;irradiation <ol><li> Poissons WT Irradier à 25Gy 2 jours avant la transplantation </li></ol> La dissection du rein <ol><li> Sacrifice nombre approprié de donateurs fluorescentes dans tricaïne (~ 100ml 4mg/ml tricaïne / litre d&#39;eau du poisson) (moyenne de 500 000 cellules par les poissons des donateurs) </li><li> Isoler les reins en 0.9x PBS + 5% SVF + 1% Penn streptocoque («PBS +&quot;) dans un tube </li><li> Rompre avec une pipette de 1 ml, puis avec une seringue de 10 ml avec 18 1 / 2 aiguilles G </li><li> Transférer dans 50mL conique et remplir avec du PBS + </li><li> Isoler @ 1500rpm 8min </li><li> Répands, Resuspendre le culot en grand volume et filtrer à travers du filtre 40micron </li><li> Isoler @ 1500rpm 8min </li><li> Répands, remettre en suspension dans 1ml de PBS +, transfert à tube Eppendorf </li><li> Pour compter: 10ul de cellules Sol + 90ul bleu trypan (maintenant il est dilué 10X) </li><li> 10ul de cellules Sol + 90ul PBS + (maintenant il est dilué 10X) </li><li> Laisser reposer 5 min, ajouter 10ul deux Sol de chaque côté de hématimètre </li><li> Compter les cellules dans la boîte de grande taille (5x5), compte pour le pourcentage de mort si elles sont significatives </li><li> Cellules / ml = (nombre de cellules) (10 4) (x10 dil. Factor) Exemple - 60 cellules comptées sur hématimètre est 6000000 cellules totales </li><li> Isoler l&#39;échantillon @ 1500rpm 8min </li><li> Calculer le volume de remettre en suspension le culot dans une concentration appropriée pour obtenir des cellules </li><li> 5ul volume total à injecter - 3UL WKM être et 2UL sanguins étant périphériques </li><li> Exemple - 6.000.000 cellules totales ont voulez transplanter 200.000 cellules par bénéficiaire 20 bénéficiaires ont veulent 66667 cellules / ul (200 000 cellules / 3UL) Resuspendre le culot dans 90ul (6.000.000 cellules / 66667 cellules / ul) seulement besoin d&#39;environ 60ul de ce (x 20recip 3UL) </li></ol> L&#39;extraction du sang périphérique <ol><li> Sacrifice nombre approprié de poissons dans le WT tricaïne (~ 100ml 4mg/ml tricaïne / litre d&#39;eau du poisson) pour le sang porteur (moyenne de 2.000.000 cellules par des bailleurs de fonds) </li><li> Anticoagulant: 1UL diluée (3unit/ul) dans 1ml de PBS + </li><li> Pipette Manteau avec de l&#39;héparine, poignarder travers des branchies avec embout de la pipette, ajouter du sang à la PBS + </li><li> Spin 1500rpm 5min, remettre en suspension dans 1,5 ml </li><li> Spin 1500rpm 5min, remettre en suspension dans 1ml </li><li> Filtrer à travers 40micron filtre </li><li> Compter les cellules comme ci-dessus </li><li> Cellules / ml = (nombre de cellules) (10 4) (x10 dil. Factor) </li><li> Compte de la mort </li><li> Calculer le volume resuspension comme ci-dessus </li></ol> Injection <ol><li> Injecter 5ul dans le cœur de chaque destinataire à l&#39;aide d&#39;une seringue Hamilton </li><li> Anesthetize poissons dans tricaïne (4,2 ml (4mg/ml) les poissons d&#39;eau tricaïne / 100ml) et le placer sur une éponge humide </li><li> Insérer le bout un peu en arrière du cœur </li><li> Furetez dans la région du cœur jusqu&#39;à ce que vous voyez un éclat un peu de sang (ce qui signifie que vous a frappé le cœur) -&gt; ne pas voir cela, mais tout de même d&#39;injecter </li></ol> Soins intensifs de poissons - post-injection <ol><li> Gardez le poisson hors de débit pour 1 semaine pour éviter l&#39;infection </li><li> Mettre le poisson 5-10 par la cage </li><li> Retirer morts et garder une trace </li><li> Modifier manuellement l&#39;eau chaque jour </li></ol>

la transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont une population rare de cellules pluripotentes qui maintiennent toutes les lignées sanguines différenciées à travers la vie d&#39;un organisme. La définition fonctionnelle d&#39;un HSC est une cellule transplantée qui a la capacité de reconstituer toutes les lignées de sang d&#39;un terme bénéficiaires irradiés longtemps. Cette désignation a été créé par des décennies de travail séminal dans les systèmes mammifères. En utilisant la transplantation de cellules hématopoïétiques (HCT) et inverser les manipulations génétiques chez la souris, les facteurs qui sous-tendent la réglementation de la biologie HSC commencent à être dévoilés, mais sont encore largement sous-exploré. Récemment, le poisson zèbre est apparu comme un puissant modèle génétique pour l&#39;étude des vertébrés hématopoïèse. Établir HCT chez le poisson zèbre permettra aux scientifiques d&#39;utiliser les méthodologies à grande échelle de dépistage génétique et chimique disponible dans le poisson-zèbre pour révéler de nouveaux mécanismes qui sous-tendent la réglementation HSC. Dans cet article, nous démontrons une méthode pour effectuer HCT chez le poisson zèbre adulte. Nous montrons la dissection et la préparation de la moelle des reins zebrafish ensemble, le site de l&#39;hématopoïèse adulte dans le poisson zèbre, et l&#39;introduction de ces cellules du donneur dans la circulation des poissons bénéficiaires irradié par injection intracardiaque. De plus, nous décrivons les soins post-transplantation de poissons dans une &quot;unité de soins intensifs&quot; pour augmenter leur santé à long terme. En général, les soins douceur du poisson avant, pendant et après la greffe est essentiel d&#39;augmenter le nombre de poissons qui survivent plus d&#39;un mois suivant la procédure, ce qui est essentiel pour l&#39;évaluation de long terme (&lt;3 mois) la prise de greffe. Les données expérimentales utilisées pour établir ce protocole seront publiés ailleurs. La création de ce protocole permettra à la fusion de la génétique de poisson zèbre à grande échelle et la biologie de greffe.

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont une population rare de cellules pluripotentes qui maintiennent toutes les lignées sanguines différenciées tout au long de la vie d'un ...

Je m'appelle Jocelyn Blank. Je suis technicienne dans le laboratoire de Lauren Z. J'étudie donc l'hématopoïèse et le poisson zèbre. Nous essayons donc d'en apprendre davantage sur l'hématopoïèse, en particulier.Voici donc un schéma général de l'hématopoïèse. On part d'une cellule souche métasomique à long terme, capable d'automultiplication, qui peut également donner une cellule souche à court terme. Cette dernière peut ensuite produire des progéniteurs : un progéniteur lymphoïde et un progéniteur myéloïde. Ces derniers engendrent respectivement des cellules lymphoïdes ou myéloïdes.Nous sommes donc très intéressés par cette phase initiale du processus par laquelle les CSH peuvent donner des progéniteurs, qui à leur tour produisent les cellules différenciées. J'irradie des poissons de type sauvage à 25 gray, deux jours avant la transplantation. Ainsi, nous disposons d'un système débarrassé de cellules hématopoïétiques résidentes, ce qui nous permet de greffer de la moelle osseuse provenant de donneurs transgéniques fluorescents. De cette manière, nous pouvons suivre les cellules que nous transplantons et évaluer leur capacité à repeupler le compartiment sanguin. Le jour de la transplantation, sacrifier le nombre approprié de donneurs fluorescents dans le trican.Attendez simplement jusqu'à ce que vous ne voyiez plus les branchies bouger. Je place donc celui-ci sur un plat comme celui-ci, une surface plane, puis je fais une petite incision juste sous son ventre, ce qui me permet d'insérer les ciseaux et de couper le long du ventre. Ceci ? Oui, donc maintenant il est coupé jusqu'ici et j'ouvre légèrement le poisson.Ensuite, avec l'autre, retirez l'autre organe. Le rein se situe le long du dos du poisson. Puis-je prendre ma bonne pince et l'agripper en haut, puis le détacher vers le bas et enlever cette bande, puis le placer dans le tube, donc maintenant je vais simplement le transférer dans un tube conique et je vais simplement le mettre de haut en bas.Pour fragmenter les morceaux de rein, nous les passerons à l’aide d’une seringue de 10 ml et d’une aiguille de 18 et demie de calibre, puis les transférerons dans un tube que nous remplirons de solution PBS. Centrifuger à environ 5 000 tr/min pendant ce temps pour suspendre le culot, puis filtrer à l’aide d’un filtre à cellules de 40 µm. Il faut bien passer la suspension à travers le filtre afin de retenir tous les gros fragments éventuels.Verser le milieu de resuspension dans un mL de PBS plus compter les cellules. Calculer le nombre de cellules à transplanter, sacrifier le poisson et trier la couche, utiliser une pipette avec de l'héparine. Perforer à travers la branchie avec la pointe de pipette, ajouter le sang à la solution de PBS.Faire une centrifugation pour faire tomber le culot, resuspendre, puis effectuer une nouvelle centrifugation. Filtrer à l’aide d’un filtre de 40 microns et dénombrer les cellules comme pour la moelle du rein entier. Je vais donc remplir la seringue avec les cellules jusqu’à un volume de cinq microlitres, en veillant à ce qu’il n’y ait aucune bulle dans la seringue.Les poissons seront anesthésiés dans du trica avant l'injection. Pour l'injection, injectez cinq microlitres de la solution de moelle de rein entier et de sang périphérique dans le cœur de chaque receveur à l’aide d’une seringue Hamilton. Ensuite, je vais retirer légèrement la seringue vers l’arrière.Le cœur se trouve à peu près ici, c'est donc là que je veux arriver. Je vais l'insérer en restant très superficiel. Ensuite, je vais piquer autour, juste ici où se situe le cœur.Et parfois, vous voyez un jet de sang, ce qui signifie que vous avez touché le cœur. Parfois, ce n'est pas le cas. Je ne vois aucun sang, donc je vais simplement injecter.C'est tout. Maintenez les poissons hors du flux pendant une semaine afin d'éviter toute infection. Conservez environ cinq à dix poissons par cage, retirez les poissons morts chaque jour et changez manuellement l'eau chaque jour.Ainsi, la moelle rénale est l'endroit où, selon nous, les cellules souches résident et produisent leurs progéniteurs. C'est un peu comme la moelle osseuse chez l'humain. Ainsi, lorsque nous réalisons des greffes de moelle osseuse chez l'humain, c'est exactement la même idée lorsque nous les transplantons dans le cœur de l'animal.Ceci vient, nous avons essayé différentes méthodes. Celle-ci est la manière la plus efficace d'introduire les cellules en circulation. La moelle rénale est l'endroit où les HSP peuvent former toutes leurs protéines.Ainsi, les cellules HSE doivent rejoindre la moelle rénale via la circulation. Si nous observons une repopulation de la moelle, alors nous savons que nous avons transplanté une cellule souche hématopoïétique à long terme, car il s'agit de la seule cellule capable de se repopuler et de produire toutes ces cellules. C'est cela qui nous intéresse le plus.Je dirais donc sans aucun doute que les injections elles-mêmes nécessitent beaucoup de pratique, et qu’un grand nombre de poissons mourront. Essentiellement, il s’agit d’essayer d’injecter dans le cœur, or on n’est pas toujours certain d’y parvenir, car c’est très difficile à voir. De plus, il faut aussi s’assurer de ne pas tuer le poisson lors de l’injection.Ainsi, lors de l'injection, vous pourriez toucher d'autres organes internes, ce qui peut entraîner la mort ou provoquer une infection après l'injection. En général, un grand nombre de poissons meurent le jour suivant l'injection. Ce que nous essayons maintenant, c'est de tout maintenir aussi stérile que possible et de ne pas remettre les poissons dans le flux, ni dans l'eau du système, car ils pourraient contracter des infections de cette manière.Nous les maintenons donc séparés, nous changeons l’eau chaque jour et nous envisageons d’ajouter des antibiotiques à l’eau, des mesures de ce type, simplement pour les maintenir en meilleure santé pendant cette période critique juste après la greffe. Ainsi, nous pouvons l’utiliser pour étudier des mutants. Si nous pensons qu’un mutant présente un défaut dans ses cellules souches, nous pouvons lui prélever une moelle que nous transplantons dans des poissons de type sauvage.Ou nous pouvons transplanter une moelle de type sauvage dans ces poissons et voir s'il existe un problème lié aux cellules souches elles-mêmes ou au créneau des cellules souches. Ainsi, pour une certaine raison, si les cellules souches ne parviennent pas à rejoindre la moelle rénale, cela constituerait un problème. Nous pourrions donc mesurer cela en fonction de la capacité des poissons à accepter la greffe ou non.

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