Name: EsiRNA MISSION pour le dépistage de lARNi dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Découvrez le criblage à haut débit avec des bibliothèques esiRNA pour identifier les gènes impliqués dans la division cellulaire chez les mammifères. Cette méthode optimise la transfection et valide les résultats par ARNsi indépendants.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Buchholz et le Sigma-Aldrich ARNi équipe pour la discussion. Nous tenons à remercier la Société Max Planck et le Bundesministerium für Bildung und Forschung Grands Allez-Bio [0315105] pour le soutien. MISSION ® est une marque déposée de Sigma-Aldrich Biotechnology LP

1. Haute qualité des bibliothèques esiRNA MISSION <ol><li> Pour chaque gène d&#39;intérêt de la région cible la plus sensible et spécifique pour l&#39;ARNi est choisi en utilisant l&#39;algorithme DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4. Scores DEQOR le potentiel de tous les faire taire 21 nucléotides possibles siRNA longtemps dans une cible basée sur l&#39;ARNm état ​​de l&#39;art design 4-contraintes. En outre, chaque siARN potentiel est analysé pour d&#39;éventuelles réactions croisées avec d&#39;autres gènes en effectuant une recherche BLAST contre le transcriptome de l&#39;organisme étudié. Le programme fournit ainsi une analyse de la qualité globale et transversale de silençage capacités des esiRNA potentiels (300-600 longueur pb). </li><li> La région choisie du gène cible d&#39;ADNc est amplifié par PCR en utilisant des amorces spécifiques de gènes flanqués de bactériophages ARN-polymérase-promoteur séquences. </li><li> Chaque produit de PCR utilisées pour la production esiRNA MISSION est vérifié pour l&#39;identité par séquençage et de la pureté par Caliper LabChip analyse. </li><li> Longue ARN double brin sont transcrits à partir du produit de PCR par l&#39;ARN polymérase, suivie d&#39;un recuit des brins transcrits. </li><li> esiRNAs sont préparés par digestion enzymatique limitée de la longue ARN double brin à l&#39;aide RNaseIII suivie d&#39;une purification par chromatographie échangeuse d&#39;anions en utilisant colonnes de centrifugation Q-sépharose. </li><li> esiRNAs sont précipités et remis en suspension dans du tampon TE. Le rendement est mesuré par absorption UV des mesures et la concentration est ajustée par dissolution dans un volume approprié de tampon TE. La qualité globale du produit final est contrôlé par Caliper LabChip analyse. </li></ol> 2. Choisir une lignée cellulaire et l&#39;optimisation de la transfection pour le dépistage <ol><li> Titrer quantités d&#39;esiRNA (utilisation Eg5 comme positive et Renilla-luciférase comme témoin négatif) et l&#39;augmentation des quantités de réactifs de transfection dans une plaque de 384 puits, ajouter des cellules et incuber pendant 48 heures. Eg5 est une protéine motrice kinésine nécessaire à l&#39;assemblage du fuseau bipolaire et l&#39;épuisement conduit à un arrêt de la mitose. Répétez cette procédure pour différents réactifs de transfection et les lignées cellulaires. Ici, nous utilisons des cellules HeLa cultivées en suivant les procédures standard et oligofectamine (Invitrogen) comme réactif de transfection. </li><li> Pour choisir les conditions optimales de transfection compter les cellules transfectées avec Eg5 esiRNAs qui montrent un arrêt de la mitose (forme ronde) et le nombre total de cellules transfectées avec Renilla-luciférase (Rluc) esiRNA par microscopie optique. Choisissez la condition avec le moins de toxicité pour Rluc et le phénotype le plus prononcé pour les Eg5. Une méthode alternative pour l&#39;optimisation des conditions de transfection implique une lignée cellulaire stable exprimant l&#39;EGFP (ou un autre gène rapporteur approprié) sous le contrôle d&#39;un promoteur constitutif actif. Après transfection d&#39;un esiRNA contre EGFP (ou un autre gène rapporteur) et Rluc (ou un autre contrôle approprié esiRNA négatif) de mesurer le knock-down efficacité et la toxicité, par exemple par tri cellulaire par fluorescence assistée (FACS). Assurez-vous que le esiRNA utilisé pour EGFP est parfaitement complémentaire de la cible d&#39;ARNm. </li></ol> 3. Configuration de l&#39;écran primaire 5,6 <ol><li> Optimiser la précision de pipetage pour tous les composants utilisés sur une station de pipetage automatique (par exemple, le Verseau, Tecan et WellMate, Matrix). Parce que les paramètres de pipetage changer selon le type de type de solution, le volume et la plaque de cette optimisation doit être répétée pour chaque étape séparément. Si possible, la station de pipetage doit être placé sous une hotte à flux laminaire pour éviter les contaminations. Tous les composants utilisés doivent être désinfectés avant usage, soit par autoclavage le cas échéant, ou par pulvérisation avec de l&#39;éthanol à 75%. Optimiser les protocoles de lavage de telle sorte que la contamination croisée du puits à bien exclu. Détails pour l&#39;optimisation de pipetage automatique ne peut pas être donner de l&#39;espace-contraintes et dépendent largement de la station de pipetage utilisée. Pour plus d&#39;informations reportez-vous à la fabrique du protocole. </li><li> Cellules Transfecter en format de 384 puits en utilisant les conditions optimisées d&#39;en haut avec esiRNAs d&#39;Eg5 et Rluc. Utiliser un modèle alternatif pour Eg5 et Rluc esiRNA couvrant toute la plaque. </li><li> Après une incubation de 48 heures fixer les cellules avec de l&#39;éthanol 100% froid, réhydrater dans du PBS pendant 15 minutes, une teinture pendant 25 minutes dans du PBS contenant 1 ug / ml DAPI et 100 pg / ml de RNase A (Qiagen). Enfin laver avec du PBS et stocker à 4 ° C. </li><li> Mesure de l&#39;intensité de fluorescence DAPI-par exemple par la microscopie sur un système Olympus scanR. Générer un histogramme en traçant l&#39;intensité DAPI contre le nombre de cellules et d&#39;évaluer la distribution du cycle cellulaire en calculant le pourcentage de cellules avec l&#39;ADN contenu 2N pour G1-phase; &lt;2N&gt; 4N pour la phase S; 4N pour G2/M-phase et &gt; 4N de l&#39;aneuploïdie / polyploïdie. </li><li> Evaluer l&#39;homogénéité des résultats sur la plaque. Une optimisation plus poussée est nécessaire si les résultats diffèrent de façon significative la position d&#39;exclure EFFEcts. Un problème commun lors de l&#39;utilisation plaques multi-puits est l&#39;évaporation accrue au niveau des puits bord pendant la durée d&#39;incubation. Cela conduit à différentes conditions expérimentales dans différents puits, qui se traduit souvent par la plaque-position des effets spécifiques. Pour cette raison, nous recommandons de laisser tous les puits vides bord d&#39;un écran. Pour réduire davantage l&#39;évaporation de s&#39;assurer que les incubateurs sont maintenus à une humidité élevée. Nous avons également régulièrement emploient des obstacles tels que l&#39;évaporation de bandes d&#39;étanchéité Corning respirant qui bloque l&#39;évaporation. Aussi les ressources d&#39;autres effets de position doivent être pris en considération, par exemple, la variation technique du système de lecture (microscope, un lecteur de plaques, etc) ou des variations dans la manipulation de liquides (gradients, inhomogénéité de solutions, etc.) </li><li> Les différences statistiques entre les contrôles positifs et négatifs de fournir une mesure de l&#39;importance du test employé. Une grande différence entre le contrôle négatif (ou bruit de fond; maquette de contrôle) et l&#39;échantillon doit être établie avant de commencer le dépistage du réel. Une bonne mesure de la signification statistique est le facteur Z. Le facteur Z est calculé selon l&#39;équation: Z = 1 - (3 SD [échantillon] + 3 SD [maquette]) * (| Av. [échantillon] - Av. [maquette] |) -1; avec SD: déviation standard; Av.: moyenne. Un facteur Z de 1&gt; Z&gt; 0,5 indique une séparation significative des contrôles négatifs (et le bruit) des contrôles positifs 7. </li></ol> 4. L&#39;écran principal <ol><li> Préparer plaques 384 puits de culture tissulaire pour la transfection des esiRNAs utilisant les conditions optimisées par le haut. Ici, nous utilisons esiRNA 15ng par puits dissous dans un tampon TE 5uL. Au moins huit postes de contrôle par plaque doit être chargé avec adaptés contrôles positifs et négatifs pour le processus biologique étudié (ici: Eg5 et Rluc). Pour éviter les effets de position des puits bord sont chargés avec 5uL tampon TE seulement. </li><li> Ajouter 5uL OptiMEM (Invitrogen) contenant Oligofectamine 0.2μl par puits, mélanger et laisser incuber pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter suspension cellulaire sur le mélange de transfection (ici: 40μl d&#39;une suspension de cellules HeLa à 25 cellules / ul de concentration; équivalent à 1000 cellules par puits) et incuber pendant 72 heures. </li><li> Mesurer l&#39;ADN contenu sur un microscope automatisé (Olympus scanR, voir ci-dessus). Évaluer à l&#39;aide du Z-score de statistiques pour la sélection de hit: Z-scores sont calculés pour l&#39;ensemble de l&#39;échantillon esiRNAs utilisant le signal pour le contrôle négatif comme référence. Remarque, le Z-score n&#39;est pas le même que le Z-facteur. Z-scores de fournir une mesure statistique pour la signification des valeurs de l&#39;échantillon en comparaison à un contrôle (maquette). Elle est calculée suivant l&#39;équation: Z = (valeur [Exemple] - moyenne [maquette]) * écart-type [maquette] -1. Pour la sélection touché un seuil doit être appliquée. Typiquement, un critère d&#39;importance comme: 2 &lt;Z &lt;-2 est utilisé, mais en fonction de la qualité des données, le processus biologique étudié ou simplement la portée de l&#39;écran, différents seuils peuvent être applicables. A côté de la assez facile Z-score statistiques font également plus élaborées des méthodes d&#39;évaluation mathématiques peuvent être utilisées (une première dans l&#39;intérieur du vaste champ de l&#39;évaluation statistique des données du dépistage peuvent être trouvés dans Malo et al. 8). </li></ol> 5. L&#39;écran secondaire et la validation frappé <ol><li> Un écran secondaire suit l&#39;écran principal d&#39;éliminer les faux positifs dus à des erreurs expérimentales ou effets hors-cible. Pour les hits choisis la même procédure utilisée dans l&#39;écran principal devrait être répétée pour un plus grand nombre de répétitions (3-5) pour permettre une meilleure évaluation statistique. </li><li> Pour frappe vérifié un esiRNA secondaire non-cumul (ou un autre déclencheur taire non-cumul) à l&#39;encontre des objectifs identifiés dans les écrans initiale devrait être utilisée. Le même dosage et la lecture doit être appliqué que pour l&#39;écran principal. </li><li> Finalement, les gènes sélectionnés peuvent être validées par inter-espèces de secours ARNi 9. Ainsi un chromosome bactérien artificiel (BAC) d&#39;encodage par exemple l&#39;orthologue de la souris du gène est transfectées de façon stable dans les cellules. BAC-construit de préserver un gène dans son contexte génomique et de permettre une expression quasi-physiologiques. ARNi contre le gène endogène humain va quitter l&#39;expression du transgène de souris inaltéré qui sauve le RNAi-phénotype. ARNi de sauvetage fournit l&#39;étalon-or pour la vérification des phénotypes ARNi disponibles à ce jour. </li><li> Enfin, les candidats validés sont étudiés plus en détail pour éventuellement tirer compréhension mécaniste. Dans de nombreux cas l&#39;ARNi peut être utilisée dans ces expériences, par exemple dans le secondaire, les tests plus élaborés. </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
<li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEQOR%3A+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li>
<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

Auteurs de déclarer des relations financières avec des entités commerciales qui pourraient avoir un intérêt dans le travail présenté.

Interférence ARN est devenue une technique standard pour étudier la perte de fonction des phénotypes. À grande échelle des collections de l&#39;ARNi médiateurs sont disponibles auprès de différents fournisseurs et de fournir une méthode simple, efficace et rapide pour le gène de silençage. Cela a ouvert la porte pour le dépistage systématique des acteurs-clés dans de nombreux processus biologiques permettant une perspective échelle du génome sur un large éventail d&#39;espèces différentes et de types cellulaires. Taux élevé de faux positifs et de faux négatifs sont un défi commun dans les écrans de l&#39;ARNi. Pour résoudre ce problème, des efforts considérables ont été investis pour améliorer l&#39;efficacité et en particulier de la spécificité de la réduction au silence des déclencheurs. Une découverte importante est que d&#39;une piscine de siRNA ciblant différents la même transcription améliore considérablement la spécificité cible. Parce que d&#39;une piscine très complexe de siRNA différent est produit par le endoribonucléase, esiRNAs sont élevés déclenche une spécificité de ciblage, réduire le taux de faux positifs dans les écrans de l&#39;ARNi. esiRNAs ont également démontré pour atteindre passes rabattues efficace, de réduire également le taux de faux négatifs. Parce écrans ARNi sont techniquement exigeants, ils vont probablement rester difficiles à réaliser sur une base régulière pendant un certain temps. Cependant, comme les réactifs et les instruments se laboratoires mieux et plus partager leur expertise, l&#39;utilisation d&#39;écrans ARNi dans la biologie moderne sont réputés pour augmenter à l&#39;avenir.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Pour plus d'informations, contacter : rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandes d'étanchéité perméables à l'air</td><td>Corning</td><td>Bande d'étanchéité perméable à l'air, stérile (Produit n° 3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Éthanol&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Preuve 200 (absolu), pour biologie moléculaire</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Solution tampon phosphate&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Réactif BioReagent, concentré 10x, adapté à la culture cellulaire, pour biologie moléculaire</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&amp;#8242;,6-diamidino-2-phénylindole, dihydrochlorure&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Poudre, réactif BioReagent, adapté à la culture cellulaire, &amp;gt;98 % (HPLC et CCM)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonucléase A provenant du pancréas de bovin&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Pour biologie moléculaire, &amp;#8805;70 unités Kunitz/mg de protéine, poudre lyophilisée</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Solution tampon Tris-EDTA&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100 x, pour biologie moléculaire</td></tr></tbody></table>

esirna mission pour le dépistage de l&#39;arni dans les cellules de mammifères

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

L&#39;interférence ARN (ARNi) est un mécanisme cellulaire de base pour le contrôle de l&#39;expression génique. L&#39;ARNi est induit par courts ARNs double brin également connu comme les petits ARN interférents (siRNA). Les courts ARN double-brin proviennent de plus à double brin par des précurseurs de l&#39;activité de Dicer, une protéine de la famille des RNases III de endonucléases. Les fragments résultants sont des composantes du complexe ARN-induite taire (RISC), il dirige à l&#39;ARNm cible apparenté. RISC clive l&#39;ARNm cible réduisant ainsi l&#39;expression de la protéine codée 1,2,3. L&#39;ARNi est devenue une méthode puissante et largement utilisée expérimentale pour la perte d&#39;études fonction des gènes dans les cellules de mammifères en utilisant de petits ARN interférents. Actuellement, deux méthodes principales sont disponibles pour la production de petits ARN interférents. Une méthode consiste à la synthèse chimique, tandis qu&#39;une autre méthode emploie un clivage endonucléolytique des cibles spécifiques à long ARN double brin par la RNase III in vitro. Ainsi, un bassin diversifié de siRNA-comme oligonucléotides est produit qui est également connu comme endoribonucléase préparés siRNA ou esiRNA. Une comparaison de l&#39;efficacité de siRNA chimiquement dérivées et esiRNAs montre que les deux déclencheurs sont puissants dans gène cible au silence. Les différences peuvent cependant être vu quand on compare la spécificité. Beaucoup seule siRNA synthétisés chimiquement produisent éminents effets hors-cible, tandis que le mélange complexe inhérente à esiRNAs conduit à un effet de choc plus spécifiques 10. Dans cette étude, nous présentons la conception de l&#39;échelle du génome bibliothèques esiRNA MISSION et son utilisation pour le dépistage RNAi illustrée par un écran d&#39;ADN contenu pour l&#39;identification des gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire. Nous montrons comment optimiser le protocole de transfection et le test de dépistage dans le haut débit. Nous avons également démontrer comment de grandes séries de données peuvent être évaluées statistiquement et présenter des méthodes pour valider frappe primaire. Enfin, nous donnons potentiels points de départ pour d&#39;autres caractérisations fonctionnelles des hits validés.

Ici, nous utilisons une bibliothèque esiRNA homme dans un écran à haut débit pour les gènes impliqués dans la division cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et mener une esiRNA écrans, ainsi que la façon d&#39;analyser et de valider les résultats.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

L'interférence ARN (ARNi) est un mécanisme cellulaire fondamental pour le contrôle de l'expression génique. L'ARNi est induite par de courts ARN double brin également connus sous le nom de ...

Le criblage des gènes associés au cycle cellulaire par ARN interférent commence par le choix d'une technologie d'extinction appropriée, Mission.Easy. Les bibliothèques d'ARNi de Sigma-Aldrich exploitent l'efficacité et la spécificité élevées des siARN préparés par endoribonucléase. Les ARN Easy sont des mélanges complexes d'individus siARN, préparés par digestion enzymatique d'ARN double brin long, complémentaire de l'ARNm cible. Le regroupement de siARN ciblant le même transcrit augmente la spécificité et évite la recherche fastidieuse de siARN individuels efficaces et spécifiques.Cela rend l'ARN interférent particulièrement adapté aux criblages à grande et moyenne échelle visant une perte de fonction. Nous détaillons ici les étapes nécessaires à la réalisation d'un criblage à grande échelle de l'œil par ARN, depuis la mise en place d'une transfection à haut débit jusqu'au développement d'un dosage approprié. Cela est illustré par la mise en place d'un criblage destiné à identifier les gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire des mammifères.Tout d'abord, nous montrons comment la transfection des cellules hilariales a été optimisée, suivie d'une évaluation statistique de la qualité du test. Enfin, un écran à l'échelle du génome est réalisé pour mesurer la distribution du cycle cellulaire après l'ablation du gène cible. Les résultats positifs sont sélectionnés à l'aide de la statistique zco et vérifiés par des ARN faciles indépendants secondaires.En outre, nous décrivons des procédures expérimentales potentielles qui peuvent être utilisées pour compléter l'analyse par écran RNAi sur l'œil. Salut, je suis Ty de l'Institut Max Planck de biologie cellulaire moléculaire et de génétique. Et Tristan.Je suis Frank Al, également issu de l'Institut Marx Plunk à Dresde. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de mettre en place un écran de perte de fonction dans des cellules de mammifères en utilisant les ARN simples MISSION de Sigma Aldridge. Un essai destiné à mesurer la distribution du cycle cellulaire dans une population de cellules en culture tissulaire sera utilisé comme exemple afin de démontrer comment des gènes peuvent être associés à un processus biologique grâce à un criblage par ARN interférent.Commençons. Tout projet de criblage ARNi débute par le choix des déclencheurs de silençage. Les ARNsi préparés à partir d'endonucléases endogènes, ou easy RNA en abrégé, sont générés par digestion enzymatique limitée d'ARN double brin longs à l'aide de RNAses III. Chaque easy RNA est vérifié quant à son identité par séquençage et quant à sa pureté par analyse sur puce Caliper Lab Chip.La combinaison de siARN individuels ciblant tous le même transcrit augmente la spécificité, car chaque irna du mélange partage le même effet sur le gène ciblé, tandis que les effets hors cible sont dilués. Par conséquent, les easy RNAs présentent une bonne efficacité de silençage et une haute spécificité du gène cible, évitant ainsi les effets hors cible. Échelle du génome easy.Les bibliothèques d'ARN sont fournies par Sigma Aldrich. Dans des plaques de 384 puits, les puits périphériques sont laissés vides. De plus, huit positions au centre de la plaque sont laissées vides pour les témoins.Des sous-bibliothèques d'ARN faciles sont fournies dans des plaques de 96 puits, tous les puits étant occupés ici ; les clients peuvent décider de la manière dont les ARN faciles seront disposés dans ces plaques. Les ARN faciles individuels sont fournis dans des tubes simples. La transfection d'ARN facile nécessite une optimisation selon les différents réactifs de transfection et les lignées cellulaires.Ici, nous cultivons nos cellules selon des procédures standard et nous utilisons l'oligo comme réactif de transfection. Utilisez EEG cinq E-Z-R-N-A-A, une protéine motrice kinésine nécessaire à l'assemblage du fuseau bipolaire, comme témoin positif, et l'ARN facile de luciférase comme témoin négatif. Dans une plaque de 384 puits, effectuez un titrage avec différentes quantités d'ARN facile, par exemple, de un nanogramme à 56 nanogrammes par incréments de cinq nanogrammes, ainsi qu'avec des quantités croissantes de réactif de transfection, de 0,1 microlitre à 0,9 microlitre par incréments de 0,05 microlitre.Après avoir mélangé l'ARN et le réactif de transfection, ajoutez les cellules et incubez pendant 48 heures. Une fois la période d'incubation terminée, observez les cellules au microscope optique. Comptez les cellules transfectées avec eeg.Cinq ARN faciles présentant une forme ronde indicative de la mitose. Comptez également le nombre total de cellules transfectées avec un contrôle négatif. ARN facile de luciférase de gran vanilla.La condition de transfection optimale présente la moindre toxicité pour la luciférase vanille et le phénotype le plus marqué pour EEG cinq. Maintenant que les paramètres de transfection sont optimisés, passez à la mise en place de l'écran primaire. Les stations de pipetage automatisées telles que Matrix Wellm Mate ou Tecan Aquarius utilisées pour préparer les écrans primaires doivent être placées sous une hotte à flux laminaire afin d'éviter toute contamination.Tous les composants utilisés doivent être désinfectés avant utilisation, soit par autoclavage si applicable, soit par pulvérisation d'éthanol à 75 % avant l'analyse. Ces instruments doivent être optimisés conformément aux protocoles du fabricant. Optimisez la précision du pipetage pour tous les composants utilisés sur la station de pipetage automatisée, car les paramètres de pipetage varient selon le type de solution, le volume et le type de plaque.Cette optimisation doit être répétée pour chaque étape séparément. En outre, optimisez les protocoles de lavage afin d'exclure toute contamination croisée d'un puits à l'autre lorsque les stations de pipetage automatisées sont prêtes. Transfectez les cellules en format 384 puits en utilisant les conditions optimisées déterminées précédemment afin de s'assurer qu'aucun effet de position n'est observé.Utilisez des ARN faciles pour l'EEG cinq et la luciférase vanille avec un motif alterné couvrant toute la plaque. Laissez toutes les puits périphériques vides, car un problème courant lors de l'utilisation de plaques à puits multiples est l'évaporation accrue dans les puits situés en bordure pendant le temps d'incubation. Cela conduit à des conditions expérimentales différentes selon les puits, ce qui se traduit souvent par des effets de position sur la plaque. Pour minimiser davantage l'évaporation, utilisez des barrières anti-évaporation telles que le ruban respirant Corning.Veillez également à ce que les incubateurs soient maintenus à forte humidité. Toutefois, rappelez-vous qu'il peut exister des sources possibles d'effets de position, telles que des variations dans la manipulation des liquides ou dans le système de lecture, comme un lecteur de plaques. Après une incubation de 48 heures, fixez les cellules avec de l'éthanol glacé à 100 % pendant deux heures, puis réhydratez-les dans du PBS pendant 15 minutes.Colorer les cellules fixées pendant 25 minutes dans du PBS contenant un microgramme par millilitre de DPI et 100 microgrammes par millilitre d'ARN. Rincer ensuite trois fois avec du PBS et conserver à quatre degrés Celsius. Ensuite, mesurer l'intensité de la fluorescence du DPI par microscopie.Un système de numérisation Olympus est utilisé ici pour chacun. Examinons les cellules et déterminons l'intensité relative de DPI. Générons un histogramme en traçant l'intensité de DPI en fonction du nombre de cellules à partir de l'histogramme.Évaluer la distribution du cycle cellulaire en calculant le pourcentage de cellules ayant une teneur en ADN de 2N pour la phase G1/G0, comprise entre 2N et 4N pour la phase S, de 4N pour la phase G2/M, et supérieure à 4N pour l’aneuploïdie ou la polyploïdie. Afin d’évaluer l’homogénéité des résultats sur la plaque, comparer la distribution du cycle cellulaire entre les différents puits en analysant le pourcentage de cellules en phase G2/M pour les transfections EEG5 et luciférase ; si les résultats diffèrent significativement selon la position sur la plaque, une optimisation supplémentaire est nécessaire pour éliminer les effets de position. Une fois la cohérence des résultats jugée satisfaisante, calculer les différences statistiques entre les contrôles positifs et négatifs.Utilisez l'équation du facteur Z indiquée ici pour déterminer la signification statistique des résultats. L'abréviation SD correspond à l'écart type et AV à la moyenne. Un facteur Z compris entre un et 0,5 indique une séparation statistiquement significative des témoins négatifs et du bruit par rapport aux témoins positifs.Si une telle différence statistique a été établie, on peut passer à l'écran primaire. Préparez des plaques de culture tissulaire de 384 puits pour la transfection d'ARN faciles en utilisant ici les conditions optimisées prédéterminées.Quinze nanogrammes d'ARN facile par puits sont dissous dans cinq microlitres de tampon TE. Au moins huit positions de contrôle par plaque sont chargées avec des contrôles positifs et négatifs appropriés pour le processus biologique étudié ici, EEG cinq et ranil luciférase.Les ARN faciles sont utilisés pour éviter les effets de position. Les puits périphériques sont chargés uniquement avec cinq microlitres de tampon TE. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d'opti MEM contenant 0,2 microlitre de mélange d'oligonucléotides par puit et incubez pendant 20 minutes à température ambiante.Après avoir mélangé l'ARN avec le réactif de transfection, ajoutez ici la suspension cellulaire. 40 microlitres d'une suspension de cellules he R sont ajoutés à une concentration de 25 cellules par microlitre, soit 1000 cellules par puits, puis incubés pendant 72 heures. Après l'incubation de 72 heures.Mesurez la teneur en ADN à l’aide d’un microscope automatisé tel que l’Olympus scan R, comme indiqué précédemment. Répétez cette procédure pour toutes les plaques de la bibliothèque afin de sélectionner les résultats positifs. Évaluez les valeurs de teneur en ADN à l’aide de statistiques basées sur le score Z.Remarquez que le Z-score n'est pas identique au facteur Z ou Z-score. Fournit une mesure statistique de la significativité d'une valeur d'échantillon par rapport à un témoin négatif ou à un témoin factice. Il est calculé selon l'équation indiquée ici.Calculez le zco pour tous les échantillons d'ARN faciles en utilisant le signal du témoin négatif de la luciférase vanille comme référence pour la sélection des hits. Un seuil doit être appliqué. Généralement, un critère de significativité pour Z supérieur à deux ou inférieur à moins deux est utilisé. Toutefois, selon le processus biologique étudié ou l'objectif de l'écran, différents seuils peuvent être appliqués.Des méthodes d'évaluation mathématique plus élaborées, comme le Q, peuvent également être utilisées pour la sélection des hits. Ensuite, les hits sélectionnés sont soumis à un criblage secondaire et à une validation HIIT. Un criblage secondaire des gènes HIIT sélectionnés suit le criblage primaire afin d'éliminer les faux positifs dus aux variations expérimentales.Tout d'abord, vérifiez les succès sélectionnés en utilisant la même procédure que dans l'écran primaire, mais mettez en place les succès avec un plus grand nombre de réplicats, compris entre trois et cinq, afin de permettre une meilleure évaluation statistique. Pour les succès confirmés, utilisez le même test et la même mesure que dans l'écran primaire, mais avec un ARN facile secondaire non chevauchant ou un autre déclencheur de silençage non chevauchant, tel qu'un siARNA synthétisé chimiquement. Validez finalement les gènes sélectionnés par une approche interspécifique.Le sauvetage par ARNi constitue la norme de référence pour la vérification des phénotypes d'ARNi disponibles à ce jour. En résumé, un chromosome artificiel bactérien, abrégé en BAC, codant pour un orthologue d'une espèce différente du gène sélectionné, est transfecté de manière stable dans des cellules. Les constructions BAC préservent le gène dans son contexte génomique et permettent une expression quasi physiologique.Un ARNi dirigé contre le gène endogène ne modifie pas l'expression du transgène ortho, ce qui permet de récupérer le phénotype d'ARNi. Enfin, les candidats validés sont étudiés plus en détail afin d'obtenir éventuellement une compréhension mécanistique. Dans de nombreux cas, l'ARNi peut également être utilisé dans ces tests secondaires plus élaborés.Par exemple, la microscopie en temps réel des phénotypes d'ARNi. Voici un exemple de criblage du cycle cellulaire dans lequel la teneur en ADN de cellules R heal a été mesurée après l'inhibition de plus de 16 000 gènes du génome humain. 1 351 succès primaires ont été identifiés comme nécessaires à la division cellulaire.Lors de l'écran secondaire, 743 résultats positifs ont été vérifiés à l'aide d'un déclencheur d'ARN facile et indépendant, en utilisant un second test. Les inhibitions ayant entraîné un arrêt en phase G2 ont été séparées de celles ayant provoqué un arrêt mitotique. Enfin, une expérience de sauvetage oculaire par ARN interspécifique pour le gène Lin 54 a été utilisée afin de valider son rôle dans la division cellulaire correcte.Des expériences supplémentaires en aval ont montré que l'épuisement de Lin 54 modifiait l'expression de nombreux gènes du cycle cellulaire. Nous venons de vous montrer comment mettre en place une transfection à haut débit de RNAs Mission, Easy, et l'analyse de la distribution du cycle cellulaire dans une lignée cellulaire humaine en culture tissulaire. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les conditions de transfection et les tests doivent être optimisés séparément pour chaque système cellulaire et chaque processus biologique.L'utilisation de systèmes automatisés de manipulation liquide est recommandée, mais pas indispensable, notamment pour les criblages à petite échelle. La manipulation manuelle est également réalisable. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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