EsiRNA MISSION pour le dépistage de l'ARNi dans les cellules de mammifères

Le dépistage des gènes associés au cycle cellulaire par l’IA ARN commence par le choix d’une mission technologique appropriée. Facile. Les banques d’ARN de Sigma Aldridge utilisent la haute efficacité et la spécificité de l’endoribonucléase si préparée. Les ARN faciles sont des pools complexes d’ARN SI individuels, préparés par digestion enzymatique d’ARN longs double brins, complémentaires à la mise en commun cible des ARN SI ciblant le même transcrit, augmentant la spécificité et empêchant la recherche laborieuse d’ARN SI individuels efficaces et spécifiques.

Cela rend l’ARN facile particulièrement adapté aux écrans de perte de fonction à grande et moyenne échelle. Nous montrons ici les étapes nécessaires à la réalisation d’un criblage oculaire d’ARN à grande échelle, en commençant par la mise en place d’un transfect à haut débit jusqu’au développement d’un test approprié. Ceci est illustré par la mise en place d’un criblage des gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire des mammifères.

Tout d’abord, nous montrons comment la transfection des cellules hilaires est optimisée, suivie d’une évaluation statistique de la qualité du test. Enfin, un criblage à l’échelle du génome est effectué pour mesurer la distribution du cycle cellulaire après l’épuisement du gène cible. Les résultats sont sélectionnés à l’aide de la statistique zco et vérifiés par des ARN faciles indépendants secondaires.

De plus, nous décrivons des procédures expérimentales potentielles qui peuvent être utilisées pour suivre le dépistage oculaire de l’ARN. Bonjour, je suis Ty de l’Institut Max Plank de biologie cellulaire moléculaire et de génétique. Et Tristan.

Je m’appelle Frank Al, je travaille également à l’Institut Marx Plunk de Dresde. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de mise en place d’un dépistage de perte de fonction dans des cellules de mammifères à l’aide d’ARN de Sigma Aldridge. Un essai visant à mesurer la distribution du cycle cellulaire dans une population de cellules de culture tissulaire sera utilisé comme exemple pour démontrer comment les gènes peuvent être liés à un processus biologique à l’aide du criblage ARNi.

Alors commençons. Chaque projet de criblage d’ARNi commence par un choix de déclencheurs de silençage, des si préparés à l’endoribonucléase utilisés, des ARN ou des ARN faciles en abrégé sont générés par une digestion enzymatique limitée d’ARN double brin long à l’aide d’ARN trois. L’identité de chaque ARN simple est vérifiée par séquençage et la pureté par l’analyse de la puce de laboratoire de l’étalon.

Le regroupement de siRNA individuels ciblant tous le même transcrit augmente la spécificité car chaque ARNi du pool partage le même sur la cible, tandis que les effets hors cible sont dilués. Par conséquent, les ARN faciles ont une bonne efficacité de silençage et une spécificité de cible élevée, évitant ainsi les effets hors cible. Échelle du génome facile.

banques d’ARN sont fournies par Sigma Aldrich. En 384, les plaques de puits avec les puits de bord sont vides. De plus, huit positions au centre de la plaque sont laissées vides pour les commandes.

Des sous-bibliothèques d’ARN faciles sont fournies dans des plaques de 96 puits avec tous les puits occupés ici, les clients peuvent décider de la façon dont les ARN faciles seront disposés dans ces plaques. Les ARN simples individuels sont fournis dans des tubes uniques. La transfection de l’ARN facile nécessite une optimisation pour différents réactifs de transfection et lignées cellulaires.

Ici, guérir nos cellules cultivées selon des procédures standard et l’oligo comme réactif de transfection est utilisé. Utilisez l’EEG cinq E-Z-R-N-A-A protéine motrice de kinésine nécessaire à l’assemblage du fuseau bipolaire comme contrôle positif et l’ARN facile de la luciférase exécutée comme contrôle négatif. Dans une plaque à 384 puits, titrez différentes quantités d’ARN facile, par exemple, d’un nanogramme à 56 nanogrammes avec un incrément de cinq nanogrammes et des quantités croissantes de réactif de transfection de 0,1 microlitre à 0,9 microlitre avec un incrément de 0,05 microlitre.

Après avoir mélangé l’ARN et le réactif de transfection, ajoutez les cellules et incubez pendant 48 heures. Lorsque la période d’incubation est terminée, vérifiez les cellules au microscope optique. Comptez les cellules transfectées avec eeg.

Cinq ARN faciles qui présentent une forme ronde indiquant un mitotique. Les autres comptent également le nombre total de cellules transfectées avec un contrôle négatif. Gran vanilla luciférase ARN facile.

La condition de transfection optimale montre la toxicité la plus faible pour la luciférase à la vanille et le phénotype le plus prononcé pour l’EEG cinq. Maintenant que les paramètres de transfection sont optimisés, procédez à la configuration et à l’écran principal. Les stations de pipetage automatisées telles que Matrix Wellm Mate ou Tecan Aquarius utilisées pour préparer les tamis primaires doivent être placées sous une hotte à flux laminé pour éviter toute contamination.

Tous les composants utilisés doivent être désinfectés avant utilisation, soit par autoclave le cas échéant, soit par pulvérisation d’éthanol à 75 % avant l’écran. Ces instruments doivent être optimisés selon les protocoles du fabricant. Optimisez la précision du pipetage de tous les composants utilisés sur la station de pipetage automatisée, car les paramètres de pipetage changent en fonction du type de volume de solution et du type de plaque.

Cette optimisation doit être répétée pour chaque étape séparément. De plus, optimisez les protocoles de lavage afin d’exclure la contamination croisée d’un puits à l’autre lorsque les stations de pipetage automatisées sont prêtes. Transfectez les cellules au format 384 puits en utilisant les conditions optimisées précédemment déterminées pour s’assurer qu’aucun effet de position n’est observé.

Utilisez des ARN faciles pour l’EEG cinq et la luciférase vanille avec un motif alterné couvrant toute la plaque. Laissez tous les puits de bordure vides, car un problème courant lors de l’utilisation de plaques à plusieurs puits est l’évaporation accrue au niveau des puits de bordure pendant le temps d’incubation. Cela conduit à des conditions expérimentales différentes dans différents puits, ce qui se traduit souvent par des effets de position de la plaque pour minimiser davantage l’évaporation, des barrières d’évaporation pour les employés telles que Corning, du ruban de plafond respirant.

Assurez-vous également que les incubateurs sont maintenus à une humidité élevée. Cependant, n’oubliez pas qu’il existe des sources possibles d’effets de position telles que la variation dans la manipulation des liquides ou le système de lecture tel qu’un lecteur de plaques. Après une incubation de 48 heures, fixez les cellules avec de l’éthanol glacé pendant deux heures, puis réhydratez-les dans du PBS pendant 15 minutes.

Colorez les cellules fixées pendant 25 minutes dans du PBS contenant un microgramme par millilitre de DPI et 100 microgrammes par millilitre d’ARN. Enfin, laver trois fois avec du PBS et stocker à quatre degrés Celsius. Ensuite, mesurez l’intensité de la fluorescence DPI par microscopie.

Un système de scanner Olympus est utilisé ici pour chacun. Examinez bien les cellules et déterminez l’intensité DPI relative. Générez un histogramme en traçant l’intensité DPI en fonction du nombre de cellules en fonction de l’histogramme.

Évaluez la distribution du cycle cellulaire en calculant le pourcentage de cellules avec un contenu d’ADN A : deux N pour G, un G : une phase zéro entre deux N et quatre : N pour la phase S quatre, N pour G, deux phases MPH et plus grand que quatre N pour l’aneuploïdie ou la polyploïdie. Afin d’évaluer l’homogénéité des résultats sur la plaque, comparer la distribution du cycle cellulaire entre les différents puits en comparant le pourcentage de cellules en phase G deux M pour l’EEG cinq et la luciférase transfect si les résultats diffèrent significativement sur la plaque, une optimisation supplémentaire est nécessaire pour éliminer les effets de position. Une fois satisfait de la cohérence des résultats, calculez les différences statistiques entre les témoins positifs et négatifs.

Utilisez l’équation du facteur Z illustrée ici pour déterminer la signification statistique des résultats. SD signifie écart-type et AV signifie moyenne. Un facteur Z compris entre un et 0,5 indique une séparation statistiquement significative entre les témoins négatifs et le bruit et les témoins positifs.

Si une telle différence statistique a été établie, on peut passer à l’écran primaire. Préparez 384. Plaques de culture tissulaire pour la transfection d’ARN faciles en utilisant les conditions optimisées prédéterminées ici.

15 nanogrammes d’ARN facile par puits sont dissous dans cinq microlitres de tampon TE. Au moins huit postes de contrôle par plaque sont chargés avec des contrôles positifs et négatifs appropriés pour le processus biologique. Étudié ici, EEG cinq et ranil luciférase.

Des ARN faciles sont utilisés pour éviter les effets de position. Les puits de bord sont chargés de cinq microlitres de tampon TE uniquement. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’opti MEM contenant 0,2 microlitre d’oligo par mélange de puits et incubez pendant 20 minutes à température ambiante.

Après avoir mélangé l’ARN avec le réactif de transfection, ajoutez la suspension cellulaire ici. 40 microlitres d’une suspension de cellules R sont ajoutés à une concentration de 25 cellules par microlitre équivalente à 1000 cellules par puits incubé pendant 72 heures. Après l’incubation de 72 heures.

Mesurez le contenu en ADN à l’aide d’un microscope automatisé tel que l’Olympus scan R, comme indiqué précédemment. Répétez cette procédure pour toutes les plaques de la bibliothèque pour la sélection des résultats. Évaluez les valeurs de contenu en ADN à l’aide des statistiques du score Z.

Notez que le score Z n’est pas le même que le score Z du facteur Z. Fournir une mesure statistique de la signification de la valeur de l’échantillon par rapport à un contrôle négatif ou fictif. Il est calculé selon l’équation présentée ici.

Calculez le zco pour tous les échantillons d’ARN faciles en utilisant le signal pour le contrôle négatif de la luciférase vanille comme référence pour la sélection du hit, un seuil doit être appliqué. En règle générale, un critère de signification pour Z supérieur à deux ou inférieur à moins deux est utilisé. Cependant, en fonction du processus biologique étudié ou de l’étendue du criblage, différents seuils peuvent être appliqués.

Des méthodes d’évaluation mathématiques plus élaborées comme le Q peuvent également être utilisées pour la sélection des résultats. Ensuite, les résultats sélectionnés sont soumis à un dépistage secondaire et à une validation HIIT. Un dépistage secondaire des gènes HIIT sélectionnés suit le dépistage primaire afin d’éliminer les faux positifs dus à la variation expérimentale.

Tout d’abord, vérifiez les résultats sélectionnés à l’aide de la même procédure que dans l’écran principal, sauf que vous configurez les résultats avec un plus grand nombre de répétitions entre trois et cinq pour permettre une meilleure évaluation statistique. Pour les résultats vérifiés, utilisez le même test et la même lecture que dans le crible primaire, mais avec un ARN facile secondaire non chevauchant ou un autre déclencheur de silençage non chevauchant, tel qu’un si synthétisé chimiquement. Valider les gènes sélectionnés par espèces croisées.

RNAI rescue est l’étalon-or pour la vérification des phénotypes ARNi disponible à ce jour. En bref, un chromosome artificiel bactérien abrégé codant pour un ortho log d’une espèce différente du gène sélectionné est transfecté de manière stable dans les cellules. Les constructions dorsales préservent un gène dans son contexte génomique et permettent une expression presque physiologique.

L’ARNi contre le gène endogène laissera l’expression du transgène ortho inchangée, ce qui sauve le phénotype de l’ARNi. Enfin, les candidats validés ont étudié plus en détail pour finalement en tirer une compréhension mécaniste. Dans de nombreux cas, l’ARNi peut également être utilisé dans ces tests secondaires plus élaborés.

Par exemple, la microscopie time-lapse des phénotypes ARNi. Voici un exemple de criblage du cycle cellulaire dans lequel le contenu en ADN des cellules R a été mesuré après l’inactivation de plus de 16 000 gènes du génome humain. 1 351 résultats primaires ont été identifiés comme étant nécessaires pour la division cellulaire.

Dans le crible secondaire, 743 résultats ont été vérifiés avec un déclencheur d’ARN facile indépendant secondaire à l’aide d’un test secondaire. Les renversements qui ont entraîné une arrestation G two ont été séparés des renversements qui ont entraîné une arrestation mitotique. Enfin, dans l’expérience de sauvetage oculaire de l’ARN de l’espèce pour le gène, Lin 54 a été utilisé pour valider son rôle dans la division cellulaire appropriée.

D’autres expériences en aval ont montré que l’appauvrissement de Lin 54 modifiait l’expression de nombreux gènes du cycle cellulaire. Nous venons de vous montrer comment mettre en place la transfection de mission à haut débit, des ARN faciles et l’analyse de la distribution du cycle cellulaire dans la lignée cellulaire de culture de tissus humains. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les conditions de transfection et les dosages doivent être optimisés séparément pour tout système cellulaire et tout processus biologique.

L’utilisation de systèmes automatisés de manipulation des liquides est recommandée mais pas indispensable, en particulier pour les tamis à petite échelle. La manutention manuelle est également possible. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.