L’alimentation de l’ARNi en culture liquide : une méthode à haut débit pour inhiber l’expression génique chez C. elegans
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 3:15 min • April 30th, 2023
- Pour commencer, ajoutez de la carbénicilline et un IPTG millimolaire pour contrôler et tester les flacons de culture contenant du milieu basal S. Faites tourner un tube contenant des larves au premier stade de croissance, également appelées larves L1, pendant quelques minutes. Retirez maintenant le surnageant et placez deux microlitres de L1 sur une plaque de gélose. Placez la plaque sous un microscope à dissection et comptez le nombre de larves.
Ajouter les bactéries ARNi porteuses d’un plasmide ARNi non spécifique dans le ballon témoin et les bactéries contenant l’ARNi ciblant le gène dans le ballon d’essai. La quantité de bactéries ajoutées doit être proportionnelle au nombre de vers.
Laissez les larves grandir en secouant continuellement pour assurer une bonne oxygénation. Les larves se nourrissent des bactéries. À l’intérieur de la larve, le petit ARN interférent se lie à l’ARNm complémentaire produit par le gène ciblé et inhibe l’expression des protéines. Enfin, examinez les vers pour le phénotype qui vous intéresse.
Dans l’exemple de protocole, nous allons traiter des larves L1 avec de l’ARNi ciblant le gène daf-2, en culture liquide.
- Pour commencer le traitement, ajoutez 207,45 millilitres de milieu basal S avec des réactifs supplémentaires comme décrit dans le protocole de texte ci-joint à une fiole de culture Fernbach de 2 800 millilitres. Ajouter une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre de carbénicilline et 1 millimolaire d’IPTG, et fermer le ballon à l’aide d’un bouchon à vis à membrane.
Sortez les L1 de l’incubateur à 25 degrés Celsius et transférez-les dans des tubes de 15 millilitres. Centrifugez les L1 à 1 900 fois g pendant trois minutes. Après l’essorage, retirez le surnageant. Au microscope, comptez les L1 par deux microlitres et faites la moyenne des nombres obtenus à partir d’au moins neuf gouttes.
Ensuite, ajoutez 50 000 vers pour la collection de jeunes vers et 100 000 vers pour la collection de vers âgés dans quatre flacons de culture Fernbach préparés à l’étape précédente. Ajoutez ensuite les bactéries ARNi de contrôle et les bactéries ARNi pour le gène d’intérêt proportionnellement au nombre de vers.
Après avoir ajouté des bactéries, complétez la culture de vers avec S basal pour porter le volume total à 300 millilitres. Incuber la culture de vers à 25 degrés Celsius dans un incubateur secouant à 150 tr/min jusqu’à la collecte.
Aperçu
Cet article décrit un protocole utilisant l'interférence par ARN (ARNi) pour étudier la fonction des gènes chez les larves de stade L1. L'accent est mis sur le ciblage du gène daf-2 afin d'observer ses effets sur le phénotype.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Génétique
- Biologie du développement
Contexte
- L'interférence ARN est un outil puissant pour le silençage génique.
- Le gène daf-2 est connu pour jouer un rôle dans le développement et le vieillissement.
- Les larves L1 sont un organisme modèle pour l'étude des fonctions génétiques.
- Ce protocole permet une expérimentation contrôlée avec l'ARNi.
Objectif de l'étude
- Étudier les effets de la silenciation génique sur les larves L1.
- Comprendre le rôle du gène daf-2 dans le développement.
- Fournir une méthodologie détaillée aux chercheurs.
Méthodes utilisées
- Préparation du milieu basal S avec de la carbenicilline et du IPTG.
- Centrifugation des larves L1 afin de les isoler pour l'expérimentation.
- Comptage des larves au microscope pour une administration précise des doses.
- Inoculation des cultures avec des bactéries d'ARNi ciblant des gènes spécifiques.
Résultats principaux
- Croissance réussie des larves L1 en conditions contrôlées.
- Un silençage efficace des gènes observé après traitement par ARNi.
- Des modifications phénotypiques notées chez les larves traitées.
- Protocole validé pour des études futures sur la fonction des gènes.
Conclusions
- l'ARNi est une méthode efficace pour étudier la fonction des gènes chez les larves L1.
- Le gène daf-2 a un impact significatif sur le développement larvaire.
- Ce protocole peut être adapté à d'autres gènes d'intérêt.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode d'alimentation par ARNi à haut débit en culture liquide permet une inhibition génique évolutive chez C. elegans, facilitant la validation de cibles et le criblage phénotypique en phase précoce de découverte. En augmentant le nombre de vers traités au-delà des limites des plaques, cette approche améliore la reproductibilité des tests et la fiabilité prédictive pour l'atténuation des risques mécanistiques liés aux cibles thérapeutiques. Elle établit l'ARNi comme un outil évolutif pour les pipelines d'identification de candidats dans la recherche sur la neurodégénérescence et le vieillissement.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse de la fonction génique par inhibition de daf-2 afin d'évaluer l'impact sur le développement larvaire et les phénotypes liés au vieillissement.
- Valeur opérationnelle : Facilite le criblage à haut débit en permettant le traitement de populations plus importantes de vers en culture liquide, par rapport à l'alimentation classique sur boîtes.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives phénotypiques grâce au comptage des vers et à la surveillance de leur croissance dans des conditions liquides contrôlées.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'administration des vers et la livraison d'ARNi bactérien en utilisant des protocoles volumétriques proportionnels au nombre de vers.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit un système pertinent pour l'étude des voies de signalisation de l'insuline et de l'IGF-1 liées à la longévité et aux troubles métaboliques.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité entre la validation des cibles et le suivi mécanistique en utilisant des cultures de vers facilement reproductibles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce, en soutenant la validation de cibles grâce à l'inhibition génique médiée par ARNi et en permettant la progression vers l'identification de composés leaders par évaluation phénotypique chez C. elegans.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en inhibant daf-2 afin d'observer les effets sur le développement et les phénotypes d'agrégation des protéines.
- Criblage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs grâce à une culture standardisée de vers et une inoculation reproductible de bactéries exprimant des ARNi.
- Analytique : Permet de mesurer les modifications phénotypiques par le comptage des larves et le suivi de la croissance dans des conditions de culture définies.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la modulation de daf-2 et les voies du vieillissement, soutenant l'alignement de biomarqueurs dans les découvertes axées sur la longévité.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme reutilisable d'ARNi en culture liquide, applicable à plusieurs cibles géniques et à diverses campagnes de criblage.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en permettant une inhibition génique cohérente et reproductible à grande échelle dans un modèle génétiquement manipulable.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à une préparation standardisée des milieux, au comptage des vers et à un dosage proportionnel des bactéries d'ARNi.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d'avancement ou d'abandon en réduisant les faux négatifs lors du criblage des cibles, grâce à un débit plus élevé de vers et à une exposition uniforme.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles en générant des données phénotypiques fiables issues d'essais en culture liquide à grande échelle.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise dans la manipulation de C. elegans, les techniques d'interférence ARN et l'entretien de cultures liquides.
- Dépend d'incubateurs agitateurs, de flacons Fernbach et de microscopie pour le décompte des larves et l'évaluation phénotypique.
- Nécessite une standardisation interéquipes des protocoles de comptage des vers et de préparation des bactéries d'interférence ARN afin d'assurer la reproductibilité.
- Implique des considérations d'adaptation lors de l'extension de l'approche au-delà de daf-2 à d'autres gènes d'intérêt dans différents contextes génétiques.
- Comprend des limites pratiques telles que la surcroissance bactérienne potentielle et les contraintes de transfert d'oxygène dans les cultures liquides à haute densité.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026