JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 3:15 min • April 30th, 2023
- Pour commencer, ajoutez de la carbénicilline et un IPTG millimolaire pour contrôler et tester les flacons de culture contenant du milieu basal S. Faites tourner un tube contenant des larves au premier stade de croissance, également appelées larves L1, pendant quelques minutes. Retirez maintenant le surnageant et placez deux microlitres de L1 sur une plaque de gélose. Placez la plaque sous un microscope à dissection et comptez le nombre de larves.
Ajouter les bactéries ARNi porteuses d’un plasmide ARNi non spécifique dans le ballon témoin et les bactéries contenant l’ARNi ciblant le gène dans le ballon d’essai. La quantité de bactéries ajoutées doit être proportionnelle au nombre de vers.
Laissez les larves grandir en secouant continuellement pour assurer une bonne oxygénation. Les larves se nourrissent des bactéries. À l’intérieur de la larve, le petit ARN interférent se lie à l’ARNm complémentaire produit par le gène ciblé et inhibe l’expression des protéines. Enfin, examinez les vers pour le phénotype qui vous intéresse.
Dans l’exemple de protocole, nous allons traiter des larves L1 avec de l’ARNi ciblant le gène daf-2, en culture liquide.
- Pour commencer le traitement, ajoutez 207,45 millilitres de milieu basal S avec des réactifs supplémentaires comme décrit dans le protocole de texte ci-joint à une fiole de culture Fernbach de 2 800 millilitres. Ajouter une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre de carbénicilline et 1 millimolaire d’IPTG, et fermer le ballon à l’aide d’un bouchon à vis à membrane.
Sortez les L1 de l’incubateur à 25 degrés Celsius et transférez-les dans des tubes de 15 millilitres. Centrifugez les L1 à 1 900 fois g pendant trois minutes. Après l’essorage, retirez le surnageant. Au microscope, comptez les L1 par deux microlitres et faites la moyenne des nombres obtenus à partir d’au moins neuf gouttes.
Ensuite, ajoutez 50 000 vers pour la collection de jeunes vers et 100 000 vers pour la collection de vers âgés dans quatre flacons de culture Fernbach préparés à l’étape précédente. Ajoutez ensuite les bactéries ARNi de contrôle et les bactéries ARNi pour le gène d’intérêt proportionnellement au nombre de vers.
Après avoir ajouté des bactéries, complétez la culture de vers avec S basal pour porter le volume total à 300 millilitres. Incuber la culture de vers à 25 degrés Celsius dans un incubateur secouant à 150 tr/min jusqu’à la collecte.