0 vues • 3:10 min • April 30th, 2023
- Commencez par des œufs granulés isolés par des vers adultes gravides blanchissants. Assurez-vous que chaque étape de cette procédure est effectuée de manière stérile pour éviter la contamination des cellules cultivées. Mettez en suspension la pastille dans une solution de chitinase, une enzyme qui décompose la chitine, un gros polysaccharide qui est un composant structurel de la coquille de l’œuf.
Après une période de digestion appropriée, centrifugez doucement les œufs et remplacez le surnageant par un milieu de culture cellulaire pour arrêter la digestion. Ensuite, passez les embryons dans une aiguille de calibre 18 pour séparer mécaniquement les cellules individuelles. Ensuite, filtrez la solution pour éliminer les débris de la coquille de l’œuf ou des amas de cellules non séparés. Plaquez les cellules dans une boîte de culture sur une lamelle en verre recouverte d’agglutinine d’arachide - une lectine qui aide les cellules à se fixer à la lamelle en liant les glucides de surface cellulaire.
Dans l’exemple de protocole, nous préparerons des cellules embryonnaires pour la différenciation morphologique et l’analyse in vitro.
- Tout en travaillant sous une hotte à flux laminaire pour éviter d’introduire une contamination bactérienne, remettez les œufs granulés en suspension dans un millilitre de chitinase à raison de deux milligrammes par millilitre et transférez-les dans un tube conique frais de 15 millilitres. Secouez le tube pendant 10 à 30 minutes à température ambiante, selon la fraîcheur de l’enzyme. Lorsqu’environ 80 % des coquilles d’œufs sont digérées, centrifugez les œufs à 900 g pendant trois minutes.
Après avoir soigneusement retiré le surnageant, ajoutez trois millilitres de milieu L15. Transférez les œufs dans une assiette de six centimètres de diamètre et commencez la dissociation manuelle à l’aide d’une seringue stérile de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 18. Pour surveiller le degré de dissociation, placez une goutte de suspension dans une boîte de Pétri fraîche et observez-la au microscope. Continuez jusqu’à ce qu’environ 80 % des cellules soient dissociées.
Pour éliminer les amas de cellules, les œufs non digérés et les larves écloses, filtrez doucement la suspension à travers un filtre de cinq microns et faites passer quatre à cinq millilitres supplémentaires de milieu L15 à travers le filtre pour récupérer les cellules. Pour cultiver les cellules après centrifugation du filtrat à 900 g pendant trois minutes, remettre les cellules en suspension dans un milieu L15 complet. Plaquez une plaque d’un millilitre par puits et conservez les plaques dans une chambre humide et scellée à 20 degrés Celsius à l’air ambiant.