Test de la membrane basale de culture 3D : culture de cellules cancéreuses sur une matrice protéique de membrane basale 3D pour étudier l’invasion cellulaire

Tout d’abord, versez la matrice froide de la membrane sous-jacente dans un plat à fond de verre et étalez-la uniformément avec une pointe de pipette. Laissez la membrane se solidifier à 37 degrés Celsius, avec un apport continu de dioxyde de carbone. Trypsinisez les cellules cancéreuses marquées par fluorescence pour les détacher de la surface de la plaque et les remettre en suspension dans un milieu de culture.

Transférez ces cellules remises en suspension dans un tube conique et faites-les tourner. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu de culture. Après le comptage, mélangez cette suspension cellulaire contenant le nombre souhaité de cellules avec la matrice basale dans un rapport égal.

Déposer délicatement le mélange de matrice cellulaire sur le plat revêtu d’une matrice de membrane basale solidifiée. Laissez le mélange de matrice cellulaire se solidifier à 37 degrés Celsius, avec un apport continu de dioxyde de carbone. Une fois que le mélange se solidifie, ajoutez du milieu de culture dans le plat et incubez-le pendant la période souhaitée.

Les cellules cancéreuses peuvent former des protubérances membranaires riches en actine et libérer des protéases pour dégrader la matrice extracellulaire, envahissant ainsi la matrice. Placez la parabole sous un microscope fluorescent à différents intervalles de temps pour analyser les cellules formant des protubérances. Dans l’exemple de protocole, nous cultiverons des cellules cancéreuses du sein sur une matrice de membrane basale 3D pour étudier le processus d’invasion.

Avant de commencer la procédure de culture, placez la matrice de la membrane basale, une pipette P200 et les pointes de la pipette sur de la glace pendant la nuit, à 4 degrés Celsius. Le lendemain, utilisez l’extrémité de la pipette glacée de 200 microlitres pour étaler 50 microlitres de la matrice en spirale sur le fond d’un plat confocal numéro 1 à fond de verre. Placez ensuite la parabole dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius, avec 5 % de dioxyde de carbone, pendant au moins 30 minutes.

Pendant que la matrice subit une solidification, trypsinisez une plaque confluente de 70 à 80 % de cellules de 100 millimètres. Une fois que les cellules ont commencé à se détacher, inactivez la trypsine avec 10 millilitres de milieu, puis transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifugez les cellules pendant trois minutes à 100 G et 4 degrés Celsius. Pendant que les cellules tournent, aliquote 50 microlitres de matrice dans un tube de microcentrifugation de 1 millilitre par plat de matrice à membrane basale et placez les tubes sur de la glace. Lorsque les cellules ont fini de tourner, aspirez le surnageant sans perturber la pastille, puis remettez les cellules en suspension dans 1 millilitre de milieu et comptez-les.

Ensuite, transférez 2,5 fois 10 vers les 4èmes cellules dans un nouveau tube de microcentrifugation, en complétant la suspension cellulaire avec un fluide jusqu’à un volume final de 50 microlitres. Ajoutez ensuite les 50 microlitres de matrice de membrane basale glacée dans les cellules dans un rapport de 1:1, pour un volume final de 100 microlitres. Plaquez doucement le mélange matrice-cellule sur la matrice de membrane basale solidifiée et laissez les cellules s’incruster dans la matrice de l’incubateur de culture cellulaire.

Après 30 minutes, couvrez la matrice avec 2 millilitres de milieu et remettez le plat dans l’incubateur, en changeant le milieu tous les jours pendant la durée de l’expérience. Utilisez l’objectif 10x d’un microscope optique une fois par jour pendant toute la durée de l’expérience pour prendre 20 images de contraste interférentiel différentiel de la colonie suspendue dans la matrice de la membrane basale. Analysez les images à l’aveugle pour déterminer la formation des étoiles de la colonie cellulaire. Une colonie est considérée comme étoilée si une ou plusieurs projections du sphéroïde de cellules sont observées.