Culture de peau 3D organotypique : une technique de culture in vitro sur cassette pour régénérer l’épiderme humain sur derme acellulaire

- Les cultures de peau organotypiques aident à générer des tissus cutanés reconstruits avec des caractéristiques typiques de différenciation et de stratification de l’épiderme. Ils imitent l’architecture tissulaire fonctionnelle et physiologique in vivo.

Pour générer une peau organotypique, assemblez d’abord un derme prédécoupé, mort et désépidermisé sur une cassette personnalisée avec sa couche supérieure vers le haut. Ce derme forme le substrat pour aider à la régénération de la peau.

Retournez l’ensemble de la cassette pour exposer la couche inférieure du derme. Pipetez une matrice extracellulaire artificielle sur la couche inférieure. Permettez à la matrice de se solidifier et de fournir un soutien structurel au derme.

Retournez l’ensemble dans sa position initiale. Ajoutez le volume souhaité de milieu de croissance des kératinocytes pour immerger uniquement la couche inférieure du derme. Ajoutez une suspension de kératinocytes sur la couche supérieure du derme pour imiter l’architecture typique des tissus cutanés et incuber.

Pendant la culture, le milieu de croissance diffusant à travers le derme complète la prolifération des kératinocytes. De plus, la disposition de ces kératinocytes proliférants à l’interface air-liquide favorise leur différenciation. Le processus régénère un épiderme entièrement stratifié sur la couche dermique dévitalisée, produisant une reconstruction organotypique de la peau. Dans le protocole suivant, nous montrons la génération de peau organotypique humaine à l’aide de kératinocytes humains primaires génétiquement modifiés et de derme humain dévitalisé.

- Pour fabriquer des cassettes organotypiques, utilisez une catérisation pour retirer un carré de 1 centimètre sur 1 centimètre du centre du couvercle d’une boîte de culture tissulaire de 3,5 centimètres. Fixez des chevilles carrées au bas de la cassette à l’aide de vernis à ongles transparent et laissez le vernis sécher pendant 5 minutes.

Enfin, retournez la cassette et placez-la dans un plat de 6 centimètres avec une cassette reposant sur les chevilles. Récupérez le derme d’un stockage à 4 degrés Celsius et transférez-le dans un récipient de milieu de croissance de kératinocytes à laver.

Après avoir répété le lavage, placez le derme dans du KGM frais et incubez à 37 degrés Celsius pendant 2 jours. Après l’incubation, utilisez un scalpel pour couper le derme en morceaux de 1,5 centimètre sur 1,5 centimètre. Ensuite, placez-le sur le trou carré de la cassette organotypique avec le haut du derme vers le haut.

À l’aide d’une pince, retournez toute la cassette organotypique contenant le derme. Ajoutez cinq gouttes de matrice extracellulaire fraîchement décongelée au bas du derme et secouez légèrement pour assurer une répartition uniforme sur le derme. Après avoir laissé la matrice extracellulaire se solidifier pendant 5 minutes, utilisez une pince pour retourner la cassette, puis ajoutez 4 millilitres de KGM dans la boîte de 6 centimètres.

Ensuite, après avoir récolté et compté les kératinocytes génétiquement modifiés, mettez en suspension 0,5 à 1 million de cellules dans 90 microlitres de KGM et distribuez les cellules sur le derme. Incuber la co-culture à 37 degrés Celsius.

Changez de média sur les cultures tous les deux jours. La stratification complète et la différenciation de l’épiderme se produisent généralement après le 5e jour. Les tissus peuvent être récoltés jusqu’à 14 jours après le placage.

• Organotypic Skin Culture - A method of reconstructing skin tissue in vitro for research.
• Epidermis Sponge - A supportive structure used in creating organotypic skin cultures.
• Tissue Culture Human - The process of growing human cells in a controlled environment.
• Dermis Regeneration - The process of restoring damaged dermis tissues.
• Epidermal Pegs - Extensions of the epidermis that penetrate and connect with the underlying dermis.

• Introduce Organotypic Skin Culture – A technique that mimics in vivo skin tissue (e.g., organotypic skin culture).
• Key Concepts – Summarize principles of dermis regeneration and cell proliferation (e.g., dermis regeneration).
• Underlying Mechanisms – Recap the role of keratinocyte growth media and artificial extracellular matrix (e.g., extracellular matrix).
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• What is organotypic skin culture and how is it used in tissue culture human?
• What role does epidermis sponge play in organotypic culture?
• How does dermis regeneration occur in organotypic skin culture?

• Practical Applications – Organotypic Skin Culture models the skin's response to drugs, chemicals and cosmetic products (e.g., skincare).
• Industry Impact – Used in dermatological research and cosmetic industries (e.g., healthcare).
• Societal Importance – Can help develop treatments for skin diseases (e.g., dermatology).
• Link to Scientific Advancements – Leads to better understanding of skin biology and enabled advancements in skin tissue engineering.