Name: Dechorionation dembryons Medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Apprenez la déchorionation d'embryons de médaka et la transplantation cellulaire pour produire des chimères. Ces techniques permettent d'étudier l'autonomie des gènes en biologie du développement.

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1. Développement des embryons <ol><li> Quand ils sont pondus, les œufs sont regroupés en raison de filaments de fixation sur le chorion. Pour que les embryons se développent normalement, il est nécessaire de séparer les oeufs. Tangle et couper les filaments de fixation en maintenant les filaments de fixation avec deux pinces. </li><li> Après unclustering, les oeufs sont séparés de fèces et d'algues et transférées dans un milieu d'embryons frais à une densité maximum de 40 œufs par 6cm boîte de Petri. </li><li> Embryons de medaka développer un peu plus lent que le poisson-zèbre à 27 ° C. Le moment de l'éclosion est différente entre les deux espèces; embryons de medaka éclosion du chorion en 7 jours et immédiatement commencer à nager et manger, alors embryons de poisson zèbre éclosent au bout de 2 jours, mais commencent à nager et de manger dans les 5-6 jours. Développement de medaka est mis en scène selon la mise en scène Iwamatsu 4. </li><li> Le développement des embryons de medaka peuvent être facilement ajustés aux plans expérimentaux en sélectionnant letempérature. Développement des embryons de medaka peut être arrêté à 4 ° C en début de développement. Après l'étape 24, lorsque battements du cœur commence, le développement peut être ralenti en utilisant une température minimale de 18 ° C. </li><li> Le moment d'apparition des organes / tissus est légèrement différente dans medaka rapport avec le poisson zèbre, c'est à dire dans somitogenèse medaka survient après le début du développement du cerveau alors que dans le poisson-zèbre somitegenesis précède le développement du cerveau. </li></ol> 2. Retrait du chorion Le chorion de medaka compose de deux couches de protection à l'intérieur d'une couche dure et une surface extérieure souple. Ainsi, un traitement à la protéase en deux étapes en utilisant la pronase et enzyme d'éclosion est nécessaire de supprimer ce chorion. Une fois dechorionated, les embryons doivent être conservés en 1X BSS. Semi-stériles conditions permettra d'améliorer la culture d'embryons dechorionated succès, surtout lorsque les périodes d'observation plus longues sont nécessaires. Il s'agit notamment deen utilisant des solutions stériles (stérilisés par exemple 1X BSS avec des antibiotiques) et des outils stérilisés avec de l'éthanol 70% puis rinçage à l'1X BSS. Comme dechorionated embryons de medaka sont plus doux et plus fragiles que les embryons de poisson zèbre dechorionated, des précautions supplémentaires doivent être prises pour veiller à ce qu'ils n'entrent pas en contact de l'air ou de bulles dans la pipette, au risque de provoquer l'effondrement immédiat. Afin de garantir un minimum de dommages aux embryons, une pipette à large goulot de la chaleur en verre poli avec pompe à pipette doit être utilisée pour le transfert d'embryons et une boucle de cheveux doivent être utilisés pour orienter embryons pour l'observation. Non adhérentes boîtes de Petri doivent être utilisés pour prévenir les embryons de se fixer aux surfaces. <ol><li> Avant dechorionation il faut vérifier que les œufs ont été suffisamment séparés et nettoyés. </li><li> Étant donné que la pronase et des enzymes d'incubation sont protéinases, ils doivent être conservés sur de la glace et de minimiser l'exposition des embryons de ces enzymes. </li><li> Transfert des œufs à sandpapar (p2000 grain, imperméable à l'eau) placé dans le couvercle d'une boîte de Pétri 9cm. Retirer milieu en excès, mais d'assurer un volume suffisant demeure pour empêcher le dessèchement des embryons. </li><li> Roulez doucement embryons pendant environ 45-60 secondes pour enlever une partie des poils de surface extérieure et légèrement entailler la surface du chorion (Figure 1). Transfert d'embryons revenir à une boîte de Pétri d'origine et d'examiner. Lorsque vous roulez sur du papier de verre embryons utiliser l'index, en appliquant une pression minimale et le maintien doigt parallèlement à la surface du papier de verre. Ne pas rouler plus de 5-7 embryons à la fois. Cette précaution permettra de minimiser les risques d'écrasement embryons dessous de l'autre. </li><li> Remplacer milieu à l'œuf dans un plat avec de la pronase 20mg/ml et d'embryons incuber pendant 40-60 minutes à 27 ° C. Assurer embryons sont suffisamment couverts par la pronase et un couvercle est présent sur le plat. Pronase utilisé doit être conservé sur de la glace au cours de cette étape à mitienne pas compte d'auto-digestion et peut être réutilisé jusqu'à ce que l'activité est perdue (environ 1-2 semaines). </li><li> Récupérer pronase pour les embryons de réutilisation et de lavage 5X en milieu embryon pour éliminer les traces de pronase car cela inactiver l'enzyme d'éclosion à ajouter. </li><li> Retirer moyen d'embryons et d'embryons de couverture avec l'enzyme d'éclosion, les embryons assurant siéger en tant que monocouche dans le plat. Si les œufs s'asseoir sur le dessus les uns des autres dans le plat, ceux d'en bas seront écrasés comme le chorion se dissout. Gardez enzyme d'éclosion utilisé sur la glace. </li><li> Incuber les embryons à 27 ° C et après 15 minutes de vérifier périodiquement l'état d'avancement de l'éclosion à l'aide d'un stéréomicroscope. On verra qu'un certain nombre de cratère lunaire-comme les trous commencent à apparaître dans la couche interne du chorion, qui se dissout rapidement suite à cette sortie de la couche externe souple du chorion facilement enlevé manually. L'ensemble du processus d'éclosion peut prendre 15-60 minutes. </li><li> Dès que les embryons sortent du chorion, transférer des embryons à une boîte de Pétri contenant 1X BSS. Assurez-vous de ne pas transférer enzyme d'éclosion au BSS 1X en touchant la pointe de la pipette sur la surface de la BSS permettant aux embryons à rouler doucement sur. </li><li> Une fois que tous les embryons sont transférés à partir enzyme d'éclosion, faire un transfert définitif vers un autre plat frais de 1X BSS. Cela garantit embryons ne sont pas exposés à des restes de l'enzyme d'éclosion, car cela pourrait endommager les embryons exposés. Une fois dans ce plat final des embryons encore qui possèdent la couche externe du chorion peut être libéré manuellement à l'aide de micro-pinces stérilisées sous la loupe binoculaire. Si les embryons doivent être développées dechorionation suivante, pénicilline / streptomycine doit être ajouté àle BSS à empêcher la croissance bactérienne. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Comparaison des embryons laminés et déroulé pendant dechorionation. Observez comment les embryons laminés dans le groupe B n'ont pas les poils visibles sur les embryons déroulé dans le panneau A. 3. Montage embryons dechorionated Intégration d'agarose est utile pour des périodes plus longues de l'imagerie (par exemple, imagerie time-lapse) pour les embryons vivants ainsi que pour les observations détaillées des embryons fixes. Au cours de la gastrulation et organogenèse précoce (stade 14 au stade 28), les embryons de medaka présentent des vagues de mouvements rythmiques contractiles à travers le périderme, une couche de tissu qui recouvre à la fois le développement de l'embryon et le jaune 5. Les embryons sont traités avec 3,5 mm 1-heptanol pour arrêter les mouvements contractiles 6. Pour arrêter le mouvement d'embryons après stage 28 (64hpf), les embryons sont anesthésiés en ajoutant des gouttes de tricaïne mésilate (TMS) avant enrobage. TMS est également ajouté à la gélose (ajouter seulement une quantité minimale, cette dose doit être optimisé, environ une dilution 1:25). <ol><li> Décongeler une petite quantité de 3% d'agarose à basse température de gélification (en 1X BSS) en chauffant à 37 ° C et maintenir à cette température. </li><li> Les étapes suivantes doivent être réalisées rapidement afin que l'agarose ne pas se solidifier avant d'orienter l'embryon. On utilise un support de verre à large ouverture pipette agarose fondu suffisamment pour remplir la dépression bouchon d'un tube Eppendorf. </li><li> Transfert d'un embryon dechorionated à la dépression bouchon en minimisant transportant plus de BSS avec l'embryon. Immédiatement absorption de l'agarose et de l'embryon de la dépression bouchon et le transfert vers une chambre de Petri boîte de culture. Un plat de 3.5cm de Pétri avec une fenêtre en verre au fond est utilisé. Pour l'imagerie à l'aide d'un microscope inversé,embryons sont face vers le bas et orientée vers le corps placé tout près de la vitre de protection. Pour l'imagerie à l'aide d'un microscope droit, l'épaisseur de l'agarose est minimisée. </li><li> Placer la capsule 3.5cm de Petri dans un plat de diamètre 14cm de glace de Petri contenant et l'eau (eau rempli à environ 1/3 profondeur totale de grand plat). Tout en maintenant la chambre fermement sur le fond de la boîte de Petri 14 cm, utiliser une boucle de cheveux pour orienter doucement l'embryon tel que souhaité dans le agarose fondu et maintenir l'embryon jusqu'à l'agarose se solidifie par un léger soulèvement et d'abaissement de la petite cuvette dans sa position initiale dans l'eau glacée. </li></ol> 4. La transplantation de cellules dans des embryons de medaka Le but de cette procédure est de déterminer si le gène d'intérêt agit cellule autonome (dans une cellule) ou non cellulaire autonome (entre les cellules). Les cellules donneuses peuvent être marqués avec un colorant traceur tel que la rhodamine-dextran avant transplantation (tel que décrit dans «La micro-injection d'embryons Medaka« le protocole d'accompagnement JoVE) ou une souche transgénique avec une expression de GFP peut être utilisé, permettant une évaluation de transplantation. Une combinaison des deux techniques de marquage est souvent utile pour surmonter l'auto-fluorescence qui peuvent être rencontrées. Pour time-lapse études après la transplantation, expression de la GFP est particulièrement utile. Utiliser une pipette en verre à large ouverture avec pompe à pipette long de cette procédure et stériliser tous les outils (y compris les diapositives) au préalable avec EtOH à 70%, suivi par un rinçage soigneux avec 1X stérile BSS. Embryons receveurs sont généralement développés autour de la 12e étape car cela permet la discrimination des pôles ventrales et dorsales lors de la réalisation de transplantation. <ol><li> Commencer dechorionating embryons 1,5 heure avant la transplantation et dispositif d'injection de configuration au cours d'incubations enzymatiques. </li><li> Placez une lame de microscope cavité dans une boîte de Pétri de diamètre 9cm. </li> Ajouter une petite quantité de méthylcellulose 3% vers le centre de la diapositive cavité à l'aide d'une pipette stérile et éparpillé. <li> Méthylcellulose à sec pendant environ 1-2 minutes. </li><li> Ajouter 350μl de 1X stérile BSS pour combler la dépression diaporama. </li><li> Transfert d'un embryon donneur et un maximum de quatre embryons receveurs de la lame à l'aide d'une pipette en verre. </li><li> Orienter les embryons en utilisant une boucle des cheveux de sorte que le blastoderme de l'embryon est orienté vers le haut. Les embryons peuvent être appuyé contre l'autre pour augmenter la stabilité ultérieure. </li><li> Insérez délicatement l'aiguille en micro-blastoderme donateurs et lentement absorption 10-20 cellules. </li><li> Insérez doucement l'aiguille dans la zone requise du blastoderme embryon receveur et d'expulser les cellules lentement. Un grand soin doit être pris lors de l'insertion dans les cellules du blastoderme destinataire afin de ne pas perturber la cellule vitelline frontière car cela peut entraîner la mort de l'embryo. </li><li> Verser stérilisés 1X BSS dans la boîte de Pétri. Versez délicatement le SRS dans le plat le plus près possible du côté du plat que possible afin de ne pas perturber les embryons. Ne versez jamais le BSS directement sur les embryons et ajouter suffisamment BSS tels que le coulisseau et embryons sont immergés. </li><li> Ajouter 100 pi de pénicilline / streptomycine dans le plat et le couvercle. Transférer délicatement plat dans un incubateur à 27 ° C pour permettre un développement normal. </li><li> Les embryons peuvent être observés régulièrement comme vous le souhaitez. Lorsque vous utilisez la transplantation d'effectuer gain-de-fonction et / ou expériences de sauvetage phénotype, certains changements morphologiques observés pourraient être dus à des effets de la transplantation. Ainsi transplantations multiples sont nécessaires. Après 2-3 jours, mélanophores doivent être présents sur le sac vitellin, la tête, les yeux et le tronc. Si elle est présente sur les embryons transplantés alors un succès chimère a probablement été produite (figure 3). </li></ol><pclass si n l donneur de g par le transfert la pcr tube contenant pi prot k. incuber c pendant heures suivies minutes et transporter pcr.> 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Exemple de position figure 2. D'un embryon d'agarose-embedded. Antérieur est illustré à droite et la vue est dorsale. Groupe B: les cellules endothéliales peut être vu des deux côtés du corps embryonnaire et sont étiquetés en utilisant la GFP dirigée par le promoteur fli. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Images de post-transplantation d'embryons. Une image montre un donneur et receveur embryon immédiatement après la transplantation. L'embryon donneur est indiquée sur la droite avec un blastoderme complètement rouge (flèche). L'embryon receveur est indiqué sur ee à gauche et est facilement identifié par la petite masse de cellules transplantées rouges visibles dans le blastoderme (tête de flèche). B L'image montre deux embryons receveurs d'environ 7 heures après la transplantation (incubé à 27 ° C). Notez que les cellules transplantées ont migré à partir du site de la transplantation et sont aujourd'hui dispersés à travers le blastoderme (flèches). Image C montre un embryon receveur à st.29 (environ 74hpf). Notez la pigmentation dans les yeux et la présence de mélanophores dans le coffre et la région du cerveau (flèches). Les cellules marquées à la rhodamine peut être vu à coloniser de nombreuses structures embryonnaires indiquant le succès de la production d'une chimère. </pclass>

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons comment dechorionate et effectuer transplanataion cellules sur des embryons de medaka. Il s&#39;agit d&#39;une technique puissante pour produire des embryons chimériques pour l&#39;étude du gène / protéine de fonction au cours du développement, ainsi que pour élucider l&#39;autonomie du gène / protéine en question. Medaka constituent un système modèle vertébré utiles pour cette technique en raison de cartes sort bien établies et leur transparence, leur bien prêt à in vivo imagerie en temps réel. La transplantation peut être combiné avec micro-injection (tel que décrit dans «micro-injection d&#39;embryons Medaka« le protocole d&#39;accompagnement JoVE) de sorte que le comportement des cellules transplantées peuvent être facilement observés.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Moyen d&#39;embryons </td><td> Réactif </td><td> Fait maison </td><td> N / A </td><td> Solution 200ml bouillon 50X, 1 ml 1 methyleneblue% dans H 2 O/10 eau osmosée litre (solution mère 50X: 14.7g NaCl, KCl 0,6 g, CaCl 2, 2H 2 O 2,4 g, MgSO 4 7H 2 O 4.0g / 1 litre RO de l&#39;eau.) </td></tr><tr><td> Micro-pince à disséquer </td><td> Outils </td><td> 55 INOX A.DUMONT &amp; FILS </td><td> N / A </td><td> Très forte pointes fines pour l&#39;enlèvement du chorion. </td></tr><tr><td> Papier de verre fin imperméable à l&#39;eau - p2000 grain </td><td> Outils </td><td> Hermes Abrasives Ltd </td><td> N / A </td><td> Très fine granulométrie fou roulant / nettoyage embryons avec chorions. </td></tr><tr><td> Méthylcellulose 3% </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> M 0512 </td><td> Haute viscosité pour la tenue des embryons en place lors de la transplantation. </td></tr><tr><td> 1X BSS </td><td> Réactif </td><td> Fait maison </td><td> N / A </td><td> 20XBSS: 130g de NaCl, KCl 8g, 4g MgSO 4 .7 H 2 O, 4g CaCl 2 .2 H 2 O, 10 mg et rouge de phénol dans 1L d&#39;eau MilliQ et autoclave; Hepes 500mm dans de l&#39;eau MilliQ autoclave. Ajouter 20XBSS 25ml et 15ml 500ml Hepes pH 7,0, remplir jusqu&#39;à 500 ml et stériliser par filtration avant de l&#39;utiliser. </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Réactif </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td> Ajouté à BSS lors de l&#39;incubation des embryons dechorionated. </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Réactif </td><td> Calbiochem </td><td> 53702 </td><td> Pour dechorionation. </td></tr><tr><td> Enzyme d&#39;éclosion </td><td> Réactif </td><td> Fait maison </td><td> N / A </td><td> Pour dechorionation. </td></tr><tr><td> Tricaïne messageilate (TMS) </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td> 400mg tricaïne dans l&#39;eau distillée 97.9ml et 2.1ml 1M Tris, pH ajusté à 7, 4,2 ml de cette solution dans l&#39;eau du réservoir 100ml propre. </td></tr><tr><td> 3% Température de gélification ultra-faible. agarose </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> A-2576 </td><td> Type IX-A. Utilisé lors de l&#39;enrobage des embryons à des fins d&#39;observation. </td></tr><tr><td> Chambre de Petri boîte de culture </td><td> Outil </td><td> Iwaki, Asahi Glass Corp Techno </td><td> 11-004-008 </td><td> Iwaki verre plat de base 35mm 12mm avec fenêtre. Utilisé lors de l&#39;enrobage des embryons à des fins d&#39;observation. </td></tr><tr><td> Micromanipulateur </td><td> Équipement </td><td> Narishige </td><td> N / A </td><td> Modèle MN151. Pour le retrait et l&#39;insertion de cellules lors d&#39;une transplantation. </td></tr><tr><td> Verre borosilicate capillaires </td><td> Outil </td><td> Harvard Apparatus </td><td> GC100-10T </td><td> Pour faire des aiguilles de transplantation. </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipette extracteur </td><td> Équipement </td> &lt;td&gt; Sutter Instrument Co. </td><td> Modèle P-97 </td><td> Pour faire des aiguilles de transplantation. </td></tr></tbody></table></div>

dechorionation d&#39;embryons medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka est un petit poisson d&#39;eau douce de ponte qui permet des analyses génétiques et embryologiques et est l&#39;un des trois organismes modèles vertébrés dans lequel l&#39;ensemble du génome phénotype axées sur les écrans mutantes ont été effectuées 1. Divergence de chevauchement fonctionnel de gènes liés entre medaka et poisson-zèbre permet l&#39;identification de nouveaux phénotypes qui sont identifiables dans une seule espèce 2, ainsi medaka et poisson zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique des génomes de vertébrés fonctions. La manipulation des embryons de medaka, comme dechorionation, les embryons de montage pour l&#39;imagerie et la transplantation de cellules, sont les principales procédures de travailler à la fois sur le medaka et poisson-zèbre dans un laboratoire. La transplantation de cellules examine l&#39;autonomie cellule de mutations medaka. Les chimères sont générés par la transplantation de cellules marquées à partir d&#39;embryons donateurs dans des embryons receveurs non étiquetés. Les cellules donneuses peuvent être transplantés à des domaines spécifiques des embryons receveurs basées sur le sort cartes 3 </sup&gt; de sorte que des clones de cellules transplantées peuvent être intégrées dans le tissu d&#39;intérêt au cours du développement. En raison de la chorion dur et d&#39;embryons non alcoolisées, la manipulation d&#39;embryons de medaka est plus compliqué que chez le poisson zèbre. Dans cette vidéo, nous montrons les procédures détaillées de manipulation des embryons de medaka.

En raison de la chorion dur et d&#39;embryons non alcoolisées, la manipulation d&#39;embryons de medaka est plus compliqué que chez le poisson zèbre. Cette vidéo montre étape par étape, les procédures pour la manipulation des embryons de medaka, y compris dechorionation, montage d&#39;agarose pour l&#39;imagerie et la transplantation de cellules pour la production de chimères. Ces procédures sont essentielles à utiliser le medaka et poisson-zèbre dans un laboratoire de tirer pleinement parti de leur complémentarité pour la dissection génétique des fonctions du génome des vertébrés.

Dechorionation d&#39;embryons Medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères

Le Medaka est un petit poisson d'eau douce ovipare qui permet des analyses génétiques et embryologiques, et constitue l'un des trois organismes modèles vertébrés en ...

L'objectif général de cette procédure est de produire des clones dans un embryon afin d'examiner l'autonomie d'un gène ou d'une protéine d'intérêt. Cela est réalisé en marquant les embryons donneurs avec du dextran Rod Domine par microinjection au stade une cellule, comme illustré dans la vidéo associée à celle-ci, la microinjection d'embryons Maka. La deuxième étape de la procédure consiste à développer les embryons donneurs et receveurs jusqu'au stade approprié.La troisième étape de la procédure consiste à enrober les embryons du donneur et du receveur. La dernière étape de la procédure est de transplanter des cellules des embryons du donneur marqués vers les embryons du receveur. En fin de compte, les résultats peuvent être obtenus en analysant la distribution, la prolifération et la différenciation des clones de cellules transplantées en détectant ces cellules par leur fluorescence ou par des traceurs de lignage.Bonjour, je suis Sean Brazinski du laboratoire du Dr Makoto Fki, du département de biologie et de biochimie de l'Université de Bath. Je fais également partie du laboratoire Zeki. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de transplantation cellulaire chez des embryons de poisson sombre.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier si un gène ou une mutation d'intérêt a une fonction autonome ou non autonome au niveau cellulaire. Commençons donc. Lors du revêtement des œufs maka, utilisez des solutions et des outils stériles pour améliorer la réussite de l'observation et de la culture à long terme.Placez un morceau de papier abrasif étanche de grain P 2000 dans le couvercle d'une boîte de Pétri non adhérente de neuf centimètres de diamètre. Utilisez une pipette à pâte à embout large et poli au chalumeau pour transférer jusqu'à 10 œufs fraîchement désagrégés, nettoyés et étiquetés depuis une boîte contenant des œufs en milieu jusqu'au papier abrasif.Retirer l'excès de milieu, en laissant juste assez dans la boîte pour éviter que les œufs ne s'assèchent. À l’aide du doigt ganté, faire rouler doucement 10 œufs à la fois sur du papier de verre pendant 45 à 60 secondes. Pour éliminer les poils de la surface externe et rayer la surface en Corian, appliquer une pression minimale et maintenir le doigt parallèle au papier de verre.Transférez les œufs dans la boîte de Pétri contenant le milieu d'origine. Éliminez le milieu, recouvrez les œufs d'une solution de 20 milligrammes par millilitre de pronase. Couvrez la boîte et incubez à 27 degrés Celsius pendant 60 minutes.S'assurer de placer la boîte à un angle tel que les embryons soient suffisamment immergés dans l'enzyme. Afin de minimiser la quantité d'enzyme nécessaire, utiliser une pipette plastique de transfert pour récupérer la pronase en vue de sa réutilisation, puis la placer sur de la glace. Laver les œufs cinq fois dans un milieu pour embryons afin d'éliminer toute trace de pronase susceptible de digérer l'enzyme d'éclosion.Ajouter suffisamment d’enzyme d’éclosion pour recouvrir les œufs lavés. Veiller à ce que les œufs restent en une seule couche au fond de la boîte afin d’éviter qu’ils soient écrasés lorsque le Corian se dissout. Incuber les œufs à 27 degrés Celsius.S'assurer de placer la boîte à un angle tel que les embryons soient suffisamment immergés dans l'enzyme. Afin de minimiser la quantité d'enzyme nécessaire, vérifier l'avancement sous un microscope stéréoscopique de dissection : des trous similaires apparaîtront dans la couche interne du Corian avant qu'elle ne se dissolve complètement. Le processus peut prendre jusqu'à 60 minutes selon l'activité de l'enzyme.Lorsqu'une petite partie du chorion est dissoute, aspirez immédiatement l'œuf individuel à l'aide d'une pipette afin d'éviter la digestion de l'embryon par l'enzyme d'éclosion. Transférez-le dans une boîte propre contenant du BSS à une fois en posant doucement la pointe de la pipette sur une boîte propre contenant du BSS à une fois, et en laissant l'œuf rouler pour minimiser le transfert de l'enzyme d'éclosion. Utilisez une pince pour retirer le reste du chorion une fois que tous les œufs ont été transférés hors de l'enzyme d'éclosion.Effectuez un transfert final vers une nouvelle boîte contenant du BBSS une fois. Ajoutez des antibiotiques si les embryons doivent être maintenus jusqu'à un stade ultérieur du développement embryonnaire. Après la préparation pour cette procédure, commencez le décapage des embryons au stade 12, 1,5 heure avant la transplantation. Utilisez une pipette pour ajouter une petite quantité de méthylcellulose à 3 % au centre d'une cavité du microscope.Glissez dans une boîte de Pétri de neuf centimètres de diamètre. Étalez le liquide finement sur la surface de la dépression. Laissez sécher la méthylcellulose pendant deux minutes.Remplir la dépression de la lame avec 350 microlitres de BSS stérile à une fois sous un microscope stéréo. Utiliser une pipette en verre à embout élargi et poli à la flamme pour transférer un embryon donneur et jusqu’à quatre embryons receveurs sur la lame. Utiliser une boucle en cheveu pour orienter les embryons de manière à ce que le derme blaster soit dirigé vers le haut.Inclinez les embryons les uns contre les autres pour assurer leur stabilité, si nécessaire. Insérez délicatement une micropipette dans le blaster.Derm du donneur. Aspirez lentement 10 à 20 cellules.Insérez maintenant délicatement l'aiguille dans la zone appropriée de l'ectoderme de l'embryon receveur et expulsez lentement les cellules donneuses. N'altérez pas la limite du sac vitellin. Remplissez soigneusement la boîte de Pétri avec environ 30 millilitres de BSS stérile à une concentration d'une fois pour immerger les embryons et les détacher du méthylcellulose.Appuyer contre la paroi de la boîte afin de ne pas perturber les embryons. Ajouter 100 microlitres de pénicilline-streptomycine dans la boîte pour une concentration approximative de 0,3 %. Couvrir la boîte. Observer les embryons périodiquement selon les besoins.Pour des études d'imagerie prolongées, telles que les prises de vue en accéléré et les observations détaillées, inclure des embryons vivants enrobés dans de l'agarose et anesthésier les embryons vivants afin d'en empêcher les mouvements en ajoutant un anesthésique adapté au stade dans le milieu contenant les embryons. Faire fondre environ un millilitre d'agarose à 3 % à point de fusion bas dans du BSS une fois et maintenir à 37 degrés Celsius. Si nécessaire, ajouter une quantité appropriée d'anesthésique à l'agarose pour éviter les tressautements. Travailler rapidement pour éviter la solidification et utiliser une pipette Pasteur à large embout pour remplir la cupule d'un tube de microcentrifugation avec de l'agarose.Utilisez une pipette à embout large pour transférer un embryon enduit et anesthésié dans l'aros du capuchon. Transférez le moins de milieu possible avec l'embryon. Mettez immédiatement à jour l'aros et l'embryon, puis déplacez-les dans une boîte de Pétri en verre de 3,5 centimètres de diamètre à fond en verre.Transférez la boîte dans une boîte de 14 centimètres remplie au tiers d'un mélange de glace et d'eau. Maintenez fermement la plus petite boîte au fond de la plus grande sous un microscope stéréo de dissection. Utilisez une boucle en cheveu pour orienter rapidement l'embryon comme souhaité.Immobilisez l'embryon jusqu'à ce que l'agarose durcisse. L'embryon peut désormais être observé. L'image A montre un embryon donneur et un embryon receveur immédiatement après la transplantation.L'embryon donneur est représenté à droite, avec un derme de plâtre entièrement marqué en rouge. L'embryon receveur est représenté à gauche et est facilement identifiable par la petite masse de cellules transplantées rouges visible sur l'image du derme blastique. L'illustration B montre deux embryons receveurs environ sept heures après la transplantation. On observe que les cellules transplantées ont migré depuis le site de transplantation et sont désormais dispersées à travers le blastoderme.L'image cutanée C montre un embryon receveur au stade 29. Notez la pigmentation de l'œil et la présence de mefor dans la région du tronc et du cerveau. Les cellules marquées du domaine en forme de bâtonnet peuvent être observées en train de coloniser de nombreuses structures embryonnaires, indiquant ainsi la production réussie d'une chimère.Nous venons de vous montrer comment incuber des embryons de poisson méca et réaliser une greffe cellulaire à un stade embryonnaire précoce. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous souvenir de transplanter vos cellules donneuses dans la zone correcte du blastoderme du receveur. Cela permettra à vos cellules donneuses de se différencier en le type cellulaire approprié.Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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