Dechorionation d'embryons Medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères

En raison de la chorion dur et d'embryons non alcoolisées, la manipulation d'embryons de medaka est plus compliqué que chez le poisson zèbre. Cette vidéo montre étape par étape, les procédures pour la manipulation des embryons de medaka, y compris dechorionation, montage d'agarose pour l'imagerie et la transplantation de cellules pour la production de chimères. Ces procédures sont essentielles à utiliser le medaka et poisson-zèbre dans un laboratoire de tirer pleinement parti de leur complémentarité pour la dissection génétique des fonctions du génome des vertébrés.

L’objectif global de cette procédure est de produire des clones dans un embryon dans le but d’examiner l’autonomie d’un gène ou d’une protéine d’intérêt. Ceci est accompli en marquant les embryons de donneurs avec du dextran Rod Domine par micro-injection au stade d’une cellule, comme le montre le compagnon de cette vidéo, micro-injection d’embryons de Maka. La deuxième étape de la procédure consiste à développer les embryons du donneur et du receveur jusqu’au bon stade.

La troisième étape de la procédure consiste à enrober les embryons du donneur et du receveur. La dernière étape de la procédure consiste à transplanter des cellules des embryons de donneurs marqués dans les embryons du receveur. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus en analysant la distribution, la prolifération et la différenciation des clones, des cellules transplantées en détectant les cellules transplantées par leurs traceurs de fluorescence ou de lignage.

Bonjour, je suis Sean Brazinski du laboratoire du Dr Makoto Fki au Département de biologie et de biochimie de l’Université de Bath. Je suis aussi du laboratoire Zeki. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de transplantation cellulaire dans les embryons de poisson noir.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier avec un gène ou une mutation d’intérêt, a une fonction autonome cellulaire ou non cellulaire. Alors commençons. Lors de l’enrobage des œufs de maka, utilisez des solutions et des outils stériles pour améliorer le succès de l’observation et de la culture à long terme.

Placez un morceau de papier de verre imperméable de grain P 2000 dans le couvercle d’une boîte de Pétri non adhérente de neuf centimètres. Utilisez une goulot large pour tirer une pipette à pâtes polie pour transférer jusqu’à 10 œufs fraîchement dégroupés, nettoyés et étiquetés d’un plat d’œufs. Moyen au papier de verre.

Retirez l’excès de moyen, en laissant juste assez dans le plat pour empêcher les œufs de se dessécher. À l’aide d’un doigt ganté, roulez doucement 10 œufs à la fois sur le papier de verre pendant 45 à 60 secondes. Pour enlever les poils de la surface externe et marquer la surface du Corian, appliquez une pression minimale et gardez le bout du doigt parallèle au papier de verre.

Transférer les œufs dans le plat d’origine de moyen. Retirez le milieu, couvrez les œufs d’une solution de 20 milligrammes par millilitre de couché. Couvrez le plat et laissez incuber à 27 degrés Celsius pendant 60 minutes.

Assurez-vous de placer la boîte à un angle afin que les embryons soient suffisamment immergés dans l’enzyme. Afin de minimiser l’enzyme requise, utilisez une pipette de transfert en plastique pour récupérer la pronase afin de la réutiliser et placez-la sur de la glace. Lavez les œufs cinq fois dans un milieu embryonnaire pour éliminer toute trace de pronation afin de l’empêcher de digérer l’enzyme d’éclosion.

Ajoutez suffisamment d’enzyme d’éclosion pour couvrir les œufs lavés. Assurez-vous que les œufs restent en une seule couche au fond du plat pour éviter de les écraser lorsque le Corian se dissout. Incuber les œufs à 27 degrés Celsius.

Assurez-vous de placer la boîte à un angle afin que les embryons soient suffisamment immergés dans l’enzyme. Afin de minimiser la progression de la vérification des enzymes requises sous un stéréomicroscope à dissection, créez des trous similaires qui apparaîtront dans la couche interne du Corian avant qu’il ne se dissolve complètement. Le processus peut prendre jusqu’à 60 minutes en fonction de l’activité enzymatique.

Lorsqu’une petite partie du Corian est dissoute, aspirez immédiatement l’œuf individuel à l’aide d’une pipette pour éviter la digestion de l’embryon par l’enzyme d’éclosion. Transférez dans une boîte propre d’une fois BSS en touchant doucement l’extrémité de la pipette sur une boîte propre une fois BSS et en laissant l’œuf rouler pour minimiser le transfert de l’enzyme d’éclosion. Utilisez une pince pour retirer le reste du Corian lorsque tous les œufs ont été transférés de l’enzyme d’éclosion.

Effectuez un transfert final dans un nouveau plat d’une fois BBSS. Ajoutez des antibiotiques si les embryons doivent être amenés à un stade ultérieur du développement embryonnaire Après la décoration pour cette procédure, commencez le stade de revêtement 12 embryons 1,5 heures avant la transplantation. À l’aide d’une pointe de pipette, ajoutez une petite quantité de méthylcellulose à 3 % au centre d’un microscope à cavité.

Glissez-le dans une boîte de Pétri de neuf centimètres. Étalez le liquide finement sur la surface de la dépression. Faites sécher la méthylcellulose pendant deux minutes.

Remplissez la dépression de la lame avec 350 microlitres de BSS stérile une fois sous un microscope à dissection. À l’aide d’une pipette en verre poli au feu à large ouverture, vous pouvez transférer un donneur et jusqu’à quatre embryons receveurs sur la lame. Utilisez une boucle pour cheveux pour orienter les embryons de manière à ce que le derme blaster soit tourné vers le haut.

Appuyez les embryons les uns contre les autres pour plus de stabilité si nécessaire. Insérez délicatement une micro-aiguille dans le blaster donneur. Derme. Absorbez lentement 10 à 20 cellules.

Maintenant, insérez doucement l’aiguille dans la zone pertinente de l’embryon receveur, expulsez lentement les cellules du donneur. Ne dérangez pas la limite du sac de violoncelle. Remplissez soigneusement la boîte de Pétri avec environ 30 millilitres de BSS stérile une fois pour immerger les embryons et détacher les embryons de la méthylcellulose.

Verser contre le côté du plat pour ne pas perturber les embryons. Ajoutez 100 microlitres de pénicilline streptomycine dans le plat pour une concentration approximative de 0,3 %Couvrez le plat. Observez les embryons périodiquement si nécessaire.

Pour des études d’imagerie plus longues telles que le time-lapse et les observations détaillées, incorporez des embryons vivants enrobés dans des aros anesthésiez les embryons vivants pour empêcher le mouvement en ajoutant un anesthésique approprié au stade approprié au milieu contenant les embryons fondre environ un millilitre de 3 % Le point de fusion bas s’est produit en une fois BSS et maintenez-le à 37 degrés Celsius. Si nécessaire, ajoutez une quantité appropriée d’anesthésique à l’aros pour éviter les contractions en travaillant rapidement pour empêcher la solidification, utilisez une pipette à pâtes à large bouche pour remplir le bouchon. Dépression d’un micro tube de centrifugation avec aros.

À l’aide d’une pipette à large bouche, un embryon enrobé et anesthésié est placé dans l’air du capuchon. Transférez le moins de milieu possible avec l’embryon. Mettez immédiatement à jour l’aros et l’embryon et déplacez-les dans une boîte de Pétri à fond de verre de 3,5 centimètres.

Transférez le plat dans un plat de 14 centimètres rempli au tiers d’un mélange de glace et d’eau. Tenez fermement la plus petite parabole au fond de la plus grande parabole sous un stéréomicroscope à dissection. Utilisez une boucle de cheveux pour orienter rapidement l’embryon comme vous le souhaitez.

Maintenez l’embryon immobile jusqu’à ce que l’agro se solidifie. L’embryon peut maintenant être imagé. L’image A montre un embryon de donneur et de receveur immédiatement après la transplantation.

L’embryon de donneur est représenté à droite avec un derme en plâtre étiqueté complètement rouge. L’embryon receveur est montré à gauche et est facilement identifié par la petite masse de cellules rouges transplantées visibles dans le blaster derm. L’image B montre deux embryons receveurs environ sept heures après la transplantation. Remarquez que les cellules transplantées ont migré du site de transplantation et sont maintenant dispersées dans le blaster.

L’image dermique C montre l’embryon d’un receveur au stade 29. Notez la pigmentation dans l’œil et la présence de mefor dans la région du tronc et du cerveau. On peut voir que les cellules marquées par bâtonnet domine colonisent de nombreuses structures embryonnaires, ce qui indique la production réussie d’une chimère.

Nous venons de vous montrer comment manger des embryons de poisson méca et effectuer une transplantation cellulaire à un stade embryonnaire précoce. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de transplanter vos cellules de donneur dans la bonne zone du receveur. Cela permettra à vos cellules de donneur de se différencier en le bon type de cellule.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.