Intégration génique ciblée médiée par TALEN : utilisation de nucléases spécifiques à une séquence modifiée pour l’insertion précise d’un gène de protéine fluorescente dans des hiPSC

Commencer par une suspension de cellules souches pluripotentes induites humaines ou hiPSC dans des milieux. Ajoutez une paire de nucléases effectrices de type activateur de transcription ou de plasmides codant pour TALEN. Compléter avec un plasmide donneur portant un gène de protéine fluorescente, couplé à un gène de résistance aux antibiotiques, avec des bras d’homologie adjacents pour un alignement spécifique sur les loci cibles.

Électroporez le mélange pour générer des pores transitoires dans les membranes cellulaires, permettant l’internalisation du plasmide. Une fois à l’intérieur des cellules, les plasmides codant pour TALEN sont traités, produisant des TALEN - des protéines chimériques composées d’un domaine de liaison à l’ADN TALE spécifique au site fusionné à un domaine de clivage d’endonucléase de restriction FokI non spécifique.

Chaque monomère TALEN, via son domaine de liaison à l’ADN - comprenant des modules de répétition d’acides aminés en tandem - reconnaît et se lie à des loci cibles, un module par nucléotide, sur chaque brin d’ADN dans des orientations opposées, séparés par une séquence d’espacement. Les domaines FokI se dimérisent et clivent ensuite l’ADN dans la séquence d’espacement, créant des cassures double brin avec des surplombs.

En présence d’un plasmide donneur contenant des bras d’homologie complémentaires aux régions flanquant le site clivé, la réparation dirigée par l’homologie se produit en utilisant la séquence homologue comme matrice pour la synthèse de réparation de l’ADN afin de combler les cassures double brin. Après la ligature des entailles, la protéine fluorescente intermédiaire et les gènes de résistance aux antibiotiques sont intégrés dans le génome de l’hôte.

Traitez les hiPSC, ensemences sur une couche de cellules nourricières pour favoriser la croissance, avec un milieu contenant des antibiotiques. Le gène de résistance aux antibiotiques sans promoteur - piloté par un promoteur endogène en amont - facilite la sélection des cellules modifiées par TALEN.