Transgenèse du poisson-zèbre par transposon Tol2 : une procédure pour générer un poisson-zèbre transgénique suite à la co-injection du système Tol2 dans des embryons de poisson-zèbre fécondés

Commencez avec des embryons viables de poisson-zèbre au stade unicellulaire placés dans les puits d’un moule de micro-injection.

Chargez une aiguille de micro-injection avec une solution contenant de l’ARNm codant pour la transposase Tol2 et des plasmides donneurs de transposons. Les plasmides comprennent un promoteur de poisson zèbre omniprésent et un gène codant pour une protéine fluorescente flanqué de bras de transposon Tol2.

Injectez soigneusement la solution de micro-injection dans le cytoplasme de l’embryon de poisson-zèbre. À l’intérieur de la cellule, les ARNm de la transposase Tol2 se transforment en protéines transposases de Tol2 et sont activement transportés dans le noyau.

Les sites Tol2 sur le plasmide donneur comprennent des répétitions terminales inversées spécifiques, ou ITR, flanquant le gène rapporteur. Les ITR sont flanqués de courtes répétitions directes. Les protéines transposases reconnaissent et se lient aux sites ITR, formant une épingle à cheveux sur l’ADN flanquant. Les transposases clivent davantage la construction du transposon de l’ADN flanquant, le libérant du plasmide et laissant derrière elles de courtes répétitions directes.

Les transposases créent une cassure double brin décalée dans le génome de la cellule somatique et insèrent la construction du transposon dans le site du génome. Le remplissage des extrémités décalées par l’ADN polymérase suivi d’une ligature des entailles crée des répétitions courtes et directes.

La ligature provoque l’intégration stable de la construction du transposon dans le génome de la cellule somatique, et le promoteur facilite l’expression de la protéine fluorescente. Incuber les embryons injectés. Au cours du développement embryonnaire, les cellules somatiques donnent naissance à différents types de cellules et créent des poissons-zèbres transgéniques.