PCR numérique basée sur une puce dans un tube pour la quantification de variants nucléotidiques uniques

La réaction en chaîne par polymérase numérique (dPCR) est utile pour quantifier les variants mononucléotidiques (SNV), une mutation où la substitution d’un seul nucléotide à une position spécifique du génome crée deux variations nucléotidiques ou allèles.

Pour commencer la quantification à l’aide de la technique dPCR chip-in-a-tube, prélevez un échantillon d’ADN contenant des SNV - l’allèle mutant et l’allèle de type sauvage correspondant. Ajoutez un mélange contenant une enzyme d’ADN polymérase thermostable, des dNTP et des amorces.

Ensuite, ajoutez des sondes oligonucléotidiques spécifiques à l’allèle – marquées avec des rapporteurs de fluorescence de différentes couleurs pour distinguer les allèles – et une molécule de trempage. La proximité de l’extincteur avec le rapporteur supprime sa fluorescence.

Répartissez la solution dans les chambres de réaction d’une puce microfluidique. Chaque chambre contenant un allèle sert de récipient de réaction indépendant.

Placez le tube avec la puce à l’intérieur d’un thermocycleur et démarrez la réaction. À haute température, l’ADN double brin se dénature en simple brin. Abaisser la température de recuit des amorces et des sondes oligonucléotidiques dans leurs régions complémentaires.

À une température d’extension appropriée, l’ADN polymérase étend les amorces et clive la sonde. La distance par rapport à l'extincteur permet l'émission de fluorescence du journaliste.

Lisez les signaux de fluorescence de différentes couleurs et créez un tracé de position pour détecter les chambres contenant les allèles.

Pour déterminer la fréquence de l’allèle mutant – la fraction de l’allèle variant – calculez le rapport entre les chambres contenant l’allèle mutant et l’allèle de type sauvage.