Transfert de points quantitatif pour estimer les protéines cibles dans un lysat tissulaire

Le transfert de points quantitatif (QDB) est une technique utile pour quantifier la concentration de protéines cibles dans un échantillon. Une fois l’échantillon immobilisé sur une membrane polymère, les protéines peuvent être détectées par immunoblottage.

Pour commencer, prenez une plaque QDB - une plaque multi-puits avec une membrane de nitrocellulose fixée au fond de chaque puits. Ajoutez l’échantillon – un lysat tissulaire contenant la protéine cible – au centre de la membrane à l’intérieur du puits.

Laissez sécher l’échantillon. La protéine cible se lie à la membrane via des interactions non covalentes.

Ajoutez une solution de blocage. Les protéines de la solution se fixent aux sites non liés sur la membrane, empêchant la liaison non spécifique des réactifs de détection.

Ensuite, ajoutez une solution contenant des anticorps primaires qui se lient à la protéine cible dans l’échantillon. Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Ensuite, ajoutez une solution d’anticorps secondaire. Ces molécules – marquées avec une enzyme peroxydase – se lient aux anticorps primaires liés aux protéines. Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Enfin, ajoutez une solution contenant un substrat chimiluminescent et du peroxyde d’hydrogène. En utilisant du peroxyde d’hydrogène, la peroxydase liée aux anticorps oxyde le substrat et émet de la lumière. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez l’intensité de luminescence de l’échantillon.

Générer une courbe de luminescence standard à l’aide d’une dilution en série avec des concentrations connues de la protéine cible. Tracez la valeur de luminescence mesurée de l’échantillon sur la courbe pour déterminer la concentration protéique cible.