Transfert Western quantitatif pour estimer les niveaux d’expression des protéines

Le western blot quantitatif – une technique basée sur la normalisation des protéines totales – est utile pour quantifier les niveaux d’expression des protéines cibles.

Pour commencer, chargez du lysat tissulaire dans les puits d’un gel à gradient de polyacrylamide. Le lysat contient la protéine cible, ainsi que d’autres protéines cellulaires.

Faites fonctionner le gel à une tension appropriée pour la séparation électrophorétique des protéines de l’échantillon le long du gradient. Une fois terminé, placez le gel sur la membrane polymère d’une pile de transfert.

Appliquez un courant électrique pour transférer les protéines séparées sur la membrane. Ensuite, placez la membrane dans une coloration protéique totale fluorescente. Les molécules de colorant chargées dans la coloration se lient électrostatiquement à toutes les protéines de la membrane.

Ajoutez une solution de blocage. Les protéines de la solution se lient ainsi à la membrane. Empêcher la liaison non spécifique des réactifs de détection. Ajoutez un anticorps primaire se liant uniquement à la protéine cible. Ensuite, ajoutez un anticorps secondaire – marqué d’un fluorophore – qui se fixe à l’anticorps primaire.

Excissez l’échantillon avec un laser. Enregistrer la fluorescence émise par les molécules de colorant de la coloration protéique totale et les fluorophores liés aux anticorps à leurs longueurs d’onde correspondantes.

Pour calculer la valeur de charge protéique normalisée, divisez le signal protéique total de chaque voie par la valeur la plus élevée. Divisez le signal de la protéine cible par la valeur de charge normalisée correspondante pour déterminer l’expression relative de la protéine cible.